עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה
9 בספטמבר 2011
שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להזרה שתלים כלי דם עם תאי פרוגניטור אנדותליאליים המופקים מדם עצמי, ולאחר מכן לבחון את השפעת טיפול זה על תרומבוזה במודל של בעל חיים גדול. זאת מושג על ידי השגת דגימת דם פריפריה מחזירים כדי לבודד תאי פרוגניטור אנדותליאליים של חזיר בעלי צמיחה מאוחרת (late outgrowth). לאחר מכן, מכשיר הניתן להשתלה.
במחקר הוכחת ההיתכנות שלנו, פחית הטיטניום מוחדרת יחד עם תאי PC אוטולוגיים. לאחר מכן, המכשיר מושתל בווריד החלול התחתון של החזיר. התוצאות מראות הגנה מפני תרומבוזה, בהתבסס על הפתוחו של צינור הטיטניום שבו הושבצו EPC, בניגוד לקבוצת הביקורת ולצינור המתכת החשוף שהיה חסום.
המחלקה לכירוגיה באוניברסיטת Duke מחויבת לקידום מחקר פורץ דרך וחדשני. המצגת הבאה היא דוגמה אחת לאופן שבו אנו פועלים בין מחלקות ודיסציפלינות שונות כדי להקדם את הרפואה. ד"ר EK מובילה מאמץ מחקרי לפיתוח טכנולוגיה להשקעת תאים, אשר תמנע תרומבוזה על ידי ציפוי המשטח הבא במגע עם הדם של מכשירים וסקולריים בתאי פרוגניטור של המטופל עצמו.
מכיוון שתאים אלו הופקו מאותם מטופלים שיקבלו את השתל, אנו מונעים דחייה על ידי מערכת החיסון. ההצלחה שלנו והשיטות המתוארות כאן הן תוצאה של מאמץ צוותי רחב. ההשתלה הכירורגית תודגם על ידי Sean Gage מהמחלקה לכירורגיה וסקולרית, Whitney Lane, סטודנטית לרפואה מאוניברסיטת Duke, והנדו בעצמי.
אני מבקש להכיר כעת את אלכסנדר ינסן (Alexander Janssen), סטודנט לדוקטורט מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית, שיוביל אותנו דרך תהליך זריעת התאים. אני אדגים בפירוט כיצד לזרוע צינורות טיטניום עם תאי EPC (תאי פרוגניטור אנדותליים) המופקים מדם, רגע לפני השתלה במודל של חזיר. שיטה זו משמשת כהוכחת היתכנות, ואותם עקרונות בסיסיים ניתנים ליישום במכשירים להשתלה רבים אחרים, כגון סטנטים מניטינול ומכשירים מסייעים למערכת ההסעה של הדם. תאי EPC מבודדים על ידי זריעת פראקציית התאים חד-גרעיניים של דם חזיר, ובדרך כלל מופיעים לאחר כに取り שבעה ימים.
ניתן לזהות אותם לפי המורפולוגיה האופיינית שלהם, הנראית כריצוף אבנים (cobblestone). הרחב את ה-EPCs עד למספר כולל של 9 מיליון תאים בתרבית. שטוף את ה-EPCs שהוכנו פעמיים במצע נטול סרום, תוך הקפדה להגביל את חשיפתם לאור במהלך הסימון ואחריו.
לאחר מכן, כסו את התאים בתג fluorescent, PKH 26, ורשמו את כמות התמיסה שהוספה. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. עצרו את תגובת הסימון על ידי הוספת נפח שווה של סרום חזיר לתמיסת הצבע דקה אחת לאחר מכן.
דללו את התמיסות המשולבות ביחס של אחד לאחד עם מצע גידול מלא. לאחר מכן, שאבו את הנוזל ושטפו את התאים שלוש פעמים עם מצע גידול מלא, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות עם DPBS ללא סידן או מגנזיום כלוריד. בשלב הבא, כסו את התאים בטריפסין, תוך רישום הנפח שנעשה בו שימוש, והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר שלוש דקות של דגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים ניתקו, ובמידה וכן, הוסף כמות כפולה של תמיסת נטרול טריפסין מזו שהוספה קודם לכן. לאחר נטרול הטריפסין, איחד את תמיסות התאים למבחנה אחת ומדוד את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר. לבסוף, השק תמיסות התאים וסספנד תחתם מחדש בלפחות 4.5 milliliters של מצע ללא סרום.
לאחר הכנת החזיר לניתוח, בצעו חתך בקו האמצע באמצעות להב סקלפל מספר 15, החל מהזוג השני של בלוטות הזיכרון. התקדמו בזהירות לעבר הזוג הלפני-אחרון באמצעות קוואטרים חשמליים. המשיכו בדיסקציה עד להסיר הבטני (abdominal fascia).
