מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח מתילציה של DNA של דינוקלאוטידים CPG על ידי ריצוף גנומי של DNA שהומר על ידי סולפיט. זה מושג על ידי דנטורציה ראשונה, ה-DNA הדו-גדילי, כך שתגובת ההמרה של הביסולפיט יכולה להתרחש. השלב השני הוא להמיר את כל הציטוזינים הלא מתיליים ב-DNA הגנומי לאורציל על ידי דה-אמינציה של דו סולפיט.

תגובה זו כוללת שלושה שלבים. הראשון הוא סולפטציה של שאריות הציטוזין על ידי הוספת B סולפיט לקשר הכפול של חמש שש. שנית, דה-אמינציה הידראולית של הציטוזין על ידי נגזרת סולפיט מייצרת SSL על ידי נגזרת סולפיט, ושלישית, הסרת קבוצת הסולפונאט על ידי טיפול אלקלי מביאה לשאריות SSL.

לאחר מכן, אזור היעד מוגבר על ידי פריימרים ספציפיים להמרת בי סולפיט והגברת PCR. השלב האחרון הוא שיבוט וריצוף של תוצר ה-PCR כדי לתת רזולוציית נוקלאוטיד בודדת למתילציה על פני מולקולת ה-DNA. בסופו של דבר, התוצאות מראות מתילציה של DNA של דינוקלאוטידים של CPG ב-DNA גנומי באמצעות ניצול הרגישות המוגברת של ציטוקין לעומת חמישה מתיל ציטוזין ל-bi-sulfate deamination בתנאים חומציים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ניתוח דם דרומי, הוא שהיא יכולה לאפשר רזולוציה של נוקלאוטיד בודד של מתילציה d. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון תפקיד מתילציה של DNA במחלות אנושיות כמו סרטן. כדי להכין דגימות DNA להמרת בי סולפיט, תחילה דגרו שני מיקרוגרם של DNA גנומי עם בי סולפיט, מאגר ליזה של DNA ונפח כולל של 18 מיקרוליטר למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן יש לפרק את הדנ"א הגנומי על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד טרי לריכוז סופי של 0.3 טוחנת. דגירה של הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט מים, ולאחר מכן דגירה ב-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. בגוש חום, הניחו מיד את הצינורות על קרח למשך חמש דקות, צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 שניות עד 10,000 Gs כדי להבטיח שה-DNA נמצא בתחתית הצינור, דגימות ה-DNA של דנטורציה מוכנות כעת ל-deamination של תאי B, שיודגמו בהמשך.

לפני תגובות הסולפטציה והדה-אמינציה ההידרוליטית, הכינו תמיסות טריות של 10 מילי-מולרי קווינול ומטא נתרן רווי על ידי pH סולפיט 5.0. מכיוון שמטא הנתרן על ידי סולפיט הוא תמיסה רוויה, גושים קטנים עשויים להישאר לא מומסים. הוסף את מטא הנתרן על ידי סולפיט 208 מיקרוליטר וקווינול 12 מיקרוליטר לדנטורציה DNA 20 מיקרוליטר בנפח סופי של 240 מיקרוליטר.

מערבל את הצינורות והצנטריפוגה למשך 10 שניות כדי להבטיח שכל הטיפות נמצאות בתחתית הצינור. שכבו את הדגימות בשמן מינרלי. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך ארבע עד 16 שעות, תלוי בכמות ובאיכות ה-DNA שיש להמיר.

חשוב שהמרת הביסולפיט תתרחש בחושך כדי למנוע חמצון. בתום זמן הדגירה המתאים, סובבו את הצינורות לזמן קצר במיקרו צנטריפוגה כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית הצינור. לאחר מכן הוציאו בזהירות את תמיסת הדנ"א מתחתית הצינור מבלי לספוג את השמן המינרלי.

