הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

סרטון זה מתאר פרוצדורה להפקת פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה (carcinoma associated fibroblasts או CAFs) מתרביות ראשוניות של רקמה אנושית. קרצינומות פיברובלסטיות הן רקמות מורכבות המורכבות מתאים נאוप्लाסטיים וממרכיב שאינו סרטני המכונה הסטרומה. הסטרומה הקשורה לגידול מורכבת ממטריקס חוץ-תאי וממגוון תאי סטרומה, כולל פיברובלסטים, מיופיברובלסטים, תאים אנדותליאליים, פריציטים ולבקוציטים; פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה עשירים במיופיברובלסטים, המהווים סימן היכר של פיברובלסטים מופעלים הנוכחים בתוך הגידול.

לתאי הסטרומה תפקיד מרכזי בהנעת התקדמות הגידול. ניתן להפיקם in vitro על ידי בידוד ראשוני של פיברובלסטים משדי אדם מרקמת שד בריאה שהושגה באמצעות רדוקציית ממפלסטיקה. הרקמה שהושגה מופרדת לתליה של תאים בודדים, ולאחר מכן הופכת לאלמותלית באמצעות טרנסדוקציה ויראלית והנדסה לביטוי GFP וגן עמידות לפורמיסין.

לאחר מכן, התאים מוזרקים בשילוב עם תאי סרטן שד אנושיים מסוג MCF7 באופן תת-עורי לעכבר חסר מערכת חיסון. הפיברובלסטים מהזיכרון האנושי שהוזרקו יתפתחו למיאופיברובלסטים המקדמים גידולים.

לאחר מכן, פיברובלסטים של בלוטת החלב אנושיים הורי מופקים מקסנוגרפטים של גידולים ומגודלים בנוכחות pur mycin. התאים העמידים ל-pur mycin שמתקבלים נקראים CAFs נוצרו ניסויית (exp calfs). ניתוח אימונוהיסטוכימי מגלה כי פיברובלסטים אנושיים נורמליים של בלוטת החלב שהיו נוכחים בתחילה מתפתחים ל-calf myofibroblasts בתוך הקסנוגרפט של הגידול, אשר רכשו את היכולת לקדם tumorigenesis. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי CAFs ראשוניים מחולי סרטן השד, הוא שניתן לייצר ניסויית CAFs מפיברובלסטים של שד אנושי באמצעות השתלה משותפת של גידול.

הדגמת הפרוצדורה במודל כללי תבוצע על ידי Kar, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, ו-Ahmed Kar, סטודנט לדוקטורט במעבדה. התחילו עם גרם אחד של רקמת שד אנושית בריאה שנלקחה מניתוח צמצום שד (reduction mammoplasty). שטפו את הרקמה מספר פעמים ב-PBS, לאחר מכן הניחו את הרקמה בצלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטר והשתמשו בלהב תער סטרילי כדי לקצוץ אותה לfragments קטנים שגודלם פחות מ-1.5 מילימטר מעוקב.

בשלב הבא, השתמשו בלהב תער כדי להעביר את פרגמנטי הרקמה למבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תמיפת פירוק תאים (cell dissociation buffer) לכל חצי גרם של רקמה. לאחר מכן, בצעו ערבול ב-vortex למשך דקה אחת במהירות מקסימלית. הניחו את המבחנה על רוקר (rocker) בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והניחו לפרגמנטי הרקמה להתעכל במשך 12 עד 18 שעות.

ביום למחרת עדיין יישארו בשפופרת שברים רבים של רקמה שלא עוכלה; יש לבצע ערבוב ב-vortex. ראשית, במהירות מקסימלית, הנח את השפופרת על משטח העבודה והדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. לאחר ההדגרה, השתמש בפיפטה פיזיולוגית של 5 mL כדי להעביר את הנוזל העליון (SUP natant) המועשר בתאי סטרומה לשפופרת קונית חדשה.

לאחר מכן, סבב את פרקציית הסטרומה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-250 ×g. לאחר הסבוב, השהה מחדש את משקע התאים ב-PBS, ולאחר מכן סבב שוב בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-250 ×g. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע ב-DMEM המועשר ב-10% FCS והעבר אותם לצלחית פטרי בקוטר 15 סנטימטרים.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר שמונה עד 10 ימים, התאים צריכים להגיע למצב של קונפלואנסיות. בנקודה זו, ניתן לקצור את התאים ולהקפיאם לצורך אחסון לטווח ארוך.

כדי להנציח את הפיברובלסטים התקינים הראשוניים של זיכרון אנושי שבודדו, יש להחדיר וקטור רטרו-ויראלי P MIG המבטא הן את H turt והן את GFP, לגדל את התאים במשך ארבעה עד חמישה ימים ולאחר מכן למיין את התאים החיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה. יש להחדיר מבנה רטרו-ויראלי P babe puro המקודד לגן עמידות לפורמיסין לתוך תרבית הפיברובלסטים המונצחים המסומנים ב-GFP. יש לגדל את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים בנוכחות פורמיסין בריכוז סופי של 1 µg/mL.

