אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 2:35 דק׳ • June 17th, 2025
התחל עם תרבית דבקה של אסטרוציטים ראשוניים של עכברים על כיסוי בתוך צלחת תרבית.
דגירה עם בדיקה חומצתית פלואורסצנטית החוצה קרומי תאים שלמים כדי להיכנס לאסטרוציטים.
הגשושית מצטברת באופן סלקטיבי בתוך שלפוחיות אנדוליזוזומליות חומציות ומסמנת את השלפוחיות באופן פלואורסצנטי כדי לפקח על הובלתן.
שוטפים כדי להסיר עודפי בדיקה ולהוסיף מדיום טרי.
הנח את התרבית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי והתמקד בתא בודד לביצוע הדמיית זמן-lapse.
דמיין את המטען המסומן כפונקטה פלואורסצנטית המופץ בתוך האזור הפר-גרעיני
, ציטוזול ותהליכים אסטרוציטיים.
לכוד מישורי מוקד מרובים לאורך ציר ה-Z כדי לדמיין מטען בכל נפח התא התלת-ממדי.
לבצע הדמיה במרווחי זמן מוגדרים כדי לעקוב אחר הובלת המטען התוך-תאי בעומקים שונים בתוך האסטרוציטים.
נתח את תנועת המטען כדי להבחין בין מטען נייח, מטען הנע לכיוון פריפריית התא ומטען הנע לכיוון הגרעין.
30 דקות לפני ההדמיה, יש לדלל בדיקה מתאימה לתיוג ליזוזומלי ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית אסטרוציטים לריכוז עבודה של מיקרומולר אחד, ולסמן את האסטרוציטים עם הגשושית למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת במדיום תרבית אסטרוציטים חם והחליפו את הכביסה במדיום הדמיה.
מיד לאחר תיוג הבדיקה, הנח את מיכל תרבית האסטרוציטים במתאם המתאים בשלב המיקרוסקופ. ובאמצעות אור אפיפלואורסצנטי, אתר את התאים המבטאים חלבו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים