Name: טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד טיהור Hsp104, דיסאגרגאז חלבוני מסוג AAA+, מתוך שמרים באמצעות כרומטוגרפיית חילוף אניונים וכרומטוגרפיית ג'ל. שיטה זו מייצרת חלבון פעיל בכמויות גדולות לחקר מבנה ומנגנון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ-NIH (5T32GM008275-22) ואת הלב האגודה האמריקאית מענק predoctoral (עד EAS), כימיה, ביולוגיה ממשק אחוות מ-NIH (2T32GM071339-06A1) (על MED); ומענקים מן NIH (1DP2OD002177-01 ו-NS067354 0110), אליסון רפואי הקרן, ואת ביל ומלינדה גייטס (ל JS).

1. הביטוי של Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלסמיד המועסקים לטיהור ב E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, מכיל את Hsp104 לפתוח קריאת מסגרת בשליטת ועין מתנהלת של האמרגן TRC 26. הפלסמיד מייצר Hsp104 עם תג 6-N-מסוף שלו כי ניתן להסיר על ידי מחשוף פרוטאז TeV. המרה pPROEX-HTb-Hsp104 לתוך קודון ממוטב E. coli BL21-CodonPlus-RIL תאים (Stratagene, Agilent Technologies) באמצעות הליך טיפוסי השינוי חיידקי (למשל על פי הוראות היצרן). חשוב להשתמש קודון ממוטב E. coli זן Hsp104 כי יש הטיה קודון יוצא דופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות 2XYT 100 מ"ל (מתכון USB.: 16G / L קזאין peptone, 10g / L תמצית שמרים, 5g / L NaCl, pH 7.0) בתוספת 100μg/mL אמפיצילין ו 34μg/mL chloramphenicol עם transformants טריים לגדול בין לילה בשעה 37 ° C עם רעד בכל 200rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10ml של התרבות אל תוך הלילה 6 X 1 ליטר 2XYT עם 100μg/mL אמפיצילין ו 34μg/mL chloramphenicol ב צלוחיות 2L. תלחצו על 250rpm על 37 מעלות צלזיוס עד OD 600 = 0.4-0.6. תפסיק לרעוד ולהפחית את הטמפרטורה ל 15 ° C. אפשר תאים לאזן unagitated עבור 30 דקות בחממה עד שהוא מגיע 15 ° C. לאחר 15 ° C הוא הגיע לגרום ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ. קורות חיים רועד בכל 250rpm לילה (12-16 שעות). </li></ol> 2. תא קציר תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קציר ידי צנטריפוגה (ב רוטור precooled) בסל"ד 4000 עבור 20min ב 4 ° C (אנו משתמשים RC Sorvall 3BP צנטריפוגות +). השלבים הבאים יש לבצע מיד כי Hsp104 פעילות מצטמצם כאשר E. תאים coli הם קפואים. יתר על כן, כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח או 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא כדורי Resuspend ב prechilled (על הקרח) חיץ 10ml תמוגה (40mm HEPES KOH-pH 7.4, KCl 500mm, 20mm MgCl 2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 20mm, 5μM pepstatin, מעכב פרוטאז להשלים קוקטייל (1 EDTA ללא tablet/50mL), ו - β-2mm mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים עם homogenizer צרפתית (Emulsiflex) לחץ המשתמשת מחליף חום טבול במי קרח. לפני השימוש, להבטיח כי כל גושי התאים היו solubilized. לאחר equilibrating homogenizer עם חיץ תמוגה, שני עובר דרך הגליל עם לחץ של psi 15,000-18,000 מספיק עבור תמוגה מלא. אם העיתונות הצרפתית אינו זמין, דגירה עם ליזוזים ואחריו sonication יכול לשמש (ראה דיון). שמור מדגם קטן של תאים lysed לניתוח SDS-PAGE (1μL) (lysate באיור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פסולת התא על ידי צנטריפוגה בסל"ד 16,000 עבור 20min ב 4 ° C (אנו משתמשים RC5C Sorvall centifuge +). שמור supernatant עבור השלב הבא ולשמור מדגם קטן (1μL) של supernatant לניתוח SDS-PAGE (Load Ni באיור. 