הדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת

התחל עם מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF) עם תא הדמיה מכוסה המכיל כיסוי זכוכית עם תאי נוירובלסטומה אנושיים דבוקים במאגר.

תאים אלה מבטאים פלואורופורים ספציפיים לקרומי שלפוחית סינפטית.

במצב אפיפלואורסצנטי, בחר תא להדמיה.

במצב TIRF, דרך המטרה, כוון לייזר לעבר הדגימה, המופיע כנקודה על הכיסוי.

כוונן את הזווית כך שתעלה על הזווית הקריטית בממשק בין כיסוי הזכוכית עם מקדם השבירה הגבוה לבין הדגימה עם מקדם השבירה התחתון, מה שגורם להשתקפות פנימית כוללת (TIR), הנראית כקו דק.

TIR מייצר גל חולף המעורר פלואורופורים על הממברנה הקרובה ביותר.

הקרינה הנפלטת נאספת על ידי המטרה ונלכדת על ידי מצלמה.

כוונון עדין לקבלת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה של קרום התא ליד הכיסוי.

מטב את הגדרות הרכישה כדי למזער את ההלבנה ולהגדיר את תדירות הדגימה.

התחל הדמיית TIRF כדי לדמיין שלפוחיות סינפטיות מאוחות.

במצב אפיפלואורסצנטי, התמקדו בכיסוי ובחרו תאים שעברו טרנספטציה הממוקמים במרכז החדר. תחת בקרת תוכנה, עבור לתאורת דשא במצב חי. כדי להגדיר את תצורת הדשא, בדוק את מיקום הקורה שיוצאת מהמטרה על מכסה המדגם. כאשר הקרן ממוקמת במרכז עדשת האובייקט, נראה כתם במרכז כיסוי דגימת הדשא, והתא מצולם במצב אפיפלואורסצנטי.

כדי להגיע לזווית הקריטית, הזז את הנקודה הממוקדת בכיוון Y באמצעות בורג כוונון הזווית במחוון הדשא. כאשר הקרן מתכנסת על מישור הדגימה בזווית גדולה מהזווית הקריטית, הנקודה נעלמת וקו ישר, דק וממוקד ניכר באמצע מכסה הדגימה. כדי לכוונן את זווית הדשא, השתמש בדגימת תא.

צפו בתמונת הקרינה בסרטון. בשלב זה, תמונה דמוית אפיפלואורסצנציה עדיין נראית לעין. הזז בעדינות את הבורג עד להשגת מצב דשא. כאן, רק מישור אופטי אחד של התא נמצא בפוקוס, וכתוצאה מכך תמונה שטוחה עם ניגודיות גבוהה.

כדי לבצע הדמיה לדוגמה, הגדר את ניסוי ה-Time lapse של ערוץ יחיד. זמני החשיפה המתאימים הם בין 40 ל-80 אלפיות השנייה. רכוש תמונות בתדר דגימה של 1 או 2 הרץ.