תפלצת רוחנית דור הקפסולה testis
7 בנובמבר 2011
אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) יש פוטנציאל לטפל מספר עצום של מחלות שונות. השירות של תאים אלה הוא בכך שהם יכולים להתמיין לכל סוג תא בגוף. כאן אנו מתארים את assay תפלצת רוחנית, אשר משמש כדי להדגים את pluripotence של hPSCs.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון פלוריפוטנציה על ידי יצירת טרטומה במעטפת האשכים של עכברים עם מערכת חיסונית לקויה, תוך שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים או H PSCs. התחילו באיסוף תרבית של H PSCs המועמדים לבדיקת פלוריפוטנציה. לאחר מכן, בצעו ניתוח לחשיפת אשכי העכבר והזריקו את התאים אל תוך מעטפת האשכים.
החזיר את האשכים למיקומם המקורי וסגור את העכבר באופן כירורגי. לאחר שש עד 12 שבועות, בחן את הגידול שהתפתח באמצעות היסטולוגיה כדי לבדוק נוכחות של תאים מכל שכבת נבט. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להוכיח שקו HPSC הוא אכן פלוריפוטנטי על ידי הצגה של יכולתו להתמיין לתאים מכל שלוש שכבות הנבט בעכבר עם מערכת חיסונית מוחלשת. למרות ששיטות חדשות להוכחת פלוריפוטנציות של תאי גזע אנושיים דווחו לאחרונה, מבחן הטרטומה נותרe złoty standard בתחום; הפרוצדורה תוצג על ידי tron, טכנאי בכיר במעבדת תרבויות התאים שלי.
יש להביא את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים לקונופלואנס ולאחר מכן להפריד את ה-HPSCs באמצעות Accutase. ספרו את התאים כדי להכין תרחיף של 1 מיליון HPCs לכל הזרקה. ראשית, גלחו את הבטן של עכברים זכרים בני שישה שבועות תחת הרדמה, מזן עכברים עם מערכת חיסונית מוחלשת, באמצעות מכשיר גילוח.
לאחר מכן, שטפו את האזור הגולח ב-70%ethanol. חזרו על התהליך שלוש פעמים, תוך החלפת המטבונים בכל פעם. לביצוע ההליך הכירורגי, העבירו את החיה למשטח חימום בתוך מנדף סטרילי עם מספריים כירורגיים סטריליים.
בצעו חתך אורך של סנטימטר אחד דרך העור והפריטונאום, ממש מתחת לגובה מפרק הירך, תוך כדי החזקת הפריטונאום באמצעות פינצטה. הגיעו עם זוג נוסף של פינצטות סטריליות לכיוון הירך הימנית ומשכו החוצה את הרקמה השומנית הלבנה יחד עם האשכים המחוברים אליה. כעת מלאו מזרק טוברקולין של 1 CC ב-hpsc להזרקה. הזריקו לאט 20 עד 30 µL של H PSCs למרכז קפסולת האשך, הרחק מכלי דם מרכזיים.
הוצא את המחט באיטיות באמצעות פינצטה כדי למנוע רפלוקס של התאים. העבר את האשכים ורקמת השומן חזרה למיקומם המקורי בבטן. סגור את הפריטונאום באמצעות שתי או שלוש תפרים נספגים וסגור את העור בעזרת אוטו-קליפסים.
לאחר הניתוח, יש להעניק משככי כאבים פעמיים ביום לפי הצורך. יש לעקוב אחר צמיחת גידול מורגש במישוש בבעל החיים לאורך תקופה של שש עד 12 שבועות. כאשר הגידול יגיע לגודל של כחמישה מילימטרים, יש להוציא את הגידול מהעכבר שהוקריב לצורך תיעוד.
צלמו את הגידול ומדדו הן את הגודל והן את המשקל. לאחר מכן חתכו את הגידול לחתיכות קטנות וקבעו אותו בתמיסת 4%paraldehyde לצורך היסטופתולוגיה. בדרך כלל, טרטומה נצפית לאחר ששה עד 12 שבועות.
בדוגמה זו, מיליון תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מסוג WA 09 הוחדרו לקפסולת האש של עכבר עם מערכת חיסון לקויה. בדיקה מעמיקה של הטרטומה חושפת הגתרוגניות וציסטות רבות הצמודות אליה, כפי שצפוי.
ניתוחים היסטופתולוגיים מעידים על נוכחות של תאים מכל אחת משלוש שכבות הנבט. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לכלול קו תאים של ביקורת חיובית הידוע כבעל פוטנציאל גבוה, כדי לוודא שהבדיקה בוצעה כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה לגבי האופן שבו קובעים האם קו תאי גזע אנושי הוא פלוריפוטנטי או לא.
סקירה כללית
מאמר זה דן בבדיקת טרטומה, שיטה המשמשת להערכת הפלוריפוטנטיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). הבדיקה כוללת הזרקת hPSCs לקפסולת האש של עכברים עם מערכת חיסונית לקויה ובחינת הטרטומות שנוצרו כדי לזהות דיפרנציאציה לסוגי תאים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
- היסטופתולוגיה
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים יכולים להתמיין לכל סוג תא.