2). </li></ol> 3. Hsp104 טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים supernatant משלב 2.4 עם 12mL (2ml Ni-Sepharose חרוזים לכל 1 ליטר של תאים) של slurry 50% חיץ תמוגה Ni-Sepharose חרוזים equilibrated (GE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב מדגם לאט במשך 3 שעות ב 4 ° C כך Ni-Sepharose נשאר תלוי באופן שווה מקציפים ממוזער. פעמים הדגירה קצר יותר הם אפשריים, אבל תהיה ירידה בתשואה. ב 4 מעלות צלזיוס בנוכחות מעכבי פרוטאז, השפלה קטנה מתרחשת, ו 3 שעות Ni-Sepharose זמן הדגירה אינה ירידה בפעילות של המוצר הסופי. איסוף Ni-Sepharose ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C ב 2000 סל"ד (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). שמור מדגם קטן של supernatant לניתוח SDS-PAGE (1μL) וזורקים את השאר (תזרים Ni דרך (FT) באיור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את לאחזר Ni-Sepharose עם 25 כרכים הטור של חיץ לשטוף (40mm HEPES-KOH pH 7.4, KCl 150mm, 20mm MgCl 2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 20mm, 2mm β-mercaptoethanol), 5 כרכים של עמודה לשטוף עם חיץ KCl 1M להסיר מזהמים מחויב אלקטרוסטטי כדי Hsp104, ו 25 כרכים הטור של חיץ לשטוף. איסוף Ni-Sepharose לשטוף לאחר כל על ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C ב 2000 סל"ד (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). לאחר מחזור לרחוץ כל צנטריפוגה, הסר חוצץ על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי elute Hsp104, לערבב Ni-Sepharose עם חיץ 1mL elution (40mm HEPES KOH-pH 7.4, KCl 150mm, 20mm MgCl 2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 350mm, 2mm β-mercaptoethanol) לכל 1mL Ni-Sepharose ו לסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הריכוז הגבוה imidazole משבש את החרוזים שלו Ni-6 אינטראקציה. הסר Ni-Sepharose עם ריק 1.2 ספין עמודות מ"ל (Bio-Rad) על ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C בסל"ד 2000 (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). שמור 1μL של eluate לניתוח SDS-PAGE (eluate Ni באיור. 2). עבור כל ליטר של תאים, ~ 15mg של Hsp104 מתקבל בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר eluate חילופי לתוך מאגר Q (20mm טריס-HCl pH 8, 0.5mm EDTA, 5mm MgCl 2, 50mm NaCl) באמצעות MWCO 30,000 Amicon Ultra (MILlipore) 15 מ"ל יחידות concentrator צנטריפוגלי. ראשית, כדי להתרכז חלבון ~ 1.5mL מכן להוסיף 14.5mL של הצפת ש לדלל חלבון של פי 10. חזור 3 פעמים להחלפת חיץ. ה-pH מוגבר מלח נמוכה מבטיחה Hsp104 יש מטען שלילי גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר Hsp104 באמצעות כרומטוגרפיה אניון החליפין באמצעות הצפת ש equilibrated משאבים Q טור 6mL (GE). לפני הזריקה, חלבון מסונן באמצעות חלבון נמוך מחייב Millex GP PES ממברנה 0.22μM מזרק מסנן (Millipore). אנו מעסיקים קצב זרימת 1mL/min. לשטוף חלושות חלבונים מחייב עם נפח 1 טור של הצפת ש 20% + (20 מ"מ טריס-HCl pH 8, 0.5mm EDTA, 5mm MgCl 2, 1M NaCl). Elute Hsp104 ליניארי עם שיפוע (20% -50% הצפת ש +) מעל 5 כרכים עמודה (איור 3). איסוף שברים 1ml. Hsp104 ורוב גרסאות בדרך כלל elute ב ~ NaCl 400mm (31mS/cm). שמור דוגמאות של שברים השיא (1μL) לניתוח SDS-PAGE (איור 3, הבלעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שלו 6-תג, חלבון החליפין באמצעות concentrator Amicon צנטריפוגלי כמו לתאר לעיל (ראה שלב 3.5) לתוך מאגר מחשוף (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, ו 10mm MgCl 2). השתמש proTEV פרוטאז (Promega) או AcTEV פרוטאז (Invitrogen) בהתאם להוראות היצרן. עבור Hsp104, מצאנו כי יחס גבוה יותר של TeV פרוטאז: Hsp104 נדרשים עבור מחשוף מלא. אנו משתמשים יחס של יחידה 1 פרוטאז לכל 12μg Hsp104. המחשוף צריך להיות מבוצע על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות, ואחריו דגירה של 16 שעות ב 4 ° C. הריכוז הסופי Hsp104 צריך להיות בין 20-75μM מונומר. לכלות כל Hsp104 His6-tagged הנותרים פרוטאז TeV עם Ni-Sepharose (GE) על ידי הוספת Ni-Sepharose מעבר לכמות Hsp104 בתגובה מחשוף (להניח חרוזים יכולים להיקשר 15mg חלבון לכל מ"ל של שרף ארז). הסר חרוזים עם עמודות ספין ריק (Bio-Rad) על ידי centrifuging עבור 2min בסל"ד 2000 ב 4 ° C. איסוף דגימות לפני ואחרי מחשוף (1μL) לניתוח SDS-PAGE כדי להבטיח מחשוף, והסרת חלבון uncleaved (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי למאגר גודל הרחקה (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, 10mm MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT) באמצעות MWCO 30,000 Amicon Ultra (Millipore) כפי שמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לטהר Hsp104 באמצעות כרומטוגרפיה גודל הדרה. השתמש הדרה גודל מאגר Superose equilibrated 6 או Superdex 200 עמודה (הן GE) (איור 5). לפני הזריקה, חלבון מסונן באמצעות חלבון נמוך מחייב Millex GP PES ממברנה 0.22μM מזרק מסנן (Millipore). עבור פחות מ 10 מ"ג של חלבון, בגודל 10/300 העמודות (24mL) יכול לשמש ושברים 0.5ml נאספים. לקבלת דוגמיות יותר מ 10 מ"ג, בעמודה גודל 12/60 (120mL) אמור לשמש ו 1 מ"ל שברים נאספים. עיין ההוראות של היצרן, ספיקות ואמצעי אחסון מדגם להיות טעון. לאחר הטיהור, שברים Hsp104 הם אספו כפי שמוצג באיור. 5 ו מרוכזים יחידות Amicon מרוכז צנטריפוגלי (Millipore). Hsp104 מאוחסן כמתואר להלן. בשל אובדן החומר המפריד Hsp104 מוצרים השפלה ומזהמים את התשואה הסופית של מטוהרים באורך מלא Hsp104 הוא ~ 1-3mg לליטר החל בתרבות. </li></ol> 4. Hsp104 פעילות Disaggregase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיהור, זהו תרגול טוב כדי להעריך Hsp104 פעילות assay disaggregation. בדרך כלל, אנחנו מעסיקים assay מחדש בלוציפראז 2 (איור 6). ב assay זה, Hsp104 בשיתוף עם מערכת המלווה Hsp70 (Hsp70 ו Hsp40) disaggregates אוריאה-מפוגל אגרגטים גחלילית בלוציפראז 2. בלוציפראז מסיסים מזרז חמצון של luciferin כדי oxyluciferin, תגובה שמשחררת אור. הארה על ידי ניטור, מחדש יחסית, ולכן disaggregation, של בלוציפראז ניתן לקבוע. Hsp104 חייב להיות מסוגל בסינרגיה לשתף פעולה עם מערכת שיתוף המלווה Hsp70. כמות הארה התאושש תלוי Hsp70 המדויק: זוג Hsp40 מנוצל. אנו שגרתי להעסיק Hsp72 ו Hsp40 (עיצובים Assay). לכל הפחות, פעיל Hsp104 צריך לייצר גידול של פי 5 מחדש של בלוציפראז בהשוואה מחדש על ידי Hsp72: Hsp40 לבד (איור 6). Hsp104 ההכנות מצליחים להגיע לרמת פעילות מבוטלים. </li></ol> 5. Hsp104 אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון לטווח קצר, Hsp104 יכולים להישמר על 4 מעלות צלזיוס חוצץ בגודל הדרה. עם זאת, הפעילות תהיה ירידה לאחר 2-3 ימים ב -4 ° C ו בחדות אחרי שבוע 1 ב 4 ° C. עבור מבחני disaggregation אנו ממליצים Hsp104 אמור לשמש בהקדם האפשרי לאחר טיהור. באופן אידיאלי, Hsp104 יש להשתמש מיד מבחני disaggregation עמילואיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלבון חייב להיות מאוחסן לטווח ארוך, Hsp104 הוא החליף למאגר אחסון (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, 10mm MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT, גליצרול 10% (w / v)). Aliquots 100μl הם הצמד קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. להקפיא להפשיר מחזורים להפחית באופן דרסטי את פעילות Hsp104יש להימנע. אנו ממליצים לאט מפשיר Hsp104 על הקרח. עמילואיד disaggregase פעילות תרד בחדות לאחר חודש 1 ב -80 ° C. </li></ol> 6. נציג תוצאות ומספרים: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Hsp104 הוא disaggregase bifunctional. Disaggregation של אגרגטים מופרעת (המוצג בצד שמאל) דורש את שיתוף הפעולה של מערכת המלווה Hsp70 (Hsp70 Hsp40 ו) 2. Remodels Hsp104 הורה אגרגטים עמילואיד (המוצג בצד ימין) ללא סיוע של Hsp70 ו Hsp40 במבחנה, אך Hsp70 ו Hsp40 יכול לשפר Hsp104 פעילות נגד עמילואיד 26,28. עבור שני סוגי מבנים צבורים, Hsp104 זוגות הידרוליזה ל-ATP טרנסלוקציה המצע דרך הערוץ המרכזי שלה כדי לקדם disaggregation. טירוזין נושאות לולאות נקבוביות לעסוק המצע מעבורת דרך הערוץ המרכזי 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. SDS-PAGE ניתוח צעד Ni-sepharose טיהור זיקה. Lysate, טען ניקל, Ni FT דגימות Ni eluate היו מופרדים על ידי-SDS באמצעות 4-20% טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie . שים לב שלא כל Hsp104 הוא מסוגל לאגד את Ni-sepharose. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל לנתיב). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. משאבים טיהור Q של eluate Ni-sepharose. עקבות הכחול מייצג את ספיגת עקבות 280nm ירוק מייצג הצפת% ש + (מקסימום 50%). השיא הראשון, elutes 20% ש + מכיל זיהומים, מוצרי השפלה Hsp104 מקופל כראוי. השיא השני העיקרי מכיל Hsp104 מקופל כראוי פעיל. ספיקה היה 1ml/min. צבע 20-50% + Q הוא 30 דקות או 5 כרכים העמודה. הבלעה: שברים שיא נפתרים על ידי ניתוח SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. SDS-PAGE ניתוח צעד מחשוף proTEV פרוטאז. שלו 6-Hsp104 מן טיהור Q משאבים טופלה פרוטאז proTEV במשך 4 שעות ב 30 ° C ולאחר מכן 16 שעות ב 4 ° C. דוגמאות היו מופרדים על ידי SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. שים לב proTEV ביקע Hsp104 נודד במהירות רבה יותר. TeV פרוטאז ו Hsp104 uncleaved היה מדולדל עם Ni-Sepharose כמתואר שלב 3.7. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. גודל-הרחקה וטיהור של Hsp104. ביקע Hsp104 היה מטוהרים עוד דרך טור 6 ג'ל Superose סינון (10/300, GE). ספיקה = 0.4ml/min. השיא בין השורות מקווקו מייצג שברים ונקווה. הבלעה: שברים שיא נפתרים על ידי ניתוח SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Assay מחדש בלוציפראז. מפוגל אגרגטים גחלילית בלוציפראז (50nm) הודגרו עם או Hsp72 ו Hsp40 (1μM) (שניהם מאוניברסיטת עיצובים Assay), Hsp104 (6μM מונומר) או Hsp104, Hsp72 ו Hsp40 עבור 90min במהירות של 25 ° C. בלוציפראז מפוגל הוא רק מחדש מלא בנוכחות שני Hsp104 ו Hsp40/Hsp72. הארה ששוחזרו נמדדת על Infinite M1000 צלחת הקורא (לטקאן). ערכים מייצגים אמצעי ± SEM (n = 3).

