מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר ניתוח מתילציה של DNA של דינוקלאוטידי CPG באמצעות ריצוף גנומי של DNA שעבר המרה לסולפיט. הדבר משיג תחילה על ידי דנטורציה של ה-DNA בעל הגדילים הכפולים, כדי שניתן יהיה לבצע את תגובת ההמרה לביסולפיט. השלב השני הוא המרה של כל הציטוזינים שאינם מתילטורים ב-DNA הגנומי לאורציל באמצעות דהימינציה של ביסולפיט.

תגובה זו כוללת שלושה שלבים. השלב הראשון הוא סולפציה של שארית הציטוזין על ידי הוספת B sulfite לקשר הכפול בין הפחמנים החמישי והשישי. שנית, דהימינציה הידרולית של הציטוזין על ידי נגזרת סולפיט מייצרת SSL על ידי נגזרת סולפיט, ושלישית, הסרת קבוצת הסולפונט על ידי טיפול בבסיס מביאה לשארית SSL.

בשלב הבא, האזור המטרה מוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים להמרה של ביסולפיט והגברה באמצעות PCR. השלב הסופי הוא שיבוט וריצוף של תוצר ה-PCR כדי להשיג רזולוציה של נוקלאוטיד בודד עבור מתילציה לאורך מולקולת ה-DNA. בסופו של דבר, התוצאות מראות מתילציית DNA של דינוקלאוטידי CPG ב-DNA גנומי, תוך ניצול הרגישות המוגברת של ציטוזין לעומת חמשה-מתיל-ציטוזין לדה-אמינציה של ביסולפיט בתנאים חומציים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזה של דם בשיטת Southern, הוא שהיא מאפשרת רזולוציה של נוקליאוטיד בודד עבור מתילציה של DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון תפקידה של מתילציית DNA במחלות אנושיות כמו סרטן. כדי להכין דגימות DNA להמרה באמצעות ביסולפיט, יש להדגיר תחילה 2 µg של DNA גנומי עם ביסולפיט, באפר לליסיס של DNA, עד לנפח כולל של 18 µL, למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, דנטורו את ה-DNA הגנומי על ידי הוספת 2 µL של נתרן הידרוקסיד 3 M שהוכן טרי, עד לריכוז סופי של 0.3 M. דגרו את הדגימות בבן-מריחא בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות, ולאחר מכן דגרו אותן בטמפרטורה של 90 °C למשך שתי דקות. מיד לאחר מכן, העבירו את המבחנות לקרח למשך חמש דקות, וסבבו אותן בצנטריפוגה למשך 10 שניות ב-10,000 Gs כדי להבטיח שה-DNA נמצא בתחתית המבחנה; דגימות ה-DNA הדנטוריות מוכנות כעת לדה-אמינציה של B cell fight, שתוצג בשלב הבא.

לפני תגובות הסולפציה והדה-אמינציה ההידרוליטית, הכין תמיסות טריות של quinol בריכוז 10 millimolar ותמיסת sodium metabisulfite רוויה ב-pH 5.0. מכיוון שתמיסת ה-sodium metabisulfite היא תמיסה רוויה, ייתכן שגשמים קטנים יישארו ללא המסה. הוסף 208 microliters של sodium metabisulfite ו-12 microliters של quinol ל-20 microliters של DNA דנטורטי, לנפח סופי של 240 microliters.

ערבבו את המבחנות במיקסר (vortex) וסבבו בצנטריפוגה למשך 10 שניות כדי להבטיח שכל הטיפות נמצאות בתחתית המבחנה. כסו את הדגימות בשכבת שמן מינרלי. דגרו את הדגימות בבן-מריא בטמפרטורה של 55 °C למשך ארבע עד 16 שעות, בהתאם לכמות ולאיכות ה-DNA המיועד להמרה.

חשוב שהמרת הביסולפיט תתבצע בחשכה כדי למנוע חמצון. בסיום זמן הדגירה המתאים, סובבו את המבחנות קצרות במיקרו-צנטריפוגה כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית המבחנה. לאחר מכן, שאבו בזהירות את תמיסת ה-DNA מתחתית המבחנה, מבלי לשאוב מהשמן המינרלי.

