הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

קחו עכבר טרנסגני מורדם המבטא חלבונים פלואורסצנטיים במיקרוגליה. אבטח אותו על מסגרת סטריאוטקסית עם במה ממונעת תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני.

הגולגולת מצוידת בצינור מתכת עם תחתית זכוכית המשטיח בעדינות את המכתשית מעל אזור ההיפוקמפוס קורנו אמוניס 1 או CA1, ומבטיח ממשק אופטי ברור ללא

לחץ מוגזם על הרקמה הבסיסית.

מלאו את צינור המתכת במים כדי לייעל את השידור האופטי.

הפעל את הלייזר הפועם באורך גל העירור.

באמצעות פלואורסצנטיות מפרנכימת המוח ואור מוחזר מצינור המתכת, התאם את המיקוד באזור CA1.

מקם מחדש את ראש העכבר כדי ליישר את תחתית הזכוכית במקביל למישור ההדמיה, כדי להבטיח מיקוד אחיד על פני שדה הראייה.

התאם את המטרה לרזולוציה אופטימלית וצפה בדינמיקה של מיקרוגליה in vivo באזור CA1.

לאחר מכן, דמיינו את הבליטה המשוננת, שבה מיקרוגליה פלואורסצנטית מאשרת את שלמות CA1.

הנח את העכבר במכשיר החזקת הראש מתחת לעדשת האובייקט של מיקרוסקופ שני הפוטונים ועל סריקת XY הממונעתtage. לאחר מכן מלאו את החלל בין תחתית הזכוכית לעדשת המטרה במים מבלי ליצור בועות אוויר. כוונן את המיקוד ל-CA1 בהנחיית הקרינה הנפלטת מהפרנכימה של המוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת, תחת תאורה רציפה על ידי הלייזר הפועם.

כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש כך שתחתית הזכוכית תהיה מקבילה למישור ההדמיה. לאחר מכן, כוונן את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב-CA1. לאחר מכן, ודא שהתאים הפלואורסצנטיים בשכבה המולקולרית של הפיתול המשונן, או DG, בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית, מצולמים בכל שדה הראייה. רק במקרה של ניתוח מוצלח, ניתן לזהות את אותות ה-DG באופן מיידי.

ודא שמיקרוגליה התאוששה מהמורפולוגיה המסועפת שלה. לאחר מכן בצע הדמיה in vivo על שכבת העניין ב-CA1.