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ציר הזמן: עבור פעילות Hsp104 מקסימלי אנו ממליצים על ערכת טיהור כולו יושלם במהירות האפשרית. עם זאת, את מספר הצעדים טיהור הופך לוח זמנים תובעני כי לא תמיד מעשית. אם הפעולות לטיהור מתבצעות מהר ככל האפשר, את הזמן מסוף ביטוי לילה ועד 2-4 שעות של דגירה על 30 מעלות צלזיוס עם TeV פרוטאז הוא כ 9-11 שעות. מקום אחד פוטנציאלי כדי להשהות את הצעד הבא הוא מחשוף TeV. אם הכרחי, Hsp104 ניתן לצלם קפוא לאחר שלב זה, כמתואר לעיל (שלב 5.2). גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שלב 3.9) מבוצע ומיד לאחר ההפשרה ו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL תאים המוסמכת </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT מרק </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> השלם, מיני, EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות </td><td> רוש </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> סיגמא </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי (MWCO 30000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> משאבים ש - טור 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV פרוטאז </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV פרוטאז </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay עיצובים </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay עיצובים </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

טיהור hsp104, disaggregase חלבון

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 הוא hexameric AAA + חלבון 1 של שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ATP לחלבון disaggregation 20-10 (איור 1). פעילות זו מקנה שני יתרונות מרכזיים סלקטיבית. ראשית, renaturation של אגרגטים מופרעת על ידי Hsp104 מסמיך הישרדות שמרים לאחר חלבונים misfolding מדגיש שונים, כולל הלם חום 3,5,11,12. שנית, שיפוץ צולבות סיבי עמילואיד ביתא על ידי Hsp104 מאפשרת שמרים לנצל פריונים עצום (amyloids זיהומיות) כמאגר של מועיל תורשתי וריאציה פנוטיפי 13-22. למרבה הפלא, Hsp104 ישירות remodels oligomers preamyloid ו סיבי עמילואיד, כולל אלה מורכבת של חלבונים הפריון שמרים Sup35 ו Ure2 23-30. פונקציונליות זו עמילואיד שיפוץ הוא פן מיוחד של שמרים Hsp104. E. orthologue coli, ClpB, נכשל preamyloid oligomers לשפץ או סיבי עמילואיד 26,31,32. Orthologues Hsp104 נמצאים בכל ממלכות החיים חוץ, להביך, בעלי חיים. ואכן, אם תאים חיים בעלי כל המערכת האנזימטית שזוגות disaggregation חלבון renaturation (ולא השפלה) נשאר 33-35 ידוע. לפיכך, אנו ואחרים הציעו Hsp104 עשוי להיות מפותח כסוכן הטיפולי למחלות ניווניות שונות הקשורות misfolding של חלבונים ספציפיים לתוך oligomers preamyloid רעילים סיבי עמילואיד 4,7,23,36-38. אין טיפולים ישירות ליעד מינים מצטברים הקשורים למחלות אלה. עם זאת, Hsp104 מתמוסס