לשלבים הבאים, המעבדה שלנו משתמשת במערכת ניקוי ה-DNA של אשף פרומגה. הוסף שרף מיליליטר אחד לדגימות ה-DNA, הפוך את הצינור לערבוב, ולאחר מכן פיפטה את התמיסה למזרק המחובר לעמוד התפלה. לבסוף, כדי להסיר יוני בי סולפיט חופשיים, העבירו את ה-DNA שטופל בבי סולפיט דרך עמודת ההתפלה ורמזו פנימה 50 מיקרוליטר של מים Milli Q.

השלב הבא הוא הסרת עליית הגג הביסולפיט מטבעת האורציל על ידי התפלה. כדי להשיג זאת, הוסף 5.5 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד טרי מולארי לכל דגימת DNA שטופלה בביסולפיט לריכוז סופי של 0.3 טוחנת. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

צנטריפוגה קצרה של הדגימות ולאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של TRNA לכל דגימה. לנטרל את התמיסה על ידי הוספת אמוניום אצטט לריכוז סופי של שלוש טוחנות. לאחר מכן, אתנול מזרז את ה- DNA.

מוסיפים קר כקרח, 100% אתנול 330 מיקרוליטר ומערבבים היטב על ידי היפוך. השאירו במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה עד לילה צנטריפוגה ב-14,000 GS למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את כל עקבות הסופרנטנט וייבש באוויר את ה- DNA המשקע למשך כ -20 דקות.

לאחר ייבוש באוויר, כמעט בלתי אפשרי לראות את הגלולה משהה את כדור ה-DNA ב-50 מיקרוליטר של 0.1 XTE או משאירים מים בטמפרטורת החדר למשך כשעתיים במהלך תקופה זו, מדי פעם, מערבולת את הצינורות כדי להבטיח שה-DNA מומס, ואחריו צנטריפוגה מהירה. לאחר המסת ה-DNA, ניתן לאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שנה עד 10 שנים, תלוי בכמות ובאיכות ה-DNA או להשתמש בו באופן מיידי. עבור הגברת PCR, אופטימיזציה של פריימר היא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה.

לכן, ההנחיות הבאות ניתנות כדי להבטיח את הצלחת תכנון הפריימר. כדי להמחיש את ההנחיות הללו, רצף היעד הומר על ידי סולפיט כך שכאשר ציטוזינים שהומרו בכתב מופיעים כ-Ts כחולים ואתרי CPG שלא הומרו מופיעים כ-cgs אדומים, פריימרים צריכים להיות באורך של 24 עד 30 זוגות בסיסים כדי להבטיח ספציפיות. פריימרים צריכים להיות בעלי מדיטציה טרנסנדנטלית חזויה דומה מעל 50 מעלות צלזיוס ולא להיות שונים ביותר ממעלה אחת עד שתיים צלזיוס.

פריימרים צריכים להכיל מספר בסיסים של כ-25%C ל-T כדי להבטיח ספציפיות המרה. יש להימנע מהבסיס הסופי ששלושת הקצה הראשוני צריך להיות C עד T כדי להבטיח הגברה של דינוקלאוטידים D-N-A-C-P-G שהומרו ברצף הפריימר כדי למנוע הטיה פוטנציאלית לכיוון תבניות מתיל ללא מתילציה או לא הומרות. עם זאת, אם זה בלתי נמנע, יש להחליף את הציטוזין באתר ה-CPG ב-Y כדי להבטיח הגברה בלתי משוחדת של DNA מומר.

לבסוף, תכנן ערכות פריימר מקוננות או מקוננות למחצה כדי להבטיח ספציפיות או רגישות של תגובת ה-PCR במידת הצורך. הכן תערובות תגובת הגברה של PCR ב-25 מיקרוליטר לאופטימיזציה. כל תגובה מכילה על ידי פריימרים גנומיים של DNA DPS שהומר על ידי סולפיט, מגנזיום כלוריד, אשלגן כלורי טריס הידרוכלוריד pH 8.3 אנאק פולימראז לבדיקת הטיית הגברה של חומר שעבר מתילציה או ללא מתילציה

