דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו
1 באוקטובר 2007
אנו להדגים שיטה פשוטה עבור הצבת תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו דפוסי תאים על ידי הטלת שבב סיליקון שמכיל microwells מלא תאים על גבי המצע. שיטה זו מספקת דרך חדשה כדי לווסת איתות diffusible ו juxtacrine בין תאים.
אני ניקל מיטל, סטודנט לתארים מתקדמים במעבדת בומן. היום אדבר על מכשיר שפותח על ידי שני סטודנטים לשעבר במעבדה שלנו, הנקרא bio flip chip.
מכשיר זה מאפשר העברה של תאים על מצע לפי בחירת החוקר ובתצורה לפי בחירת החוקר. המכשיר עצמו, יש לנו אחד כזה כאן, הוא פשוט מאוד. הוא מורכב בעיקרו מבארות זעירות בתוך פיסת סיליקון.
כל באר מתוכננת בדרך כלל להכיל תא בודד בלבד, אך במידת הצורך, ניתן כמובן להגדיל אותן. ייצור ההתקן מבוצע כך שהבארים יהיו באותו סידור שבו התאים ימוקמו בסופו של דבר על התשתית. לכן, ההתקן עצמו מיוצר באמצעות ליטוגרפיה רכה.
בפרט, אנו משתמשים ב-PDMS, שהוא poly dimethyl siloxane, ומייצרים ממנו תבנית על גבי פרוסת סיליקון. יש לנו אחת כזו כאן. פרוסת התבנית עצמה מיוצרת באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית ליצירת תבנית של SU-8 photoresist, אשר מורכב על פרוסת הסיליקון בשיטת spin coating.
לסיכום, התאים מועברים לתשתיות המבוקשות על ידי מילוי בארות ה-bio flip chip בתאים אלו. לאחר מכן, אנו מניחים את השבב על התשתית הנבחרת, שלעיתים קרובות היא פוליסטירן לתרבית רקמות. ולבסוף, אנו הופכים את השילוב, מה שמאפשר לתאים לנשור מהבארות אל התשתית.
אני סטפני פלאבין. אני חוקרת בתואר ראשון כאן במעבדת גולדמן, והיום אדגים כיצד להשתמש ב-bio flip chip כדי לתבנית תאים ביום שלפני. אנחנו רוצים לבצע ניסוי בתבנית תאים.
נבצע הדבקה באמצעות פלזמה של ה-PDMS לפסיידה של זכוכית בגודל אינץ' אחד על אינץ' אחד. לאחר מכן נשרה את השבב למשך לילה, כאשר הצד של הבאר פונה כלפי מטה, בתוך תמיסת PBS. כמו כן, נגזור אטמים שישמשו בניסוי התבנית ונאסוף תפסני נייר שגם הם ישמשו בתהליך.
מרח 200 µL של BSA על פני השטח של כל שבב. הנע את פני השבב באמצעות קצה הפ pipette כדי להוציא בועות ולאפשר לתמיסת ה-BSA למלא את הבארות. השאר את השבבים תחת המנדף למשך שעה אחת במעבר אור UV בתאים כרגיל.
לאחר שעה, שאבו את תמיסת ה-BSA מהשבבים ושטפו כל שבב עם 200 microliters של PBS. הוסיפו 200 microliters של תמיסת תאי מעבר בריכוז של 10⁶ תאים ל-mil. לאחר המתנה של 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע לתוך הבארות, שטפו את פני השבב באמצעות PBS. היטו את השבב לפינה אחת בזווית של כ-15 מעלות ושאבו באיטיות את תמיסת התאים מהפינה התחתונה של השבב.
החזירו את השבב למצב מאוזן והוסיפו באיטיות 50 µL של PBS לפינה העליונה. חזרו על שלב השטיפה מספר הפעמים הדרוש. לאחר ששוטפו ה-xls מפני השבב, הוסיפו כ-50 µL של מדיום לאטב הפנימי של הצלחת.
הוסיפו מצע לחלקו העליון של כל שבב. לאחר מכן, הפכו את הצלחת, והטו אותה והורידו אותה על פני השבב, החל מזווית אחת. לאחר מכן, השכיבו את הצלחת על השבב באופן שטוח כדי למנוע היווצרות בועות בין הצלחת לשבב.
הוסיפו תופסני נייר לכל צד של השבב כדי לקבע אותו במקומו. הסירו את הידיות מכל תופסן נייר כך שכאשר השבב יהפוך, הוא יונח בצורה ישרה על הצלחת. העבירו את השבב לאינקובטור והפכו אותו במהירות, תוך הימנעות מכל תנועה מיותרת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית למיקום תאים על תשתית באמצעות מכשיר הנקרא bio flip chip. על ידי הפיכת שבב סיליקון עם מיקרו-בארים (microwells) מלאים בתאים אל על התשתית, חוקרים יכולים לשלוט ביעילות במיקום התאים, ובכך לשפר את הוויסות של האותות המועברים בין התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- מיקום תאים הוא קריטי למחקר של אינטראקציות תאיות.
- ייתכן ששיטות נוכחיות אינן מדויקות מספיק במיקום התאים.
- הביו-פליפ-צ'יפ (bio flip chip) מציע פתרון פשוט ויעיל.
- טכניקה זו יכולה להשפיע הן על סיגנלינג דיפוזיבילי (diffusible) והן על סיגנלינג ג'וקסקריני (juxtacrine).
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה למיקום תאים על תשבתיות.
- שיפור ההבנה של מנגנוני העברת אותות בתאים.
- אספקת כלי לחוקרים בתחומי ביולוגיה שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של ה-bio flip chip.