oligomers רעילים סיבי עמילואיד מורכב אלפא synuclein, אשר מחוברים עם מחלת פרקינסון 23, כמו גם צורות של PRP עמילואיד 39. חשוב לציין, Hsp104 מפחית הצטברות חלבון מקילה ניוון מוחיים מכרסמים במודלים של מחלת פרקינסון 23 ו - 38 מחלת הנטינגטון. באופן אידיאלי, כדי לייעל את הטיפול ולמזער את תופעות הלוואי, Hsp104 יהיה מהונדסים potentiated סלקטיבי לשפץ אגרגטים ספציפי מרכזי המחלה שאלה 4,7. עם זאת, הבנה מבניים מכניסטית מוגבל של כמה Hsp104 disaggregates כזה רפרטואר מגוון של מבנים מצטברים חלבונים שאינם קשורים מתסכל אלה במאמצים 30,40-42. כדי להבין את המבנה ואת מנגנון של Hsp104, חיוני ללמוד את חלבון טהור מחדש פעילות disaggregase שלה עם רכיבים מינימליים. Hsp104 הוא חלבון 102kDa עם לצרכן של 5.3 ~, אשר hexamerizes בנוכחות ADP או ה-ATP, או בריכוזים בחלבונים בהעדר 43-46 נוקלאוטידים. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור טיהור של פעיל ביותר, Hsp104 יציב מ E. coli. השימוש E. coli מאפשר פשוטה בקנה מידה גדול ייצור השיטה שלנו יכולה להתבצע במהירות ובאופן אמין עבור Hsp104 וריאנטים רבים. פרוטוקול שלנו מגדילה Hsp104 טוהר מפשט הסרת 6-התג שלו לעומת שיטת טיהור הקודם מתוך ה coli 47. יתר על כן, פרוטוקול שלנו הוא קליל ונוח יותר מאשר שני הפרוטוקולים מאוחרים יותר 26,48.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה בין<em&gt; א coli</em&gt; ואחריו אניון מטבע כרומטוגרפיה, His6, תג עם הסרת פרוטאז TeV, וגודל-הדרה כרומטוגרפיה.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 הוא חלבון AAA+ הקסמרי משמרים, אשר מקשר בין הידרוליזה של ATP לבין פירוק אגרגטים של חלבונים (איור 1). פעילות זו מקנה שתי תכונות מפתח...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק כמויות גדולות של חלבון HSP 1 0 4 A בעל פעילות דה-אגרגציה (deaggregate) גבוהה. זאת משיגים תחילה על ידי ביטוי של HSP 1 0 4 בתאי e coli שעברו אופטימיזציה של הקוד. לאחר מכן, חלבון ה-HS P 1 0 4 מטהר באמצעות תג זיקה להיסטידין (histidine affinity tag), ולאחריו עמודת חילוף יונים.לאחר כרומטוגרפיית חילוף יונים, תג ההיסטידין מנוקע באמצעות פרוטאז TEV. שלב הטיהור הסופי הוא העברה של חלבון ה-HSP 1 0 4 המנוקע דרך עמודת סינון ג'ל.בסופו של דבר, משמש בדיקת הפעלה מחדש של Elif כדי לקבוע אם HSP 1 0 4 פעיל טוהר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים הוא מספר קטן של שלבים לצד תפוקה גבוהה של HSP 1 0 4 פעיל מאוד, המתאים למחקרים מבניים ומכניסטיים. אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שמרבית שלבי הטיהור מתבצעים ביום אחד, דבר המוביל ללוח זמנים תובעני.לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו את כל התמיסות הדרושות לניקוי HSP 1 0 4 כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה. כמו כן, בצעו ביטוי של חלבון HSP 1 0 4 למשך לילה ב-e coli לפי ההליך המפורט בטקסט; לאחר הביטוי, אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה. השביהו מחדש את משקעי התאים ב-10 milliliters של תמיסת ליזיס מקוררת מראש; לפני ליזיס התאים באמצעות הומוגניзатор French press, ודאו שכל גשמי התאים הומסו. לאחר שיווי המשקל של ההומוגניзатор עם תמיסת הליזיס, בצעו ליזיס לתאים באמצעות שני מעברים דרך הגליל.בלחץ של 15,000 עד 18,000 PS, אני מסיר את שיירי התאים באמצעות סבוב (צנטריפוגציה) ושומר את הנוזל העליון (סופרנטנט) להמשך הניקוי. התחל את ניקוי ה-HSP 1 0 4 על ידי ערבוב הנוזל העליון עם תרחיץ של 50% של באפר ליזיס המאוזן עם חרוזי ניקל SRO. סובב את הדגימה באיטיות למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כך שהחרוזים יישארו תלויים באופן אחיד והקצף יסוים ככל האפשר.לאחר האינקובציה, אספו את כדורי הניקל באמצעות צנטריפוגה. שטפו את כדורי הניקל שהופקו ב-25 נפח-עמודה של תמיסת שטיפה. אספו את החרוזיים שוב באמצעות צנטריפוגה, ולאחר מכן ניתן להסיר את תמיסת השטיפה באמצעות שאיבה.לאחר מכן, שטפו את החרוזיים בחמישה נפחי עמודה של בופר שטיפה עם potassium chloride בריכוז one molar, ולאחריהם ב-25 נפחי עמודה של בופר שטיפה. כדי להשכיח את HSP 1 0 4, ערבבו את ה-nickel sphero speeds עם בופר השכיחה וסובבו בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.הפרידו את החרו지를 מהאלואט על ידי סבב צנטריפוגה דרך עמודות סינון (Spin columns) ריקות בנפח 1.2 milliliter. כל ליטר של תאים מניב כ-15 milligrams של HSB 1 0 4.בשלב זה של הטיהור, רכז את האלוואט לנפח של בערך 1.5 milliliters באמצעות יחידות ריכוז צנטריפוגליות עם סף משקל מולקולרי של 30, 015 milliliters. לאחר מכן, הוסף 14.5 milliliters של בופר Q כדי לדלל את החלבון פי עשרה.חזור על תהליך זה שלוש פעמים מול תמיסת בופר. החלף את החלבון לפני טיהור HSP 1 0 4 באמצעות כרומטוגרפיית חילוף אניונים. סנן את החלבון דרך מסנן מזרקה של 0.22 micromolar בעל קישור חלבון נמוך.לאחר מכן, הזרק את החלבון לעמודת Resource Q בנפח של 6 מיליליטר ששומשמה עם buffer Q. שטוף חלבונים הנקשרים באופן חלש באמצעות נפח עמודה אחד של 20% buffer B, ואלוא את HSB 1 0 4 באמצעות גרדיאנט ליניארי לאורך חמישה נפחי עמודה תוך איסוף פרקציות של 1 מיליליטר; HSB 1 0 4 ורוב הווריאנטים נאלואים בדרך כלל בריכוז של כ-400 millimolar sodium chloride. כדי להסיר את תג ההקסה-היסטידין, העבר את החלבון באמצעות מרכז מזןצנטריפוגי, ובצע כריתה של התג באמצעות TEV protease בהתאם להוראות היצרן.בצעו את השחליל (cleavage) בטמפרטורה של 30 °C למשך שעתיים עד ארבע שעות, ולאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו שאריות של HSB 1 0 4 המסומן בתג hexa histidine ושל TEV protease באמצעות nickel SROs, על ידי הוספת חרו지를 בכמות עודפת ביחס לכמות ה-HSP 1 0 4 בתגובת השחליל. לאחר מכן, הסירו את החרו지를 מהדגימה באמצעות צנטריפוגציה דרך עמודי ספין (spin columns) ריקים.