אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:21 דק׳ • June 17th, 2025
קחו צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית המכילה נוירונים עובריים בקליפת המוח של עכבר.
הנח את הצלחת בתוך התא הסביבתי של מיקרוסקופ ניגוד הפרעות דיפרנציאלי, או DIC, כדי לשמור על כדאיות התא במהלך ההדמיה.
מיקרוסקופ DIC מפצל אור מקוטב לשתי אלומות החוצות את הדגימה.
שינויים במקדם השבירה על פני הדגימה מציגים שינויי פאזה בין אלומות אלו.
כאשר הקרניים מתאחדות מחדש, ההפרעה שלהן יוצרת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה, מה שהופך מבנים תאיים עדינים יותר לגלויים.
זהה נוירונים עם אקסונים לא מסועפים והשתמש בהדמיית זמן-lapse כדי לדמיין הסתעפות אקסונלית.
טפל בנטרין-1, רמז הנחיה חוץ-תאי שנקשר לקולטנים אקסונליים ומפעיל אקסוציטוזיס מקומי.
שלפוחיות אקסוציטיות מספקות רכיבי ממברנה לאתרים בזמן שהשלד הציטולוגי מאורגן מחדש כדי לתמוך בהתרחבות הממברנה.
תחת המיקרוסקופ, שינויים אלה מופיעים כבליטות קטנות, המסמנות את תחילת ההסתעפות האקסונלית.
עם הזמן, בליטות אלה מתפתחות לענפים אקסונליים בוגרים, הממחישים את התהליך הדינמי של התפתחות עצבית.
לאחר יומיים במבחנה, הנח את צלחת ההדמיה בתחתית הזכוכית המכילה נוירונים לא מועברים בתא סביבתי לח שחומם מראש. השתמש במיקרוסקופ המצויד באפוכרומט תוכנית 60x, 1.4 NA, עדשת אובייקט DIC ומעבה צמצם מספרי גבוה לאיכות התמונה והרזולוציה הטובות ביותר. לאחר מכן, עם תאורת אור מועברת, התאימו את מישור המוקד כדי למצוא נוירונים דרך העיניים.
עבור הדמיית DIC של הסתעפות אקסונים, הגדרה נכונה של תאורה קרירה יותר תהיה חלק בלתי נפרד מאופטימיזציה של התמונה והיא קריטית להפקת תוצאות ניתנות לניתוח. לאחר מכן, כאשר הנוירונים המעניינים נמצאים בשדה הראייה, השתמשו בפונקציית הרכישה הרב-אזורית בתוכנת ההדמיה כדי למצוא ולשמור את מיקומי ה-XYZ של לפחות שישה תאים. כעת, הוסף לריכוז סופי של 250 ננוגרם למיליליטר של נטרין-1 או גורם מעניין אחר כדי לעורר את התאים, ולחץ על התחל רכישת אזורים מרובים.
ברצף, רכוש תמונות בכל מיקום כל 20 שניות למשך 24 שעות, עצור את הרכישה והתמקד מחדש לפי הצורך. בתוך תוכנת ההדמיה, סקור תמונות על-ידי בחירה באפליקציה, סקירת נתונים רב-ממדיים ופתח את הקובץ הרצוי. זהה ענפי אקסון יציבים שנוצרים במהלך הפעלת ההדמיה. השתמשו בכלי אזור העקיבה למדידת ענף אקסון יציב מבסיס האקסון ועד לקצה.