עבור השלבים הבאים, המעבדה שלנו משתמשת במערכת ה-promega wizard DNA cleanup. הוסיפו מיליליטר אחד של שרף לדגימות ה-DNA, הפכו את המבחנה כדי לערבב, ולאחר מכן העבירו את התמיסה בעזרת פיפט לסירנגה המחוברת לעמודת התפסלה (desalting column). לבסוף, כדי להסיר יוני ביסולפיט חופשיים, העבירו את ה-DNA שעבר טיפול בביסולפיט דרך עמודת התפסלה והמיסו ב-50 µL של מי Milli Q.

השלב הבא הוא הסרת קבוצת הביסולפיט מטבעת הערציל באמצעות דסלינציה (הסרת מלחים). כדי לבצע זאת, הוסף 5.5 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 3 M שהוכן טרי לכל דגימה של DNA שעברה טיפול בביסולפיט, כדי להגיע לריכוז סופי של 0.3 M. לאחר מכן, הדגר את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.

סבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך זמן קצר ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של TRNA לכל דגימה. נטרלו את התמיסה על ידי הוספת ammonium acetate עד לריכוז סופי של 3 M. לאחר מכן, בצעו שקיעה של ה-DNA באמצעות אתנול.

הוסף 330 microliters של 100% ethanol קר מאוד, וערבב היטב על ידי היפוך. השאר בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך שעה אחת או למשך הלילה, ולאחר מכן סבב במערך צנטריפוגה ב-14,000 GS למשך 15 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius. לאחר מכן, הסר את כל שאריות הנוזל העליון (supernatant) וייבש באוויר את ה-DNA המשקע למשך כ-20 דקות.

לאחר ייבוש באוויר, כמעט בלתי ניתן לראות את המשקע; השביחו את משקע ה-DNA ב-50 µL של 0.1 XTE או מים והשאירו בטמפרטורת החדר למשך כשעתיים. במהלך זמן זה, ערבבו מדי פעם את המבחנות ב-vortex כדי להבטיח שה-DNA התמוסס, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה מהירה. ברגע שה-DNA מומס, ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 °C למשך שנה עד 10 שנים, בהתאם לכמות ואיכות ה-DNA, או להשתמש בו באופן מיידי. עבור הגברה ב-PCR, אופטימיזציה של הפריימרים היא ההיבט המורכב ביותר של פרוצדורה זו.

לפיכך, להלן הנחיות המסייעות להבטחת הצלחת תכנון הפריימרים. כדי להמחיש הנחיות אלו, רצף המטרה הומר באמצעות סולפיט, כך שכאשר הוא כתוב, ציטוזינים שהומרו מופיעים כ-Ts כחולים ואתרי CpG שלא הומרו מופיעים כ-cgs אדומים. הפריימרים צריכים להיות באורך של 24 עד 30 זוגות בסיסים כדי להבטיח ספציפיות. לפריימרים צריכה להיות טמפרטורת התמססות (TM) חזויה דומה מעל 50 °C, ושאינה שונה ביותר ממעלה אחת עד שתי מעלות צלזיוס.

הפריימרים צריכים להכיל כמות של כ-25% בסיסי C ו-T על מנת להבטיח ספציפיות של ההמרה. הבסיס הסופי בקצה ה-3' צריך להיות C או T כדי להבטיח הגברה של DNA שהומר. יש להימנע מרצפי CpG בדינוקלאוטידים בתוך רצף הפריימר כדי למנוע הטיה פוטנציאלית כלפי תבניות מתילציה, לא-מתילציה או תבניות שלא הומרו. עם זאת, אם הדבר בלתי נמנע, יש להחליף את הציטוזין באתר ה-CpG ב-Y כדי לסייע בהבטחת הגברה בלתי מוטה של DNA שהומר.

לבסוף, תכננו סטים של פריימרים מקננים (nested) או חצי-מקננים כדי להבטיח את הספציפיות או הרגישות של תגובת ה-PCR במידת הצורך. הכינו תערובות תגובה להגברה ב-PCR במנות של 25 µL לצורך אופטימיזציה. כל תגובה מכילה DNA גנומי שהומר על ידי סולפיט, פריימרים DPS, מגנזיום כלוריד, פוטסיום כלוריד, tris hydrochloride pH 8.3 ו-polymerase כדי לבחון הטיות הגברה של חומר מתילated או לא מתילated.

