הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) עשיר myofibroblasts להציג בתוך stroma הגידול, לשחק תפקיד מרכזי נהיגה התקדמות הגידול. פיתחנו מודל הגידול coimplantation xengraft עבור ניסיוני להפקת CAFs מן fibroblasts החלב האנושי. הפרוטוקול מתאר כיצד להקים myofibroblasts CAF כי תרכוש את היכולת לקדם tumourigenesis.

סרטון זה מתאר הליך ליצירת פיברובלסטים או עגלים הקשורים לקרצינומה מזיכרון אנושי מתורבת ראשונית. קרצינומות פיברובלסטים הן רקמות מורכבות המורכבות מתאים ניאופלסטיים ותא לא סרטני המכונה סטרומר. סטרומה S הקשורה לגידול מורכבת ממטריצה חוץ-תאית ומגוון תאי סטרומל, כולל פיברובלסטים, מיופיברובלסטים, תאי אנדותל, טפילים ולויקוציטים הקשורים לפיברובלסטים הקשורים לקרצינומה עשירים במיופיברובלסטים, סימן היכר של פיברובלסטים פעילים הקיימים בתוך הגידול.

סטרומר ממלא תפקיד מרכזי בהנעת התקדמות הגידול. ניתן לייצר אותם במבחנה על ידי בידוד ראשון של פיברובלסטים ראשוניים של חלב אנושי מרקמת שד בריאה המתקבלת על ידי ניתוח ממופלסטיקה להפחתת ממופלסטיקה. הרקמה המתקבלת מפורקת לתרחיף תא בודד, ואז עוברת מוות על ידי התמרה ויראלית ומהונדסת לבטא GFP וגן עמידות לפורם מיצין.

לאחר מכן מזריקים את התאים יחד עם קרצינומה של השד האנושי. MCF שבעה תאי RAs תת עוריים לעכבר חסר חיסון. הפיברובלסטים של הזיכרון האנושי המוזרקים יתפתחו למיופיברובלסטים מקדמי גידול

לאחר מכן מופקים הפיברובלסטים של החלב ההומור ההורי מהשתלות גידול ומתורבתים בנוכחות פור מיצין. הניתוח האימונוהיסטוכימי של תאים עמידים לפור מיצין הנקראים עגלים שנוצרו בניסוי או עגלים אקס מגלה כי פיברובלסטים של זיכרון אנושי תקין הקיימים בתחילה מתפתחים למיופיברובלסטים של עגלים בתוך קסנוגרפט הגידול שרכשו את היכולת לקדם גידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו בשיטה קיימת כמו מיצוי עם קלוריות ראשוניות מחולה סרטן השד הוא שאנו זכאים לייצר עגלים באופן ניסיוני מפיברובלסטים בשד אנושי באמצעות גידול השתלה משותפת.

המודל הכללי להדגמת ההליך יהיה קאר, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ואחמד קאר, דוקטורנט במעבדה. התחל עם גרם אחד של רקמת שד אנושית בריאה שנותחה מניתוח ממופלסטיקה להקטנה. שטפו את הטישו מספר פעמים ב-PBS, ואז הניחו את הרקמה בצלחת פטרו בגודל 15 סנטימטר והשתמשו בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון אותה לשברים קטנים בגודל של פחות מ-1.5 מילימטר בקוביות.

לאחר מכן, השתמש בסכין הגילוח כדי להעביר את שברי הרקמה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה של תאים לכל חצי גרם רקמה. ואז מערבולת למשך דקה אחת במהירות מרבית. הניחו את הצינור על נדנדה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ואפשרו לשברי הרקמה להתעכל במשך 12 עד 18 שעות.

למחרת עדיין יישארו חתיכות רבות של שברי רקמה לא מעוכלות במערבולת הצינורית. תחילה במהירות מרבית, הניחו את הצינור על הספסל ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה פיזיולוגית של חמישה מיליליטר כדי להעביר את ה-SUP המועשר בתאי סטרומה שנוצר לתוך צינור חרוטי חדש.

לאחר מכן צנטריפוגה את השבר הסטרומלי למשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 250. לאחר הסיבוב, השהה מחדש את פלוס התא ב-PBS, ואז צנטריפוגה את הרווח שלך למשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 250. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-DMEM בתוספת 10% FCS והעבירו אותם לצלחת פטרי של 15 סנטימטר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שמונה עד 10 ימים, התא צריך להיות קונפלואנט. בשלב זה נקצרים התאים וניתן להקפיא אותם לאחסון לטווח הארוך.

כדי להנציח את הפיברובלסטים הראשוניים של הזיכרון הנורמלי האנושי שבודדו, הציגו וקטור P MIG רטרו-ויראלי המבטא גם H turt וגם תרבית GFP, התאים למשך ארבעה עד חמישה ימים ולאחר מכן מיינו את התאים החיוביים ל-GFP באמצעות זרימה ציטומטרית. הכנס מבנה P babe puro רטרו-ויראלי המקודד גן עמידות טהור למייצין לתוך תרבית פיברובלסטים אימורטליים המסומנת GFP. התאים במשך חמישה עד שבעה ימים בנוכחות מיצין טהור בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר.