הרם את הפריטונאום באמצעות פינצטת נשכים (mosquito forceps) והחדר אליו בזהירות מספרי מטסנדל (metzendahl scissors), הוצא את שלפוחית השתן החוצה והנח תפר מסוג purse string בחוט Vicryl 3-0 בדופן השלפוחית. בצע חתך קטן במרכזו והחדר קטטר פולי (Foley catheter) במידה 16 French אל תוך החתך. לאחר מכן, ניתן נוזלים תו-ורידיים כדי לווסת את תפוקת השתן לרמה של לפחות 1 ml לקילוגרם לשעה במהלך הניתוח.
בשלב הבא, הוציאו החוצה את המעי המורחב הקטן והניחו שני רטרקטורים כירורגיים מסוג bour כדי לחשוף את ההיבט האחורי של חלל הפריטונאום וזהו את ה-IVC באמצעות דיסקציה חדה ועמומה. שחררו בזהירות את ה-IVC מרקמות סביבו. לאחר מכן, בצעו שלדון (skeletonization) של כלי הדם החל מהעורק הכליתי הימני, פרוקסימלית למסעף של ה-IVC, ועד לקצה הדיסטלי.
יש לנהוג בזהירות יתרה במהלך נתיחה של ה-IVC, שכן אפילו פגם קטן מאוד ב-IVC עלול להוביל לדימום מהיר ולהוצאת דם של בעל החיים. יש לקשור את כל הענפים הצדדיים של מקטע ה-IVC, תוך הקפדה מיוחדת על נתיחה וקישור של שני הוורידים הלומבליים האחוריים הגדולים שמיקומם פרוקסימלי מידית למסעף של ה-IVC. לעיתים קרובות קיים וריד לומבלי גדול בצד האחורי.
נשפו את הווריד הזה בחופשי ושלטו בו באמצעות לולאות כלי דם (vessel loops). כעת, במקביל לניתוח, התחילו בזריעה של התשתית בתאי EPCs לפני תחילת הליך זה. פיגומים להשתלה של רקמות צינור טיטניום חייבים להיות מורכבים במלואם ומוכנים לשימוש בשטח סטרילי.
פתחו את מכלול צינור הטיטניום שעקר בקוואס בתוך מזרק של 5 cc. לאחר מכן, הסירו את הבוכנה מהמזרק של ה-5 cc, אך אל תשליכו אותה. הצמידו מכסה קבוע למזרק. השתמשו בפיפטה כדי למלא את המזרק בתמיחת ה-EPC.
לאחר מכן החזירו את הבוכנה. הסירו את הפקק והחדירו את קצה הפיתיון של המזרק לתוך צינור הסיליקון הפתוח של המכלול עד שיהיה הדוק. אך לא מעבר לכך, הסירו בועות על ידי דחיפה איטית של תמיסת התאים עד שתגיע לחלק העליון של ראש המכשיר.
לאחר מכן, סגרו את המכלול באמצעות פקק Luer והדביקו אותו בתוך כפפה סטרילית. הכניסו את המכלול כולו למחזיק מזרקים מעובד והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. השתמשו במד כדי לוודא שתאי ההשכבה נמצאים במפלס, ואפשרו למכלול להגיע לדגירה תוך סיבוב עדין.
המשך בניתוח מיד לאחר קשירת ה-IVC על ידי מתן 100 יחידות heparin לכל קילוגרם של חזיר. לאחר מכן, סגור מיד את ה-IVC באמצעות תפסן (clamp) בזווית של 45 מעלות באופן דיסטלי על ה-IVC והורי הלומבריים, ולאחר מכן באופן פרוקסימלי. בשלב הבא, השתמש בלהב סכין מספר 11 ובמספרי blunt כדי לבצע פתיחה אורכית של הווריד (vein otomy) באורך של 4 סנטימטרים בין התפסנים הפרוקסימליים והדיסטליים.
רוקנו כל דם מה-IVC ושטפו את לומן הפנימי שלו עם DPBS סטרילי. כעת הכניסו ל-IVC את השתל המכיל EPC או בקרת מתכת חשופה כדי למנוע מהתאים להתייבש ולרוקן אוויר. מלאו את ה-IVC ב-DPBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.
לאחר מכן, סגרו את הפתוח בווריד (vein otomy) באמצעות תפר רציף של פרולין 4-0, והסירו סבסב פרוקסימלי אחד כדי לנקז אוויר מה-IVC באמצעות כמות קטנה של דימום לאחור. לאחר הדימום, הסירו את הסבסב הדיסטלי כדי לשמור על השתל במקומו. הצמידו תפר קיבוע (stay suture) לתוך צינור ה-PVC העובר דרך דופן הווריד.