השתמשו בדגימת ביקורת המכילה 50% DNA מתילated ו-50% DNA שאינו מתילated, אשר עברה המרה מלאה באמצעות ביסולפיט, כדי לבחון הגברה פרופורציונלית ב-PCR עם המרת ביסולפיט. השתמשו בפריימרים ספציפיים ובתערובת תגובת PCR בטרמוסייקラー עם גרדיאנט טמפרטורה; הגדירו את התגובה בגרדיאנט של פלוס או מינוס 3 °C מטמפרטורת ההיתוך (TM) של הפריימר על פני 8 עד 10 מבחנות. ערבלו את המבחנות ב-vortex וסובבו אותן קצרות במיקרו-צנטריפוגה לפני השמתן בטרמוסייקラー. איור זה מציג ג'ל אגרוז עם פרופיל הגברת PCR בגרדיאנט טמפרטורה מתערובת של 50% DNA מתילated ו-DNA שאינו מתילated.

האמפליקונים של ה-PCR והנתיבים המסומנים ב-T, נתיבים שני, חמישי ושמיני, טופלו באנזים הגבלה שיעכל רק DNA מתילציה. תנאי הגברה אופטימליים של PCR אמורים להגביר אמפליקונים מתילציה ולא-מתילציה באופן פרופורציונלי וללא הטיה, מה שיביא לכמות שווה של תוצרי PCR חתוכים ולא חתוכים, כפי שניתן לראות כאן. תנאי התרמוסייקלינג האופטימליים להגברה ללא הטיה הם ב-55.6 °C. ניתן לנתח המרה מלאה של DNA ביסולפיט באמצעות עיכול עם אנזים ספציפי לאתרי ציטוזין, שיעכל רק DNA שלא עבר המרה, נתיבים שלושה, שישי ותשיעי.

המרה מלאה של DNA באמצעות ביסולפיט מעידה כאן על היעדר DNA חתוך בכל שלושת הנתיבים, נתיבים שלושה, שישה ותשעה. תרשים התנתקות בזמן אמת זה מראה פרופורציה שווה של DNA מתילתי ובלתי מתילתי (קו אדום-כתום, תערובת של 50 50) בהשוואה להגברה של DNA מתילתי באופן מלא (קו ורוד, m) ו-DNA בלתי מתילתי (קו ירוק, U), המתנתקים ב-82.9 °C וב-86.9 °C בהתאמה. דבר זה מעיד כי אין הטיה בהגברה (amplification bias) המבוססת על הטמפרטורה שבה המולקולות השונות יתנתקו.

ניתן להנמיח את מקטעי ה-PCR שהתקבלו מהגברה של דגימות שעברו טיפול בביסולפיט באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ולאחר מכן לרצף אותם. מוצג כאן באופן ישיר סימולציית רצף משלוש שורות תאים שונות, כאשר אתרי CpG מודגשים בצהוב; שורת תאים X מראה מתילציה של 100% בכל שלושת אתרי ה-CpG, בעוד ששורות תאים Y ו-Z מראות דרגות מתילציה משתנות, כפי שנראה מהאותות החופפים של G ו-A המוצגים כאן. איור 4A הוא סימולציית רצף משלוש שורות תאים שונות, כאשר אתרי CpG מודגשים בצהוב.

לאחר ריצוף ישיר של שיבוטים בודדים, ניתן לטבל את מצב המתילציה של המולקולות הבודדות במפת ביסולפיט. כדי להמחיש את ההטרוגניות של המתילציה, צפיפות המתילציה באתר CpG בודד מוצגת בצבע אדום. במפת ביסולפיט מייצגת זו, מוצג ניתוח מתילציה כמותי בעל תפוקה גבוהה של דגימה.

שימוש בטכנולוגיית sequenome epi typer יכול להפיק ספקטרום ספציפי התלוי בנוכחות של ציטוזינים מתילציה, כפי שמוצג בדוגמה זו באיור 5A. סיכום של היחסים בדגימה יכול להיות מושלך לאחר מכן בצורה של אפיגרמה באיור 5B. דוגמה זו מראה את אחוז מתילציית ה-DNA בכל אתר CPG עבור ארבעה קווי תאים שונים. לבסוף, ניתן להפיק סיכום של תרשים מתילציה באיור 5C מהאפיגרמה לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את מתילציית ה-DNA ואת תפקידה במחלות אנושיות.