Name: דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: למד שיטת bio flip chip להעמדת תאים על סובסטרט ביולוגי בדיוק גבוה. טכניקה זו מאפשרת שליטה במיקום תאים ומודולציה של מסרים בין-תאיים במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק EB007278.

ביצוע BFC BFCs מבוצעים על ידי דפוס polydimethylsiloxane (PDMS) מעל פרוסות סיליקון 4 Si &quot;מאסטר. ביצוע רקיק אמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי dehydrating ופלים Si למשך 30 דקות ב 130 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות על coater ספין, לשפוך SU8-2050 (Microchem) על גבי פרוסות סיליקון, כבש מתוך זה 300 / סל&quot;ד עד 3000-4000 סל&quot;ד, ו - עבור ספין של 30 להניב לגבהים תכונה של 40-30 מ&quot;מ, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ספינינג, המקום רקיק על 65 מעלות צלזיוס פלטה חשמלית, מיד תעלי את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 5-6 דקות, ולאחר מכן כבש אותו עד 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פרוסות למינון של 200 UV mJ / 2 ס&quot;מ על aligner קשר באמצעות מסיכה כהה שדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות על פלטה חשמלית 65 מעלות צלזיוס, מיד תעלי את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 4-5 דקות, ולאחר מכן כבש אותו עד 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח ופלים ב אצטט ראש הממשלה Isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Silanize ופלים למשך 30 דקות באמצעות hexamethyldisiloxane (שין, אטסו MicroSi), או (Tridecafluoro-1-,1,2,2 tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (t2492-KG, התמחויות UCT, בריסטול, פנסילבניה), כדי למנוע מן PDMS דבקות רקיק האב סי. </li></ol> דפוס שבבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) ביחס 10:01, יוצקים אותו על פרוסות סיליקון אמן סי (~ 15 גרם לכל רקיק), ולתת לו לרפא לילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולפים את PDMS נרפא את פרוסות סיליקון Si ו לגזור כל שבב באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונד כל שבב שקופיות מיקרוסקופ 1x1 ס&quot;מ לחתוך לטיפול קל. </li></ol> הכנת BFC לשימוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הלילה BFC ב PBS על מנת למנוע ספיגה של מדיה לתוך PDMS במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש שבבי עם Kimwipe (Kimtech המדע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ירידה של 7.5% שור סרום אלבומין (BSA) (~ 200 מ&quot;ל) על פני השטח בדוגמת של BFC, ואז לגרד אותה עם טיפ פיפטה לפזר את BSA ולהסיר בועות מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את ארגון ה-BSA על פני השטח BFC לפחות 0.5 שעות. באופן אידיאלי להתסיס את BSA כל 15 דקות כדי למנוע קרום הנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את BFC בתוך צלחת 35x10 מ&quot;מ TCPS (Falcon, 35-3001), לחתוך את שולי דרך צלחת TCPS וחצי למטה כך ¾ &quot;קליפים קלסר (אופיס דיפו) יתאים מעבר לשולי הצלחת כדי לצבוט את שבב ו צלחת יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור אטם spacer (מסגרת בצורת עם קצה 20&#39;20 מ&quot;מ החיצוני, הפנימי 15&#39;15 קצה מ&quot;מ, 250-500 מ&quot;מ עובי) מסדין PDMS (מוצרי סיליקון מיוחדים) או סיליקון אחרים, ולהחיל אותו על צלחת באמצעות פינצטה. </li></ol> דפוסים תאים עם BFC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המנה, אטם, BSA מצופה שבב, ו -2 קליפים קלסר תחת אור UV למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב BSA ולשטוף את BFC פעמיים עם 200 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים ג&#39;לטין כדי בצלחת TCPS לחתוך אם נדרש קו התא שלך. אחרת, להרטיב את המשטח TCPS עם התקשורת קצת לפני החלת אותו השבב (ראה להלן). הדבר מונע מן בועות להרכיב בחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating PBS, פיפטה 200 מ&quot;ל של תמיסת התא (~ 1 × 10 6 תאים / מ&quot;ל) על פני השטח BFC. בואו התאים להסתפק 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את BFC לפינה אחת בכל זווית ~ ° 15 לאט פיפטה את פתרון התא עם טפטפת 200 מ&quot;ל. ואז, במקום שטוח BFC ולהוסיף 100 מ&quot;ל של PBS או מדיה ריקה לפינה BFC ההפוך. שוטפים את BFC באופן זה נוסף 2-4 פעמים, לפי הצורך, כדי לנקות את כל התאים של בין היטב אזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 מ&quot;ל של התקשורת על גבי משטח השבב. לשאוב ג&#39;לטין / מדיה TCPS. ואז להפוך את המנה מראש הרטובות ולאט לאט לדחוף למעלה BFC, לתוך צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בקלסר כל קליפ, על שני הצדדים של החדר כדי לאטום אותו. הסר את חודי מתכת מן קליפים קלסר כך צלחת נותר ברמה כאשר התהפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, במהירות להפוך את ההתקנה תוך הימנעות לאורך כל תנועה מיותרת, ולמקם אותו בחממה. </li></ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