סגרו את הפסציה באמצעות OPDS על מחט CT. סגרו את השכבה התת-עורית בתפר רץ של Vicryl 2-0. לאחר מכן, סגרו את העור באמצעות סיכות.
הנח עד 20 milliliters של 0.25%Marcaine תת-עורית לאורך אתר החתך וכסה את הפצע בגזה וב-Tegaderm להפגת כאבים. תן flu Nixon ו-oxymorphone תת-עורית לפי הצורך. הפסק את ההרדמה וכאשר החזיר יתעורר, החזר אותו לכלובו במהלך שבעת הימים הבאים.
יש למתן atri מדי 24 שעות כפרופילקסיס אנטיביוטי, ולהבטיח שטלאי הפנטניל שהוחל לפני הניתוח יישאר הדוק למשך שלושה ימים בסך הכל. לאחר שלושה ימים, הוצאו שתלי צינור הטיטניום שהוצבו ונבדקו המשטחים הפנימיים. תחת אורך גל עירור של 550 nanometer, נמצאה שכבה רציפה של תאים מסומנים פלואורסצנטית בתוך צינור אחר.
תאי החתכים נצבעו בנוסף עם סמן להיבמה של תאי אנדותל טבקיים כדי להדגים את גבולות התאים. ניתן להשתמש במגוון רחב של צבעים בהליך זה. בניגוד לכך, שתל צינור טיטניום חשוף נחסם לחלוטין בסביבת גזירה נמוכה פרו-תרומבוטית בווריד הרחב התחתון (inferior vena cava).
כפי שמוצג בתמונות A ו-C, צינור הטיטניום שבו מושב התא מוצג בתמונה B ונותר נקי מקרישים לאחר הליך בידוד התאים שלנו עם דם שיא. EPC מופיעים לאחר ממוצע של שבעה ימים בתרבית. בעת ביצוע ההליך הכירורגי, חשוב מאוד לבצע שלדון (skeletonize) של ה-IVC בזהירות וברוגע, שכן אפילו הקרע הקטן ביותר ב-IVC או בענפיו הצדדיים עלול להוביל לדימום מאסיבי של החזיר. בעקבות הליך זה, חומרים אחרים הבאים במגע עם דם יכולים לעבור אנדותליזציה מהירה כדי למנוע תרומבוזה.
סטנטים וסקולריים אנדותליאליים, למשל, עם תאי EPCs שלנו, מחקים את הריפוי הטבעי של דופן כלי הדם ועשויים למנוע היצרות חוזרת (re-stenosis) ותרומבוזה לאחר פיתוחם. טכנולוגיית ה-quick see שלנו תאפשר ציפוי של מכשירים תוך-כליים בתאי אב אנדותליאליים המופקים מדמו של המטופל תוך דקות בחדר הניתוח או במעבדה לצנתורים. לפיכך, אין צורך בתרבית ממושכת exvivo.
הזמן המושקע במכשיר עצמו נמנע, והטכנולוגיה הופכת למעשית להטמעה בפרקטיקה הקלינית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לזריעה של חומרים ביו-חומרים מטיטניום הבאים במגע עם דם באמצעות תאי פרוגניטור אנדותליאליים (EPCs) אוטולוגיים, במטרה לשפר את התאימות הביולוגית. הטכניקה כוללת זריעה מהירה של EPCs לתוך צינורות טיטניום מיד לפני השתלה כירורגית בורידי הvenae cavae של חזירים, ומדגימה פוטנציאל עבור מכשירים ביו-רפואיים שמימים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסה ביו-רפואית
- כירורגיה וסקולרית
- טיפול תאי
רקע
- ניתן להפיק תאי פרוגניטור אנדותליאליים (EPCs) מדמו של המטופל עצמו.
- שימוש בתאים אוטולוגיים מפחית את הסיכון לדחייה חיסונית.
- תרומבוזה היא סיבוך משמעותי בהשתלות כלי דם.
- מחקרים קודמים הראו כי EPCs יכולים לשפר את התאימות הביולוגית של השתלים.
מטרת המחקר
- ב celu זריעת תאי EPC אוטולוגיים על שתלים וסקולריים.
- ב celu הערכת השפעת טיפול ב-EPC על תרומבוזה במודל של בעלי חיים גדולים.
- ב celu פיתוח טכנולוגיה לזריעת תאים המשפרת את ביצועיהם של מכשירים וסקולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של EPCs חזירים בשלב צמיחה מאוחר (late outgrowth) מדגימות דם פריפריאלי.
- זריעה של EPCs בתוך צינורות טיטניום לפני ההשתלה.
