יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח מצע דו-ממדי לבקרת ספיגת החלבון וצמיחת התאים. זה מושג על ידי שימוש בפוטוליתוגרפיה לייצור מאסטר מעוצב, המשמש לייצור חותמת A-P-D-M-S להדפסת מיקרו-מגע. כשלב שני, מכינים את מצע הזהב המעוצב, הכולל הדפסת מיקרו מגע כדי לייצר דפוס עם אזורים הסופגים ומתנגדים לחלבון.

לאחר מכן מוסיפים חלבון ותאים למצע על מנת לדמיין את הדפוס והמחקר. מתקבלות תוצאות צמיחה והתנהגות תאיות המראות כליאה טובה של חלבון ותאים על מצעי דפוס אלה בהתבסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניגודיות פנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון הדפסת MicroCon של חלבונים, הוא שהחד-שכבתי המסתיימת בגליקול מתנגדת לחלבון לא ספציפי ולספיגת תאים ברקע התבנית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לבצע אופטימיזציה של טכניקת הטבעה נכונה עבור כל דפוס מודפס. כדי להתחיל בהכנת מרכז המאסטר המעוצב, פרוסת הסיליקון על קודן הסיבוב, ובמהלך השלב הראשוני של תוכנית הסחיטה הדו-מחזורית, שטפו את הוופל באצטון. במהלך השלב השני של תוכנית הסחיטה, האצטון יתאדה וישאיר פרוסה נקייה ויבשה בתחילת הסחיטה, ימרח פוטורזיסט על הוופל ולאחר מכן יסתובב בתנאים שתוארו קודם לכן.

אופים רך את הוופל המצופה ב-110 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות באמצעות פלטה חמה בעלת אחידות גבוהה. דפוס התמונה הבא. התצלום מתנגד לפרוסות מצופות באמצעות מערכת יישור מסכה ומסכה מתאימה.

ראשית, הנח את המצע על משאית הוואקום של מיישר המסכה. לאחר מכן הכנס את המסכה למגש המחזיק והפעל את הוואקום כדי להחזיק את המסכה במקומה כדי לאשר מגע טוב בין המסכה למצע. הרם את המצע עד שהוא פוגש את המסכה.

השתמש באופטיקה של קשתיות היישור כדי לאשר שנוצר מגע טוב. לבסוף, הפעל את המנורה כדי לחשוף את המצע לאור UV דרך המסכה הליתוגרפית. יש לפתח את הוופל המעוצב במפתח למשך דקה ו-45 שניות בערבול עדין.

יש לשטוף היטב בדרגת מוליכים למחצה, מים נטולי יונים ולייבש בזרם של פיתוח דפוס בדיקת גז חנקן באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן UV. התחל הליך זה על ידי הכנת מקשה שרף 10 לאחד לפי משקל. תערובת של סיגר 180 2 לגמרי.

כסו את הוופל בדוגמת הצילום בתערובת בצלחת פטרי חד פעמית בוואקום ייבוש דגה, המאסטר המכוסה ב-PDMS עד שלא נראות בועות. לאחר שווידאתם שהמאסטר נמצא בתחתית המנה, הניחו לחותמת להתרפא בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. כאשר חותמת ה-PDMS נרפאת, חתוך את החותמת מהמאסטר וחתוך אותה לגודל המתאים.

אחסן את ה-stamp במיכל מכוסה עם הצד כלפי מעלה כדי להגן עליו מפני אבק ופסולת. כדי להכין את המצעים לתצהיר מתכת, יש לטפל תחילה בהחלקות כיסוי זכוכית עגולות עם פלזמת חמצן למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את הכיסוי מחליק פעמיים במים נטולי יונים, ייבוש עם זרם גז החנקן בין השטיפות, לאחר שטיפה במים, שטפו פעמיים באתנול, ייבשו שוב בזרם גז החנקן בין השטיפות.

באמצעות מערכת שיקוע קרן אלקטרונים בכיס מרובה, הפקידו 50 אנגסטרום טיטניום ואחריו 150 אנגסטרום זהב. אל תפגע במאייד בין שקיעת שכבת הטיטניום לשכבת הזהב. שטפו את חותמת ה-PDMS באתנול וייבשו היטב.

בעזרת גז חנקן, מרחו תמיסת הטבעה על החותמת טיפה עד לציפוי מלא. יבש את החותמת היטב בגז חנקן. הדפסת המיקרו מגע של קובץ HEXA Decane תלויה בתכונות של חותמת ה-PDMS והיא אחד ההיבטים הקשים ביותר בהליך זה.

הטבעה מוצלחת דורשת פיתוח טכניקה טובה המפעילה לחץ אחיד. במהלך ההטבעה. להדפסת מיקרו-מגע קונבנציונלית באוויר, לחץ בעדינות את החותמת על מצע הזהב ואפשר לשכבה החד-שכבתית להיווצר למשך 15 שניות.

