כימות קוצים דנדריטיים באמצעות הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית

קחו נוירונים פירמידליים שעברו התמרה ותווית חיסונית לירוק פלואורסצלי.

רכוש תמונות של הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם הגדרות מותאמות כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית.

פתח תמונה באמצעות תוכנה מיוחדת והשתמש במסנן גאוס כדי להפחית את רעשי הרקע.

בצע מעקב דנדריטים חצי אוטומטי על ידי הערכה תחילה של קוטר הדנדריטים. לאחר מכן, בחר את נקודת ההתחלה, הנתיב ונקודת הקצה של הדנדריט.

לפילוח אוטומטי של עמוד השדרה, בחר בנה מחדש את קוטר הדנדריט והגדר את סף נפח הדנדריטים כדי לייצג את נפח הדנדריטים בפועל.

ציינו ערכים לקוטר ראש השדרה הקטן ביותר ולאורך השדרה המרבי.

התאם את הסף לנקודות המייצגות עמודי שדרה, והבטיח את מיקומם על ראשי עמוד השדרה בפועל.

הגדר פרמטרים לסיווג הקוצים על סמך אורך, קוטר ראש וצורה.

צור מודל תלת מימד של הדנדריט עם קוצים וייצא את הנתונים להמשך ניתוח.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, בחר לפחות 10 נוירונים בריאים לכל מצב עם מורפולוגיה פירמידלית וארבוריזציה דנדריטית מלאה. כדי לכמת 60 עד 100 מיקרומטר לדנדריט, רכוש תמונות עם מטרת שמן 40x, NA 1.3 ולייזר של 488 ננומטר עם הספק שיא טיפוסי ברמת הדגימה סביב 20 מיקרו-וואט.

הגדר את גודל הפיקסלים סביב 80 ננומטר כדי לדגום כראוי קוצים דנדריטיים. כדי לדגום את כל נפח הנוירונים, רכשו ערימת Z עם מרווח z בין 150 ל-300 ננומטר, והניבו פרוסות של 20 עד 30 z. כד