ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה
7 באפריל 2012
שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.
ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) מציעה מספר יתרונות מובהקים למחקרי מטבוליקה סביבתית, אך היא בעלת רגישות נמוכה יחסית בהליך זה. במאמר זה מדווחת שיטת סינון לריכוז ולהפקה של מטבוליטים מקהילה שלמה ממערכות פלנקטוניות המתאימה ל-NMR. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנה מיוחדת של מסננים לאיסוף דגימות, באמצעות הסרה של חומרים הניתנים להפקה.
השלב השני של הפרוצדורה הוא סינון הדגימה, בין אם היא טבעית ובין אם ניסיונית, על גבי המסננים. השלב השלישי של הפרוצורה הוא ליפוי של חומר הדגימה ומיצוי מטבוליטים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ניתוח הדגימות באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית ואינטגרציה של הנתונים בהתאם.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים מטבוליים בדגימות טבעיות לאורך מדרגות סביבתיות או כמענה למניפולציות ניסיוניות באמצעות גישות של מטבולימיקה ו-transams. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סנטריפוגציה, הוא שניתן לדגום את הקהילה כולה, וניתן להשתמש בנפחי דגימה גדולים יותר עבור דגימות בעלות צפיפות נמוכה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של תערובות מתכות סביבתיות, כגון האופן שבו גדילה של מיקרואורגניזמים מגיבה לשינויים סביבתיים. הדגמת הפרוצדורה תתבצע במעבדה שלי.
התחילו את הפרוטוקול על ידי הנחת מסננים בתוך כלי Pyrex נקי בנפח 500 מיליליטר באמצעות פינצטה. כסו את המסנן במים מזוקקים לשטיפה מקדימה וסובבו היטב כדי למנוע מהמסננים להידבק זה לזה. שפכו את המים וחזרו על השטיפה פעמיים.
לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו 300 milliliters של Milli Q water לכלי הביקר והעבירו את המסננים באוטוקלאב. לאחר שהמסננים עברו עיקור באוטוקלאב, שפכו את ה-Milli Q water ושטפו את המסננים שלוש פעמים כפי שבוצע קודם לכן, אך השתמשו ב-Milli Q water.
הניחו את המסננים הבודדים על משטח נקי ויבש, כגון נייר אלומיניום, באמצעות פינצטה, וייבשו אותם בטמפרטורה סבירה. לדוגמה, ב-37 מעלות או באמצעות ייבוש באוויר; המסננים מוכנים כעת לשימוש להדגמת פרוטוקול זה. נעשה שימוש במניפולד סינון בעל שלושה מקומות מפלדת אל חלון של Millipore, המצויד בעמודי סינון למיקרו-אנליזה בקוטר 25 מילימטר עם תמיכות זכוכית ובמשאבה מכנית, תוך שימוש בטכניקה אספטית.
הניחו מסנן בודד בקוטר 25 מילימטר על בסיס עמודת הסינון. הרכיבו את העמודה והדקו את המכשיר יחד. טענו לעמודה 15 מיליליטר של דגימה שהושגה ממיקרוקוסם עשיר בחומרי הזנה.
פתחו את שסתום העצירה במגוף הסינון והפעילו את משאבת הסינון תחת לחץ עדין כדי למזער את שבירת התאים. עבור דגימות בעלות צפיפות נמוכה, ייתכן שיהיה צורך בהוספות עקביות של מים. יש להקפיד שהמסנן לא יתייבש למשך פרק זמן ממושך בין הוספות המים.
שנית, ניתן להפחית מלחים פאראמגנטיים שיוריים מדגימות ימיות ולבצע שטיפה אופציונלית במים מתוקים. לאחר סיום הסינון, כבה את המשאבה והשאר את השסתום פתוח כדי שישמר לחץ שלילי תחת המסנן. הסר ביד אחת את התסמיך ואת עמודת הסינון.
השתמשו בפינצטה נקייה כדי לתפוס את המסנן. קפלו את המסנן על עצמו אך הימנעו מיצירת קמט באמצעות היד השנייה. השתמשו בשפת מבחנה מיקרו-צנטריפוגה סטרילית של 2 mL כדי להחזיק את המסנן למטה.
הניחו את המסנן לתוך מבחנה של 2 mL ושחררו אותו כך שייפתח כאשר צד הדגימה פונה פנימה. הקפיאו מיד בחנקן נוזלי על מנת למ抽出 את המטבוליטים המסיסים במים. ראשית, לייבשו את הדגימות בליופיליזציה למשך לילה או ללפחות 10 שעות; לאחר הלייופיליזציה, הוסיפו כדור ריסוק מפלדת אל חלון לכל מבחנה.
הוסיפו 750 µL של בופר פוספט פוטסיום סטנדרטי ודאוטריום אוקסיד עם סטנדרט DSS. בצעו סוניקציה לדגימות במשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C במקלבת אולטרסונית כדי להסיר את חומר התאים מהמסנן. הוציאו את המסננים באמצעות פינצטה נקייה.