השתמש בדגימת בקרה של 50 50 מתילציה ללא מתילציה שהומרה במלוא הסולפיט כדי לבדוק הגברת PCR פרופורציונלית עם המרת בי סולפיט. פריימרים ספציפיים ותגובת PCR מתערבבים בתרמוסייקלר שיפוע טמפרטורה מגדירים את תגובת הריצה בשיפוע פלוס מינוס שלוש מעלות צלזיוס מה-TM של הפריימר על פני שמונה עד 10 צינורות, מערבלים את הצינורות ומסתובבים לזמן קצר במיקרו צנטריפוגה לפני הנחתם בתרמחזורלר. איור זה מציג ג'ל אגרוס עם פרופיל הגברת PCR בשיפוע טמפרטורה מתערובת של 50% DNA שעבר מתילציה וללא מתילציה

אמפליקונים ונתיבי ה-PCR המסומנים בנתיבי T 2, 5 ו-8 טופלו באנזים הגבלה שיעכל רק DNA מתילציה תנאי הגברת PCR אופטימליים צריכים להגביר אמפליקונים מתיליים ולא מתיליים בפרופורציה וללא הטיה וכתוצאה מכך כמות שווה של תוצר PCR חתוך ולא חתוך כפי שניתן לראות כאן. תנאי הרכיבה התרמית האופטימליים להגברה לא מוטה הם ב-55.6 מעלות צלזיוס. ניתן לנתח המרה מלאה של ה- DNA של הבי סולפיט על ידי עיכול עם אנזים ספציפי לאתר ציטוזין שיעכל רק נתיבי DNA שלא הומרו שלוש, שש ותשע.

המרת DNA דו-סולפיטית מלאה מסומנת כאן על ידי היעדר DNA חתוך בכל שלושת הנתיבים, נתיבים שלוש, שש ותשע. תרשים דיסוציאציה זה בזמן אמת מציג שיעור שווה של תערובת קו כתום אדום של DNA שעבר מתילציה וללא מתילציה 50 50 בהשוואה להגברת הבקרה של קו ורוד שעבר מתילציה מלאה m וקו ירוק DNA ללא מתילציה U, המתנתקים ב-82.9 מעלות צלזיוס ו-86.9 מעלות צלזיוס בהתאמה. זה מצביע על כך שאין הטיית הגברה המבוססת על הטמפרטורה שבה המולקולות השונות יתנתקו.

ניתן לדמיין את שברי ה-PCR המתקבלים מהגברה של דגימות שטופלו בבי סולפיט על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס ולרצף. מוצג כאן ישירות עקבות רצף משלושה קווי תאים שונים עם אתרי CPG המודגשים בקו התא הצהוב X מציג מתילציה של 100% בכל שלושת אתרי ה-CPG, כאשר קווי התאים Y ו-Z מראים דרגות שונות של מתילציה כפי שניתן לראות על ידי אותות GA חופפים המוצגים כאן. איור 4 A הוא עקבות רצף משלושה קווי תאים שונים עם אתרי CPG מודגשים בצהוב.

לאחר ריצוף ישיר של שיבוטים בודדים, ניתן לסדר את מצב המתילציה של המולקולות הבודדות במפת דו סולפיט. כדי להמחיש את המתילציה ההטרוגנית, צפיפות המתילציה באתרי CPG בודדים מוצגת באדום. במפת דו-סולפיט מייצגת זו, ניתוח מתילציה כמותית בתפוקה גבוהה של מדגם.

שימוש בטכנולוגיית אפי טייפר רציף יכול לייצר ספקטרום ספציפי התלוי בנוכחות של ציטוזינים שעברו מתילציה, כמו שמוצג בדוגמה זו איור 5 A.לאחר מכן ניתן להסיק סיכום של היחסים בדגימה בצורה של אפיגרמה איור חמש B.דוגמה זו מציגה את אחוז מתילציה של DNA בכל אתר CPG עבור ארבעה קווי תאים שונים. לבסוף, ניתן לגזור סיכום עלילת מתילציה איור 5 C מהאפיגרמה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור מתילציה של DNA ותפקידו במחלות אנושיות.