אף על פי הפרוטוקול וידאו שמוצג כאן לתאר באמצעות 1 BFC עכבר דפוס בתאי גזע עובריים (mESCs), BFCs ניתן להשתמש דפוס כמעט כל סוג תא של עניין. השינוי היחיד שיהיה עליך לעשות הוא לשנות את הגודל של microwells. מניסיוננו, להשתמש BFC לתאי תבנית אחת של סוג תא אחר, בקוטר microwell וגובה שווה יותר מ 10 מיקרון קוטר תא פנוי עובד הכי טוב. BFCs יכול לשמש גם לתאי דפוס על גבי מצעים אחרים, כולל תאים אחרים, ללא שינויים משמעותיים בפרוטוקול. דפוסים על שכבת התאים הקיי...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>תבנית מאסטר מסיליקון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות לתרבית רקמות</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>אטבס סיכה 3/4&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הקסאמתילדיסילוקסאן</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריט חדש</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>PM acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7.5% Bovine Serum Albumin</td></tr></tbody></table>

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell הגומלין המורכב איתות diffusible לבין תאים תאים קשר (איתות juxtacrine) חשובים תהליכים ביולוגיים רבים כגון גדילת הגידול, התמיינות תאים גזע, תא גזע עצמית והתחדשות. מספר שיטות קיימות כיום לווסת איתות תא במבחנה. שיטה אחת מן הסכום הכולל של ויסות איתות diffusible היא לגוון את צפיפות זריעה התא במהלך התרבות. בשל אופייה האקראי של זריעת תאים, זה תוצאות שונות משמעותית ריווח תאים תאים בפועל סכום של מגע תאים תאים, ולא ניתן לקבוע על הסביבה המקומית. גישה יותר ספציפי לאיתות תא ויסות היא להשתמש מעכבי מולקולרית או גישות גנטיות להפיל איתות חלבונים ספציפיים, אך הן השיטות האלה הם המתאימים ביותר כדי לתמרן מספר קטן של מולקולות. כאן, אנו להפגין גישה חדשה איתות תאים תאים ויסות כי מודולציה על הסביבה המקומית של צביר של תאים על ידי הצבת מספרים שונים של תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו מספקת דרך משלימים לשלוט איתות diffusible ו juxtacrine מקומי בין תאים. השיטה שלנו עושה שימוש שבב Flip ביו (BFC), שבב סיליקון microfabricated המכיל מאות ל-אלפי microwells, כל אחד בגודל להחזיק או תא בודד או מספר קטן של תאים. אנחנו מעמיסים את השבב עם תאים פשוט על ידי pipetting אותם על גבי מערך של בארות כביסה תאים פרקו את המערך. השבב ואז התהפך על מצע, לפיה התאים נפולת של בארות על המצע, שמירה על דפוסים שלהם. אחרי התאים יש המצורפת, השבב ניתן להסיר (או שמאלה). גישה זו דפוסים התא הוא ייחודי בכך שהוא: 1) לא משנה את הכימיה של המצע, ובכך מאפשר לתאים להתרבות ולהעביר; 2) מאפשר דפוסים על גבי מצע כלשהו, ​​לרבות קלקר רקמות תרבות, זכוכית, matrigel, ו גם מזין שכבות התא; ו 3) תואם הדפסה microcontact המסורתי, המאפשר יצירה של איים תאי מטריקס עם תאים אלה ממוקמים בתוך האיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את דפוסים של תאים עובריים בעכבר על קלקר רקמות התרבות באמצעות BFC.

אנו להדגים שיטה פשוטה עבור הצבת תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו דפוסי תאים על ידי הטלת שבב סיליקון שמכיל microwells מלא תאים על גבי המצע. שיטה זו מספקת דרך חדשה כדי לווסת איתות diffusible ו juxtacrine בין תאים.

אינטראקציות בין תאים, המורכבות מאותות דיפוזיביליים וממגע בין תאים (אותת יוקסטקריני), הן חשובות בתהליכים ביולוגיים רבים כגון...