שבשו את התאים באמצעות דחליל (mill crusher) במהירות של 1600 RPM למשך חמש דקות. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 65 °C. נערה את הדגימות על נערה מעבדתית (benchtop shaker) למשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, הוציאו את המעך המתכתי באמצעות פינצטה נקייה. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,000 G למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והעבירו אותו ישירות לנבובת NMR לצורך ספקטרוסקופיית NMR.
העמיסו את הדגימה לספקטרומטר ה-NMR כאן. הדגימות נסרקות בספקטרומטר Bruker DRX 500 המצויד ב-probe מסוג TXI עם גרדיאנט תלת-צירי הפועל ב-298 Kelvin. בצעו Lock, tune ו-shim למגנט.
השיגו ספקטרומיה NMR של פרוטונים במימד אחד (1D) באמצעות ממשק top spin ובשיטות שתוארו קודם לכן, או השתמשו בתוכנות ממשק אחרות לספקטרומטר לפי הצורך. במקרה זה, הספקטרה נרכשו עם דיכוי של אותי מים שיוריים באמצעות רצף פולסים מסוג Watergate עם זמן חזרה של 1.2 שניות. בדוגמה הנוכחית, נאספו 128 טרנסיאנטים עבור כל דגימה.
העבירו את ספריות נתוני ה-NMR למחשב אישי המותקנת בו תוכנת NMR pipe. עבדו את הנתונים הגולמיים, הגדירו את אות ה-DSS כנקודת ייחוס של אפס PPM, ולאחר מכן בצעו פאזירה (phasing) ידנית של הספקטרומים. דגמו את הנתונים הספקטרליים באמצעות bin here בעזרת חבילת FT two B הזמינה לציבור מאתר המסחר האלקטרוני.
ניתן להשתמש בכלי תוכנה נוספים, כגון RNMR או Atomics, לצורך bin.Bin. ניתן לנרמל את הנתונים לפי האות הכולל או לפי אות ה-DSS כדי להראות שינויים פרופורציונליים באות בין דגימות. ניתן כעת להשתמש בנתוני הפלט לניתוח סטטיסטי המשכי, כגון ניתוח רכיבים ראשיים או PCA, באמצעות חבילות תוכנה חופשיות כמו R המוצגת כאן.
להלן דוגמה לספקטרום NMR של פרוטונים שהתקבל באמצעות הפרוצדורה שהודגמה. הספקטרה הן משתי נקודות זמן בניסוי מיקרוקוסמוס ומראות הבדלים ברורים הנובעים מפעילות מטבולית של אצות. הספקטרום של היום הרביעי מראה שפע ניכר של שיאים, במיוחד בטווח שבין 3:00 ל-4:00 PM, בהשוואה לדגימה מהיום הראשון.
ניתן לייחס שיאים אלו לסוכרים שיוצרו על ידי דיאטומאות בפריחה בתוך המיקרוקוסם. בניסוי דומה, נעשה שימוש בתרשים פיזור של ציוני PCA שהופק מתוכנת bend ב-Mr.Spectra, המציג את שני הרכיבים הראשיים הראשונים, כדי להשוות את הצמיחה של קהילות פלנקטון טבעיות במי ים מלאכותיים ובמי ים טבעיים. גישה סטטיסטית זו מצמצמת נתונים רב-ממדיים לפורמט פשוט יותר; במקרה זה, דו-ממדי, החושף פשוט את המבנה בנקודות הנתונים הבסיסיות הסמוכות.
כל אחד מהצירים או שניהם דומים יותר כאן. ניתן לראות הבדלים מטבוליים ברורים בין שני הטיפולים. הנתונים מניסוי זה שימשו לביצוע ניתוח מולטי-אומיקה (multi omics).
שילוב של NMR עם נתונים גנומיים של הרכב קהיליה המבוסס על אלקטרופורזה של ג'ל עם מדרג דנטורציה של גנים של 18 S ו-16 S-R-R-N-A מראה גם דפוסים מובחנים של קהילות מיקרוביאליות בין מיקרוקוסמוים של מי מלח טבעיים ומלאכותיים. התאמה כזו בין המטבולום לגנום ממערכות טבעיות מדגימה את התועלת של גישה זו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בטכניקה מתאימה כדי למזער את הזיהום בעקבות ביצוע הפרוצדורה.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח יצירה ברמות אומיקה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו המיקרוביום נמצא במתאם עם מטבוליטים מסוימים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למיצוי מטבוליטים מקהילות פלנקטון מיקרוביאליות באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR). ההליך כולל סינון למסננים שהוכנו במיוחד, ליופיליזציה, ומיצוי עוקב של מטבוליטים מסיסים במים, דבר המקל על ביצוע מחקרי מטבולומיקה סביבתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מטבוליזום סביבתי
- אקולוגיה מיקרוביאלית
- ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית
רקע
- מיצוי מטבוליטים הוא קריטי לחקר של קהילות מיקרוביאליות.
- ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית מספקת תובנות לגבי הרכב המטבוליטים.
- שיטות סינון משפרות את ריכוז המטבוליטים מדגימות.
- ניתן להחיל גישה זו הן על מערכות מיקרוביאליות טבעיות והן על מערכות מיקרוביאליות ניסיוניות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למיצוי מטבוליטים מקהילות פלנקטון מיקרוביאליות.