- מילוי מיקרו-בארים בתאים.
- הפיכת השבב על גבי התשתית הרצויה.
- תצפית וניתוח של מיקום התאים וההסבה הסיגנלית.
תוצאות עיקריות
- מיקום מוצלח של תאים בנקודות היעד.
- שיפור בוויסות של איתות תאי.
- הדגמת נוחות השימוש במכשיר.
- יישומים פוטנציאליים במערכי ניסוי שונים.
מסקנות
- ה-bio flip chip הוא כלי חדשני למיקום תאים.
- שיטה זו עשויה להשפיע משמעותית על מחקרים של איתות תאי.
- מחקרים עתידיים יוכלו להרחיב את הטכניקה הזו ליישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרת מרחב מדויקת של אוכלוסיות תאים מאפשרת בחינה מכניסטית של מסלולי סיגנלינג דיפוזיביים ויוקסטקריניים, הקריטיים לאישור מטרות במודלים של מחלות המבוססים על תאי גזע. ה-Bio Flip Chip מספק שיטה שאינה תלויה בתשתית ושומרת על הכימיה ליצירת תבניות של מיקרו-סביבות תאיות מוגדרות, ובכך תומך בפיתוח בדיקות הניתנות לשחזור לצורך סריקה פנוטיפית. גישה זו מגבירה את הביטחון בניבויים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפחתת השונות במגע בין תאים ובחשיפה לגורמים פראקריניים, ובכך משפרת את הרצף התרגומי ממודלים in vitro לאישור פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת השערות לגבי האופן שבו צפיפות תאים מקומית וסידור מרחבי משפיעים על מסלולי התמיינות ותחדשות עצמית של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מבטל שונות סטוכסטית הנובעת מזריעה אקראית, ובכך מבטיח קלטים עקביים של איתות ג'וקסטקריני ופאראקריני בין חזרות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד התרומה של איתות תלוי-מגע לעומת איתות מסיס במחקרי מעורבות מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יוצר מערכי תאים כמותיים ומוגדרים מרחבית, התואמים לדימיון בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ולקריאות מרובות-ערוצים (multiplexed readouts).
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות אינטראקציה בין תאים על פני פוליסטירן לתרביות רקמה, זכוכית, Matrigel ושכבות מאכיל (feeder layers), ללא שינוי של הכימיה של התשתית.
- סקביליות: תואם להדפסת מיקרו-מגעים (microcontact printing) ליצירת תבניות של מטריקס חוץ-תאי, המאפשרות שליטה קומבינטורית על רמזי היצמדות ואיתות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דפוס של תאי גזע עובריים בנישות מוגדרות כדי לדגמן מסלולי איתות התפתחותיים הרלוונטיים להפרעות מולדות ולרפואה רגנרטיבית.
- מידול פרה-קליני: מאפשר ניתוח מנה-תגובה של מורפוגנים או תרופית בסביבות מיקרויות מבוקרות מרחבית, ובכך משפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית.
- קידום מותאם סיכונים: מפחית תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי מומשכים על ידי מזעור רעשים הנובעים מאגרגציה לא מבוקרת של תאים או מתדירות מגע משתנה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ה-Bio Flip Chip משתלב בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לתבנית בר-שחזור של תאי גזע לפני חשיפה לתרכובות, ובכך הוא תומך בסריקה מונחית-היפותזה ובמעקב מכניסטי באופטימיזציה של מועמדים (lead optimization).
- ביולוגיה של הגילוי: בודק כיצד ארגון מרחבי מוגדר של תאי גזע עובריים מווסת את קביעת השושלת (lineage specification) ואת הפעילות של מסלולים תאיים.
- סינון (Screening): מספק תתי-מצעים תאיים סטנדרטיים ו可שחזרים להערכת השפעות של תרכובות על איתות התלוי במגע ואיתות דיפוזיבי.
- אנליטיקה: מאפשר מיפוי מרחבי כמותי של ביטוי סמנים, שגשוג ואפופטוזיס כמשתנים תלויים בתרביות משולבות (co-cultures) דפוסיות.
- מחקר תרגומי: מדמה רשראות איתות התפתחותיות אנושיות במערכות עם בקרה מרחבית כדי לסייע בבחירת מטרות טרם-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת דפוס מודולרית הניתנת להתאמה לסוגי תאים, תתי-מצעים ותצורות של מטריצה חוץ-תאית מגוונים בפרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון התיקוף של המטרה על ידי הפחתת רעש ביולוגי הנובע מאינטראקציות לא מבוקרות בין תאים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות של הבדיקה באמצעות מיקום תאים מדויק ומוגדר על ידי המשתמש, ללא תלות בשונות של טכניקת הזריעה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי שיפור יחס האות-לרעש בסריקות פנוטיפיות המכוונות לתקשורת בין-תאית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מודולטורים של מסלולים ג'וקסקריניים (למשל, Notch, Wnt) בתחומי מחלות המתווכות על ידי תאי גזע.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בליתוגרפיה רכה וטיפול ב-PDMS לצורך ייצור או רכישה של השבבים.
- תלוי בגישה לציוד להדבקה בפלזמה ולטיפול ב-UV/ozone להכנת התשתית.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנה ושטיפה של תאים כדי להבטיח טעינה ושחרור יעילים מהבארים.
- התאמה למטריצות תלת-ממדיות או למערכות מיקרופלואידיות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תזמון ההפיכה ואנרגיית הפנימה.
- מגבלה מעשית: יש לקבוע באופן אמפירי את תפוסת הבארים עבור כל סוג וגודל של תא, כדי למנוע טעינה של מספר תאים בבארים המיועדות לתא בודד.