כדי לבודד את ה- GFP שכותרתו PUR עמיד לביצין פיברובלסטים של זיכרון אנושי. לאחר מכן לבחון האם הפיברובלסטים מייצרים נגיפים פעילים, מה שיכול להוביל להעברה אופקית של גנים המקודדים GFP ועמידות לפור מיצין. גדל 2.5 כפול 10 לחמישה פיברובלסטים של זיכרון אנושי עמידים לפור מיצין בצלחת פטרי של שישה סנטימטרים למשך יומיים.

אסוף וסנן את המדיום המותנה של הפיברובלסטים עם מסנן מזרק בגודל נקבוביות 0.45 מיקרון. לאחר מכן הוסיפו ל -10 תאי פיברובלסטים של עכבר ותרבית למשך 12 שעות בנוכחות חמישה מיקרוגרם למיליליטר חלבון גופרתי, מה שמגביר את יעילות הזיהום בנגיף לאחר שחלפו 12 שעות. שנה את המדיום ל-DMEM בתוספת 10% FCS ותרבית למשך יומיים נוספים.

בדוק את התאים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. 10 תאי T וחצי הנגועים בנגיף GFP יהיו חיוביים ל-GFP. כעת שנה את המדיום לטיפול בתאים במיקרוגרם אחד למיליליטר.

פור מיצין במשך חמישה עד שבעה ימים. שוב, התבונן בתאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע אם אוהל וחצי תאים עמידים לפור מיצין יצרו מושבות. שימו לב שהעברת הגנים האופקית על ידי נגיפים פעילים המיוצרים על ידי ה-GFP ההורי העמיד לפור מיצין המסומן פיברובלסטים של חלב אנושי עשויה להפוך את תאי העכברים ותאי הקרצינומה הרגישים לפור מיצין שמסביב.

עמיד ל-Pur mycin ו-GFP חיובי בתוך ה-xenograft של הגידול. זה עלול לעכב את תהליך הבידוד של פיברובלסטים חלביים אנושיים טהורים עמידים למיצין מהקסנוגרפט של הגידול כדי ליצור בניסוי פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה להזרקה לעכבר חסר חיסון. התחל בטריפסין וספירת קו תאי החלב האנושי שהוכן זה עתה יחד עם קו תאי קרצינומה של השד האנושי MCF שבעה RAs בצינורות אשפה מיקרו חדשים.

ראוס השהה פעם אחת 10 לשישה mc שבעה שבעה RAs תאי קרצינומה של השד האנושי ושלוש פעמים 10 לששת ה- GFP המסומנים כעמידים לפור מיצין אימורטליזצי. פיברובלסטים של חלב אנושי ב-400 מיקרוליטר של מצע תרבית עם 50% מטריג'ל להזרקה. הנח את הצינורות על קרח כבקרה.

הכינו גם את אותם פיברובלסטים של חלב אנושי ללא תאי MCF 7 RAs. לאחר מכן, באמצעות מחט בגודל 27, הזרקו את תערובת התאים לאתר תת עורי של עכבר עירום חסר חיסון כדי לבחון את השונות התוך-גידולית של פנוטיפים של עגלים. לבודד עגלים ולשלוט בפיברובלסטים מכמה השתלות גידול שונות.

לאחר מכן השתל כל תערובת באורך ימין ושמאל של כל עכבר. אפשר לגידול או לפיברובלסטים xenografts לצמוח במשך 42 יום לאחר ההזרקה. יש לייעל את תקופת הדגירה של הפיברובלסטים בתוך קסנוגרפט הגידול על סמך פנוטיפ המיופיברובלסטים הנרכש בפיברובלסטים ההורים בגידול.

כדי לחלץ את העגלים או לשלוט בפיברובלסטים מהעכבר שעבר המתת חסד, הניחו לפחות 0.5 גרם מרקמת הקסנוגרפט ולפחות 0.1 גרם של רקמת קסנוגרפט פיברובלסטים בכלים נפרדים. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון את הרקמה לשברי רקמה קטנים בגודל של פחות מ-1.5 מילימטר מעוקב. לאחר מכן השתמש בסכין הגילוח כדי להעביר את שברי הרקמה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל את מאגר הדיסוציאציה של התאים ומערבולת למשך דקה אחת במהירות מרבית, דגרו את תרחיף התא למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם צנטריפוגת תסיסה איטית רציפה לתרחיף התא.

מנותק מגידול או משתל סנו-פיברגלס למשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 250 לאחר הסיבוב. השעו מחדש את גלולת התא ב-PBS וחזרו על הצנטריפוגה. לאחר מכן השעו מחדש את פלטת התאים המתקבלת ב-DMEM בתוספת 10% FCS כדי לבודד תרבית פיברובלסטים של חלב אנושי עמיד לפור מיצין.