- היווצרות טרטומה היא מדד מרכזי לפלוריפוטנטיות.
- בדיקה זו נחשבת ל"סטנדרט הזהב" להוכחת פלוריפוטנטיות.
- קיימות שיטות חדשות, אך בדיקת הטרטומה נותרת בשימוש נרחב.
מטרת המחקר
- להדגמת הפלוריפוטנטיות של hPSCs באמצעות יצירת טרטומה.
- מתן מתודולוגיה מפורטת לביצוע בדיקת הטרטומה.
- הדגשת החשיבות של שימוש בביקורת חיובית בבדיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר של hPSCs והכנה להזרקה.
- חשיפה כירורגית של אשחול העכבר והזרקת hPSCs.
- מעקב אחר צמיחת הגידול לאורך שש עד שתים-עשרה שבועות.
- ניתוח היסטולוגי של הטרטומה לצורך זיהוי דיפרנציאציה של שכבות עובריות.
תוצאות עיקריות
- טרטומות נוצרו שש עד שתים-עשרה שבועות לאחר ההזרקה.
- ניתוח היסטופתולוגי אישר נוכחות של תאים מכל שלושת שכבות הנבט.
- הוכח כי בדיקת הטרטומה יעילה להערכת פלוריפוטנציאליות.
- נכללה ביקורת חיובית כדי לתקף את תוצאות הבדיקה.
מסקנות
- בדיקת טרטומה היא שיטה מהימנה לאישור הפלוריפוטנטיות של hPSCs.
- טכניקות כירורגיות נכונות וניטור הן קריטיים להשגת תוצאות מוצלחות.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון שיטות חלופיות לצד בדיקות מסורתיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
בדיקת הטרטומה מספקת מדד תפקודי לפלוריפוטנציה (pluripotency) על ידי הדגמת יכולת דיפרנציאציה בכל שלוש השכבות העובריות in vivo. בדיקה זו תומכת בתיקוף המטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח מוקדם של טיפולים מבוססי תאי גזע. היא מאפשרת ביטחון חיזוי בזהות התא לפני המעבר למודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאשר פלוריפוטנציה על ידי אימות דיפרנציאציה לקווי של экטודרם, מזודרם ואנדודרם.
- ערך תפעולי: משתמש במודל in vivo סטנדרטי כדי להפחית טענות שגויות לפלוריפוטנציה (false-positive).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות של go/no-go לגבי התאמת קו תאי הגזע לפיתוח טיפולי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטים היסטופתולוגיים כמותיים לייצוג שכבות נבט.
- ערך תפעולי: קובע פרוטוקול הניתן לשחזור המשתמש בהזרקה לקפסולת האשכים בעכברים עם מערכת חיסונית לקויה.
- ערך אסטרטגי: תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות במעבדות שונות לצורך בדיקת פלוריפוטנטיות עקבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאמת את הפוטנציאל ההתפתחותי של hPSCs לפני בידול לתאי פרוגניטורים ספציפיים לשושלת.
- ערך תפעולי: דורש ניטור במשך 6–12 שבועות לבדיקת היווצרות גידולים וניתוח היסטופתולוגי.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון להעברת שורות תאי גזע למחקרי יעילות פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת הטרטומה משמשת כשלב סינון ברצף גילוי תאי הגזע, והיא ממוקמת לאחר השלב של שמירה על פלוריפוטנציות ולפני ביצוע גבייה מודרכת או בדיקות יעילות פרה-קליניות.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת את השערת הליבה של רב-פוטנציאליות (pluripotency) על ידי הערכת יכולת דיפרנציאציה לשלושת השבטים.
- סריקה: מייצרת שיעורי היווצרות סטנדרטיים של טרטומה ודירוג היסטולוגי להערכה השוואתית של קווי תאים.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות ספציפיות לשכבות העבรียות באמצעות היסטופתולוגיה לצורך כימות פוטנציאל הדיפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין אישוש הרב-פוטנציאליות לתהליכי עבודה של דיפרנציאציה בשלבים מאוחרים יותר, לצורך ייצור תאים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כנקודת בקרה הניתנת לשימוש חוזר לאישור רב-פוטנציאליות עבור קווי hPSC מרובים בסריקת תהליכי פיתוח טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בנוגע לזהות תאי הגזע על ידי אישור פלוריפוטנטיות תפקודית.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור באמצעות הליכים כירורגיים והיסטולוגיים מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי סילוק קווים שאינם פלוריפוטנטיים בשלבים מוקדמים של הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מבוסס-סיכון של קווי תאי גזע להשקעה בתהליכי דיפרנציאציה ובמידול מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים במכרסמים ובטכניקה סטרילית להזרקה לקפסולת האשכים.
- תלוי בגישה לזני עכברים עם מערכת חיסונית לקויה ובמתקנים לניטור לאחר ניתוח.
- מצריך תשתית היסטופתולוגית לזיהוי שכבות העובר בפרוסות של טרטומה.
- כולל פיקוח אתי ואישור של IACUC לשימוש בבעלי חיים בבדיקות tumorigenicity.
- מוגבל למסגרת זמן של 6–12 שבועות, מה שעשוי להאט מהלכי סריקה איטרטיביים.