כדי להתכונן לשלב הטיהור הסופי, העבירו את החלבון לתמיסת באפר להפרדה לפי גודל (size exclusion buffer) באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות עם סף משקל מולקולרי של 30,000, לאחר סינון דרך מסנן מזרק של 0.22 micromolar בעל קישור נמוך לחלבונים. טהרו את HSP 1 0 4 באופן נוסף באמצעות כרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) תוך שימוש בתמיסת באפר להפרדה לפי גודל.עמודת super oxo 6 מאוזנת. בצע את הרצת ה-FPLC בהתאם להוראות היצרן. לאחר הטיהור, אסוף את פראקציוני ה-HSP 104 ורכז אותם ביחידות ריכוז צנטריפוגליות; בשל אובדן חומר במהלך הפרדת תוצרי פירוק וזיהומים של HSP 104, התנובה הסופית של HSP 104 מטוהר באורכו המלא היא כ-1 עד 3 milligrams לליטר של תרבית התחלה.כאן מוצג ניתוח SDS page של טיהור באמצעות סבירה (affinity) של ניקל. חלבון HSP 1 0 4 בעל תג histidine במשקל 105 kilodalton נראה בדגימות שנלקחו מהליזאט (lysate), מהעמסה על החרוזיים (bead load), מהזרימה דרך החרוזיים (bead flow through) ומהאלוציה מהחרוזיים (bead eit). שימו לב שלא כל ה-HSP 1 0 4 מסוגל להיקשר לניקל; לאחר כרומטוגרפיית סבירה לניקל מבוצעת הפרדה יונית (ion exchange) בעמודה מסוג resource queue.הקו הכחול מייצג בליעה באורך גל של 280 ננומטר והקו הירוק מייצג את אחוזו של בופר B. השיא הראשון, שנשפך בריכוז של 20%B, מכיל זיהומים, תוצרי פירוק ו-HSP 1 0 4 מקופל באופן שגוי. השיא העיקרי מכיל HSP 1 0 4 מקופל ותפקודי כפי שעולה מניתוח SDS page לאחר הפרדה יונית. חלבון ה-HEXA histamine HSP 1 0 4 עובר שחרור של ה-hiss tag על ידי עיכול באמצעות pro TV protease.שימו לב כי HSP 1 0 4 שנוקה על ידי prot v נדלל במהירות רבה יותר מהחלבון המסומן ב-hexa histidine. לאחר מכן, HSP 1 0 4 הנוקה טוהר באופן נוסף באמצעות עמודת סינון ג'ל AUP O six. השיא בין הקווים המקווקווים מייצג את הפראקציות המאוצרות.מוצגות כאן תוצאות מבדיקת הפעלת לוסיפראז מחדש, המשמשת להערכת פעילות הדיס-אגרגציה (פירוק צברים) של HSP 1 0 4; צברי לוסיפראז של גחלילית שעברו דנטורציה דגרו עם HSP 40 ו-HSP 72, HSB 1 0 4, או HSP 1 0 4, HSP 40 ו-HSB 72. לוסיפראז דנטורי מופעל מחדש באופן מלא רק בנוכחות HSP 1 0 4 וגם HSP 40 ו-HSP 72, כפי שמעידה העלייה הגדולה בלומינסנציה. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים פרוטוקול זה ביומיים אם הוא מבוצע כראוי.

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

מקור: Murata, T., et al. טיהור חלבון בעל מסה מולקולרית גבוהה בסטרפטוקוקוס מוטנס. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין המופרש מסטרפטוקוקוס מוטנס.

נוהל לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין מסטרפטוקוקוס מוטנס

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

למד טיהור Hsp104, דיסאגרגאז חלבוני מסוג AAA+, מתוך שמרים באמצעות כרומטוגרפיית חילוף אניונים וכרומטוגרפיית ג'ל. שיטה זו מייצרת חלבון פעיל בכמויות גדולות לחקר מבנה ומנגנון.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

גלה סרטונים נוספים