אני ניקל מיטל, סטודנט לתארים מתקדמים במעבדת בומן. היום אדבר על מכשיר שפותח על ידי שני סטודנטים לשעבר במעבדה שלנו, הנקרא bio flip chip.מכשיר זה מאפשר העברה של תאים על מצע לפי בחירת החוקר ובתצורה לפי בחירת החוקר. המכשיר עצמו, יש לנו אחד כזה כאן, הוא פשוט מאוד. הוא מורכב בעיקרו מבארות זעירות בתוך פיסת סיליקון.כל באר מתוכננת בדרך כלל להכיל תא בודד בלבד, אך במידת הצורך, ניתן כמובן להגדיל אותן. ייצור ההתקן מבוצע כך שהבארים יהיו באותו סידור שבו התאים ימוקמו בסופו של דבר על התשתית. לכן, ההתקן עצמו מיוצר באמצעות ליטוגרפיה רכה.בפרט, אנו משתמשים ב-PDMS, שהוא poly dimethyl siloxane, ומייצרים ממנו תבנית על גבי פרוסת סיליקון. יש לנו אחת כזו כאן. פרוסת התבנית עצמה מיוצרת באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית ליצירת תבנית של SU-8 photoresist, אשר מורכב על פרוסת הסיליקון בשיטת spin coating.לסיכום, התאים מועברים לתשתיות המבוקשות על ידי מילוי בארות ה-bio flip chip בתאים אלו. לאחר מכן, אנו מניחים את השבב על התשתית הנבחרת, שלעיתים קרובות היא פוליסטירן לתרבית רקמות. ולבסוף, אנו הופכים את השילוב, מה שמאפשר לתאים לנשור מהבארות אל התשתית.אני סטפני פלאבין. אני חוקרת בתואר ראשון כאן במעבדת גולדמן, והיום אדגים כיצד להשתמש ב-bio flip chip כדי לתבנית תאים ביום שלפני. אנחנו רוצים לבצע ניסוי בתבנית תאים.נבצע הדבקה באמצעות פלזמה של ה-PDMS לפסיידה של זכוכית בגודל אינץ' אחד על אינץ' אחד. לאחר מכן נשרה את השבב למשך לילה, כאשר הצד של הבאר פונה כלפי מטה, בתוך תמיסת PBS. כמו כן, נגזור אטמים שישמשו בניסוי התבנית ונאסוף תפסני נייר שגם הם ישמשו בתהליך.מרח 200 µL של BSA על פני השטח של כל שבב. הנע את פני השבב באמצעות קצה הפ pipette כדי להוציא בועות ולאפשר לתמיסת ה-BSA למלא את הבארות. השאר את השבבים תחת המנדף למשך שעה אחת במעבר אור UV בתאים כרגיל.לאחר שעה, שאבו את תמיסת ה-BSA מהשבבים ושטפו כל שבב עם 200 microliters של PBS. הוסיפו 200 microliters של תמיסת תאי מעבר בריכוז של 10⁶ תאים ל-mil. לאחר המתנה של 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע לתוך הבארות, שטפו את פני השבב באמצעות PBS. היטו את השבב לפינה אחת בזווית של כ-15 מעלות ושאבו באיטיות את תמיסת התאים מהפינה התחתונה של השבב.החזירו את השבב למצב מאוזן והוסיפו באיטיות 50 µL של PBS לפינה העליונה. חזרו על שלב השטיפה מספר הפעמים הדרוש. לאחר ששוטפו ה-xls מפני השבב, הוסיפו כ-50 µL של מדיום לאטב הפנימי של הצלחת.הוסיפו מצע לחלקו העליון של כל שבב. לאחר מכן, הפכו את הצלחת, והטו אותה והורידו אותה על פני השבב, החל מזווית אחת. לאחר מכן, השכיבו את הצלחת על השבב באופן שטוח כדי למנוע היווצרות בועות בין הצלחת לשבב.הוסיפו תופסני נייר לכל צד של השבב כדי לקבע אותו במקומו. הסירו את הידיות מכל תופסן נייר כך שכאשר השבב יהפוך, הוא יונח בצורה ישרה על הצלחת. העבירו את השבב לאינקובטור והפכו אותו במהירות, תוך הימנעות מכל תנועה מיותרת.

patterning-of-embryonic-stem-cells-using-the-bio-flip-chip

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיקרו בקנה מידה הנדסה לביולוגיה של התא

אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.

Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

השיטה המוצגת כאן משתמשת במיקרוגרף יחד עם הדמיה כמותית לחשיפת הארגון המרחבי בתוך תרבויות היונקים. הטכניקה היא קלה להקים מעבדה סטנדרטית בביולוגיה התא והוא מציע מערכת צייתן לחקור מבחנה בפריפרייה.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

נייר זה מציג שיטות לגידול מיוציטים לבביים עם צורות שונות, המייצגות פתולוגיות שונות, ומיון מיוציטים לביים דבקים אלה בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת תא אחד. הפלטפורמה המוצעת מספקת גישה חדשנית לתפוקה גבוהה והקרנת סמים עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.

גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

למד שיטת bio flip chip להעמדת תאים על סובסטרט ביולוגי בדיוק גבוה. טכניקה זו מאפשרת שליטה במיקום תאים ומודולציה של מסרים בין-תאיים במחקר ביולוגי.

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

גלה סרטונים נוספים