- מתן אפשרות לניתוח מפורט של מטבוליטים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR.
- קידום התחום של מטבוליאומיקה סביבתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מסננים להסרה של חומרים נשולפים (extractables).
- סינון של דגימות מיקרוביאליות על גבי מסננים שהוכנו.
- ליופיליזציה של חומר הדגימה.
- מיצוי של מטבוליטים מסיסי-מים לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מרכזת ומחלצת מטבוליטים מקהילות מיקרוביאליות באופן מוצלח.
- ספקטרוסקופיית NMR מנתחת ביעילות את המטבוליטים שחולצו.
- הגישה ישימה הן לדגימות טבעיות והן לדגימות ניסיוניות.
- התוצאות תורמות להבנת הפרופילים המטבוליים של קהילות מיקרוביאליות.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את חקר המטבולומיקה המיקרוביאלית.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים במטבולומיקה סביבתית.
- יישומים נוספים עשויים להוביל לתובנות לגבי אינטראקציות ותפקודי מיקרובים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מטבולינומיקה סביבתית ניצבת בפני אתגרי רגישות בעת חקר קהילות מיקרוביאליות בעלות דחיסות נמוכה, מה שמגביל את ישימות ה-NMR בתהליכי גילוי מוקדמים. שיטה זו לריכוז מבוססת סינון מאפשרת מיפוי מטבוליים לא מכוון (untargeted) ממערכות פלנקטוניות, ובכך תומכת ביצירת היפותזות באקולוגיה מיקרוביאלית ובבחינה של סמנים ביולוגיים תרגומיים. על ידי שיפור יכולת הגילוי של מטבוליטים, הגישה מגבירה את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור יישומים של בריאות סביבתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי לכידה של שינויים במטבוליטים של הקהילה כולה בתגובה לגירויים סביבתיים.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת מסננים וליזיס להפחתת השונות הטכנית במיצוי מטבוליטים.
- ערך אסטרטגי: תומך במיון פורטפוליו באמצעות זיהוי הדיר שניתן לשחזור של ביומרקרים מטבוליים הקשורים למסלולי עקה או הסתגלות מיקרוביאלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת NMR המשכית על ידי ריכוז של מטבוליטים מסיסי מים מדגימות בעלות צפיפות נמוכה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ליופיליזציה ומיצוי בבफर פוטסיום פוספית, דבר המשפר את השחזוריות בין הרצות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את המוכנות לסריקה עבור מחקרי השפעת תרכובות במודלים של תרביות מיקרוביאליות משולבות או קהילות סינתטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על מידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לקביעת מתאם בין המטבולום לגנום במיקרוקוסמוסים של מי ים טבעיים ומלאכותיים.
- ערך תפעולי: תומך בהמשכיות תרגומית באמצעות אינטגרציית מולטי-אומיקה, המקשרת בין ספקטרום מטבוליטים לנתוני הרכב גנומי של הקהילה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות זיהוי חתימות מטבוליות עקביות לאורך מדרגים סביבתיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות במערכות מיקרוביאליות, ממשיכה לסריקה באמצעות מיצוי מטבוליטים סטנדרטי, ותומכת במחקר תרגומי באמצעות סנכרון נתוני multi-omics.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי שינויים במטבוליטים בקהילות פלנקטוניות לאורך מניפולציות ניסוייות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה ופלט כמותי באמצעות ריכוזי מטבוליטים הניתנים לגילוי ב-NMR לאחר סינון וליזיס.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים ספקטרליים המתאימים לניתוח סטטיסטי כגון PCA, המאפשר השוואת תנאים וזיהוי תבניות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות התאמה בין המטבלום לגנום במערכות טבעיות, ובכך תומך בסנכרון של ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת סינון ומיצוי שניתנת לשימוש חוזר ותשבילה למודלים מיקרוביאליים מימיים מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתגובות של מטבוליטים מיקרוביאליים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות טיפול מקדים של מסננים ושלבי ליזיס אוטומטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת פרופילים שחזירים של מטבוליטים לצורך הפחתת סיכונים ביולוגיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים באמצעות שינויים ניתנים לגילוי במטבוליטים הקשורים לצמיחה מיקרוביאלית או לפנוטיפים של עקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות סינון, ליופיליזציה והכנת דגימות ל-NMR כדי למנוע זיהום ולהבטיח התאוששות של מטבוליטים.
- תלוי בגישה לספקטרומטרים של NMR בעלי יכולות דיכוי מים ובתוכנה לעיבוד ספקטרלי ובינינג (binning).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הטיפול במסננים, תמיסות מיצוי ופרוטוקולים לנורמליזציה של נתונים לצורך קבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה לצפיפויות דגימה משתנות, דבר המחייב סינונים רצופים או התאמות נפח עבור קהילות בעלות שכיחות נמוכה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הפרעה של מלחים פאראמגנטיים שיוריים בדגימות ימיות, דבר הדורש שלבי שטיפה אופציונליים לשמירה על איכות הספקטרום.