התאים שמקורם בגידול או בפיברובלסטים רפסודה בצלחת פטרי של 15 סנטימטר בנוכחות מיקרוגרם אחד למיליליטר. Puram mycin a 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. זה יבטל כל תאי קרצינומה מזהמים ו/או מורין.

תאי סטרומה מפיצים את התאים עד שקולואנט מאחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס באמצעות מדיום הקפאה. שימו לב כי התאים העמידים לפור מיצין המתקבלים המיועדים לתאי XP עגל אחד בן 42 יום או תאי פיברובלסטים בקרה הם בני אלמוות וחיוביים ל-GFP פיברובלסטים של זיכרון אנושי מגדילים את הגידול שלהם ומקדמים פנוטיפ מיופיברובלסטי בתוך קסנוגרפט הגידול על ידי אינטראקציה עם תאי קרצינומה במהלך התקדמות הגידול. מערבבים אחת כפול 10 לששת תאי MCF שבעה תאי RA ושלוש פעמים 10 לעגל P בן 6 42 יום.

תא אחד ב-400 מיקרוליטר של מדיום תרבית עם הזרקת כוח של 50% מטריג'ל בצינור אורף של 1.5 מיליליטר. הכינו גם שלוש פעמים 10 עד 6 42 יום פיברובלסטים בקרה תא אחד ללא תאי קרצינומה בצינור איינור כדי להגביר עוד יותר את הגידול מקדם פנוטיפים מיופיברובלסטיים של תאי עגל אקס 1 להזריק תערובת של תאים אלה עם תאי CF שבעה RAs תת עורית לעכבר עירום. כמו כן להזריק פיברובלסטים בקרה תא אחד בלבד ללא תאים סרטניים כדי להכין את תאי הבקרה במידת הצורך.

דגירה של תאי exp עגל אחד לתקופות נוספות של 200 יום בתוך קסנוגרפט הגידול כדי ליצור שני תאים exp C כדי לשפר את הפנוטיפ המיופיברובלסטי המקדם את הגידול. גם ליצור שליטה. פיברובלסטים שני תאים כבקרה נגד עגל אקס שני תאים על ידי הזרקת פיברובלסטים בקרה תא אחד ללא תאי קרצינומה לעכבר, מסירים גידולים ומניחים אותם בכלי תרבית רקמות.

לנתח ולנתק את שתל הסנו של הגידול או הפיברובלסטים לתרחיף ותרבית של תא בודד. התאים בצלחת פטרו של 15 סנטימטר עם 10% F-C-S-D-M-E-M בנוכחות פור מיצין מפיצים את התאים עד שהם משלימים את עיני הטריפסין ומאחסנים את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס באמצעות מדיום הקפאה. התאים העמידים לפור מיצין המתקבלים נקראים עגל exp בן 242 יום שני תאים או פיברובלסטים בקרה שני תאים GFP המסומנים exp עגל שניים ופיברובלסטים בקרה שני תאים שחולצו מגידול השד נותחו אימונוהיסטו כימית כפי שמוצג בתמונה זו, התאים מכתימים חיובי מאוד לסמנים מזנכימליים כולל תסיסה ספציפית לאדם פרולו ארבע הידרוקסילאז קולגן אחד A פיברונקטין S 100, ארבעה, ופיברובלסטים חלבון פני השטח.

תוצאות אלו מצביעות על מקור אנושי ואופי מזנכימלי של תאים אלה. לעומת זאת, ציטוקרטין, סמן לתאי אפיתל, לא נצבע בפיברובלסטים חיוביים ל-GFP שנלקחו יחד. ממצאים אלה מצביעים על כך שתאי EXP C שני ופיברובלסטים בקרה שני מקורם בפיברובלסטים של החלב האנושי ההורי שהוכנסו לראשונה לקסנוגרפלים של עכברים.

חשוב לציין, מספר גדל בהרבה של שני תאים של עגל XP שנצבעו חיוביים לאלפא SMA וגליקופרוטאין מטריצה חוץ-תאית לנאסין C, שניהם סמנים של מיופיברובלסטים בהשוואה לפיברובלסטים שני תאי ביקורת. שימו לב ששיעור גבוה יותר של מיופיברובלסטים חיוביים לאלפא smma קיים בתאי עגל exp שני בהשוואה לזה שנצפה בתאי עגל exp אחד בני 42 יום. נתונים אלה מדגימים כי פיברובלסטים של זיכרון אנושי תושבים מעורבים בהדרגה במיופיברובלסטים של עגלים בתוך קסנוגרפים של הגידול במהלך התקדמות הגידול לאחר התפתחותו.

מודל קסנוגרפט הגידול המשלים סלל את הדרך לחוקרים העובדים במיקרו-סביבת הגידול לחקור את תהליכי האבולוציה של פיברובלסטים נורמליים לסרטן. אז תגידו פיברובלסטים.