- השתלה כירורגית של צינור הטיטניום הזרוע ב-EPCs לתוך הווריד החלול התחתון של החזיר.
- הערכת תהליכי תרומבוזיס על בסיס הפתיחות (patency) של המכשיר המושתל.
תוצאות עיקריות
- הצינור מטיטניום שעליו נזרעו EPC הפגין הגנה מפני תרומבוזה.
- התוצאות הצביעו על שיפור בפתוחות בהשוואה לצינורות מתכת חשופים של קבוצת הביקורת.
- השיטה הדגימה היתכנות עבור התקנים להשתלה אחרים.
- שיתוף פעולה בין מחלקות שיפר את תוצאות המחקר.
מסקנות
- זריעת שתלי טיטניום עם תאי EPCs אוטולוגים היא גישה מבטיחה להפחתת תרומבוזה.
- ניתן להתאים טכניקה זו למגוון מכשירים ביו-רפואיים.
- נדרש מחקר נוסף כדי לייעל את השיטה ולהעריך תוצאות ארוכות טווח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לאתגר קריטי בפיתוח מכשירים קרדיווסקולריים: סיבוכים תרומבוטיים הנובעים ממשטחים מלאכותיים הבאים במגע עם דם. על ידי מתן אפשרות לזריעה מהירה של תאי EPC (תאי פרוגניטורים אנדותליאליים) אותולוגים על שתלי טיטניום מיד לפני ההשתלה, הטכנולוגיה מציעה דרך לשיפור הביו-תאימות ולהפחתת הסיכון לתרומבoze בבדיקות פרה-קליניות. הגישה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מכשירים וסקולריים על ידי אספקת ציפוי אנדותליאלי בעל רלוונטיות פיזיולוגית המופק מהמטופל במודל של בעל חיים גדול, ובכך היא מגבירה את הביטחון בניבוי של הערכות מכשירים בשלביהם המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנונים תרומבוגניים באמצעות השוואה בין משטחי מתכת חשופים למשטחים שעליהם זרעו EPC בסביבה תרומבוגנית.
- ערך תפעולי: מספק מודל הניתן לשחזור להערכת יעילות האנדותליזציה והעמידות לתרומבוזה של חומרי ביו-מטריאל מועמדים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של כיסוי אנדותליאל ופתוחות (patency) לצורך סריקה השוואתית של מכשירים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של נהלי זריעה והשתלה של EPC לתמיכה בהעברה של בדיקות בין מעבדות ברמת דיוק גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים היווצרות תפקודית של שכבת אנדותל ושמירה על פתוחות (patency) במודל בעלי חיים גדול בעל רלוונטיות קלינית.
- ערך תפעולי: מגשר בין הכנת תאים in vitro לבדיקת ביצועים in vivo, ובכך מאפשר קבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכונים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי תמיכה בתיקוף ביולוגי מוקדם של חומרים למכשור קרבי לפני זיהוי המועמדים (leads) ואופטימיזציה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על אסטרטגיות לנדוותלציה במטרה להפחית סיכון לתרומבוזה בעיצוב מכשירים.
- סריקה: מאפשרת הערכה סטנדרטית של שינויים פניים באמצעות נקודות קצה כמותיות של כיסוי אנדוותלי ופתוחות המכשיר.
- אנליטיקה: מספקת כימות מבוסס פלואורסצנציה של כיסוי EPC וחסימה תרומבוטית כמדדי השוואה מרכזיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מקור תאים אוטולוגיים לבין ביצועי המכשיר במודל של IVC בחזירים, ובכך תומכת ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת אסטרטגיות נדוותלציה במגוון סוגי מכשירים (למשל, סטנטים, מכשירים לסיוע לבבי).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את תיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב אינטראקציות בין דם למכשיר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד, סימון והזרעה של EPC.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים מוקדמים על עמידות לתרומבוזה, ובכך מפחית את הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים למכשירים בהתבסס על פוטנציאל אנדותליזציה ופרופילי תאימות ביולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, סימון פלואורסצנטי וטכניקות של כירורגיה וסקולרית.
- תלוי בציוד לטיפול סטרילי בתאים, אינקובטורים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצורך תיקוף.
- מחייב סטנדרטיזציה רב-תחומית בין צוותי עיבוד התאים לצוותים הכירורגיים לצורך השתלה במועד.
- הסתגלות לביומטריאלים חלופיים (למשל, nitinol, פולימרים) עשויה לדרוש אופטימיזציה של שינוי פני השטח.
- מוגבל על ידי לוח הזמנים של התרבית ex vivo להרחבת EPC, אשר חייב להיות מתואם עם תזמון הניתוח.