לחלופין, עבור דפוסים המורכבים מתכונות קטנות מאוד ויחסי גובה-רוחב גבוהים, הנח את מצע הזהב בצלחת פטרי המכילה 18.2 מגה אום מים נטולי יונים, וודא שהמצע שקוע. לאחר מכן לחץ בעדינות את החותמת על מצע הזהב ואפשר למונו להיווצר שכבה למשך 15 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את המצע המוטבע פעמיים בייבוש אתנול בגז חנקן.

לאחר כל שטיפה מניחים את המצע בצלחת פטרי ומכסים את המצע בתמיסת מילוי אחורית. אוטמים את המנה בפראם כדי למנוע אידוי. אפשר לשכבת הרקע להיווצר בחושך למשך 12 עד 14 שעות.

לבסוף, הסר את החלקת הכיסוי המעוצבת מתמיסת המילוי האחורית ושטוף פעמיים עם ייבוש אתנול בגז חנקן לאחר כל שטיפה. כדי למרוח חלבון על תלוש הכיסוי המעוצב, הנח את פתק הכיסוי בצלחת פטרי קטנה או בתא תרבית תאים מכסים ב-500 מיקרוליטר עד מיליליטר אחד של מלח מאגר דלקוס פוספט. ה-DPBS חייב לכסות לחלוטין את המצע במהלך הדגירה של החלבון.

כדי להבטיח כיסוי חלבון אחיד, הוסף תמיסה מרוכזת של חלבון ל-DPBS וערבב את התמיסה על ידי פיפטינג מספר פעמים. דגרו את תערובת החלבון עם המצע בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשטוף היטב את המצע עם DPBS כדי להסיר חלבון לא קשור, תוך הקפדה לא לייבש את המצע או להעביר אותו דרך ממשק מי האוויר.

לאחר שלוש שטיפות יש לשאוב את ה-DPBS. לאחר מכן הוסף כ-500 מיקרוליטר של מצע גידול תאים שלם כדי לשמור על מצע רטוב. החלף את אמצעי הגידול המשמשים לשטיפת המצע.

עם מדיה טרייה, המצע מוכן כעת לציפוי בתאים. בדרך כלל 30 עד 200 תאים למילימטר רבוע מצופים על המצע. תמונה זו מציגה חותמת A-P-D-M-S המומחשת תחת מיקרוסקופ על ידי הנחת תכונת החותמת כלפי מטה על פתק כיסוי זכוכית, סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.

הטבעה נכונה מביאה לדפוס חלבון חד וברור שניתן לדמיין על ידי יישום חלבון בעל תווית פלואורסצנטית כגון LOR 6 47 המסומן פיברונקטין. הכליאה של תאי chk one לתבנית החלבון מוצגת כאן. פסי קנה המידה הם 100 מיקרומטר בתמונות אלה.

לחלופין, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את דפוס החלבון לאחר קיבוע SU. כאן, LOR שלושה 50 נוגדן מצומד נגד למינציה משמש להמחשת למינציה מעוצבת שנזרעה עם נוירונים היפוקמפיים של עכבר E 18 המוצגים בארבעה ימים במבחנה E 18 נוירונים היפוקמפיים של עכבר צבועים בגשש MIT אדום חמש 80 מראים שצמיחת התאים מוגבלת היטב לדפוס החלבון. בעוד שטכניקה זו ניתנת לשליטה בקלות, עלולות להתעורר מספר בעיות נפוצות כפי שמומחשות על ידי תכשירי מצע דפוס אלה המומחשים על ידי ספיגת פיברונקטין מצומד LOR 6 47.

יישום חלבון ללא ערבוב מספיק של תמיסת החלבון המרוכזת ב-DPBS עלול להוביל לדפוסי חלבון לא אחידים. הטבעה לא נכונה עלולה להוביל להעברת דפוס חלקית או לקריסת חותמת. בנוסף, חשיפת מצע הדפוס המכיל חלבון נספג לאוויר עלולה לשבש את החד-שכבתי ולגרום לירידה בהתנגדות.

ברקע, דפוס שקוע יכול לייצר דפוסים עם תכונות קטנות שקשה להדפיס על ידי הדפסת מיקרו מגע קונבנציונלית ואוויר. שתי תמונות אלה מציגות אזורים שונים של אותה תבנית המודפסים עם אותה חותמת PDMS באוויר או קווי תמיכה במים נטולי יונים מוצגים בתמונה משמאל כדי להדגים שרק התכונות הקטנות של התבנית לא הצליחו להדפיס בהצלחה. מוטות קנה מידה הם 20 מיקרומטר לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 18 עד 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מצע תבנית. הפקת חותמת A-P-D-M-S. השתמש בהדפסת מיקרו מגע כדי להכין מצע זהב דפוס ולדמיין דפוס זה באמצעות חלבון ותאים.