לבידוד פיברובלסטים של זיכרון אנושיים מומתים העמידים לפורמיצין ומסומנים ב-GFP. לאחר מכן, לבדיקה האם הפיברובלסטים מייצרים וירוסים פעילים, שעלולים להוביל להעברה אופקית של גנים המקודדים ל-GFP ועמידות לפורמיצין. גדלו 2.5 × 10⁵ פיברובלסטים של זיכרון אנושיים מומתים העמידים לפורמיצין בצלחת פטרי בקוטר 6 סנטימטרים למשך יומיים.

אספו וסננו את המדיום המותנה של הפיברובלסטים באמצעות מסנן מזרק בעל גודל נקבים של 0.45 micron. לאחר מכן, הוסיפו למשבצות של תאי פיברובלסטים של עכבר וטפחו למשך 12 שעות בנוכחות של 5 µg/mL protein sulfate, המגביר את יעילות ההדבקה הוויראלית. לאחר שחלפו 12 שעות, החליפו את המדיום ל-DMEM מועשר ב-10% FCS וטפחו למשך יומיים נוספים.

בחן את התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כ-10 תאים וחצי שנדבקו בנגיף GFP יהיו חיוביים ל-GFP. כעת החלף את המצע כדי לטפל בתאים בריכוז של 1 µg/mL.

דגרו בנוכחות purmycin למשך חמישה עד שבעה ימים. שוב, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע אם תאי tent and a half העמידים ל-purmycin יצרו מושבות. שימו לב כי העברה אופקית של גנים על ידי וירוסים פעילים, המיוצרים על ידי פיברובלסטים של בלוטת העלה האנושית המסומנים ב-GFP ועמידים ל-purmycin, עלולה להפוך את תאי העכבר ותאי הקרצינומה הרגישים ל-purmycin שבסביבתם לעמידים.

עמידות לפיומיסין וביטוי של GFP בתוך השסת הגידול. דבר זה עלול להקשות על תהליך בידוד הפיברובלסטים של העלה השד האנושי, העמידים לפיומיסין ומסומני GFP שהוזרקו, מתוך השסת הגידול, במטרה לייצר באופן ניסויי פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה להזרקה לעכבר עם חסר חיסוני. התחל בביצוע טריפסינציה וספירה של שורת תאי העלה השד האנושי שהוכנה זה עתה, יחד עם שורת תאי קרצינומה של השד האנושי MCF seven RAs, במבחנות מיקרופוגיות חדשות.

השעה 1×10⁶ תאי סרטן שד אנושיים מסוג mc77 RA ו-3×10⁶ פיברובלסטים של בלוטת העלה אנושית המהוננים ועמידים לפורמיסין ומסומנים ב-GFP ב-400 µL של מצע גידול עם 50%matrigel לכל הזרקה. הנח את המבחנות על קרח כביקורת.

הכינו באופן דומה פיברובלסטים של שד אנושי ללא תאי MCF seven RAs. לאחר מכן, בעזרת מחט בכילוג 27, הזריקו את תערובת התאים לאתר תת-עורי של עכבר עירום חסר מערכת חיסונית (immunodeficient nude mouse) כדי לבחון את השונות התוך-גידולית של פנוטיפים של calfs. בודדו calfs ופיברובלסטים של ביקורת מכמה קסנוגרפטים שונים של גידולים.

לאחר מכן, השתילו כל תערובת באורכי הרגל הימנית והשמאלית של כל עכבר. אפשרו לגידולי ה-xenograft של הגידול או הפיברובלסטים לגדול במשך 42 ימים לאחר ההזרקה. יש לאפטמיзировать את תקופת האינקובציה של הפיברובלסטים בתוך ה-xenograft של הגידול בהתבסס על הפנוטיפ של המיופיברובלסטים שנרכש על ידי הפיברובלסטים ההוריים בגידול.

כדי להפיק את הפיברובלסטים של העגל או של הביקורת מהעכבר שהורג, הניחו לפחות 0.5 גרם של רקמת קסנוגרפט ולפחות 0.1 גרם של רקמת קסנוגרפט של פיברובלסטים בצלחות נפרדות. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער סטרילי כדי לקצץ את הרקמה למקטעים קטנים של פחות מ-1.5 מילימטר מעוקב. לאחר מכן, העבירו באמצעות להב התער את מקטעי הרקמה לשפופרת קונוית של 15 מיליליטר המכילה באפר לדיסוציאציית תאים, ובצעו וורטקס למשך דקה במהירות מקסימלית. דגרו את תרחיף התאים למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב איטי ורציף, ולאחר מכן צנטריפוגו את תרחיף התאים.

הפרד מהגידול או מהשתל הסיבסוכרתי (fiberglass sano graft) במשך חמש דקות ב-250 ×g לאחר הסבוב. השהה מחדש את משקע התאים ב-PBS וחזור על הסנטריפוגציה. לאחר מכן, השהה מחדש את משקע התאים שהתקבל ב-DMEM מועשר ב-10% FCS כדי לבודד תרבית של פיברובלסטים של שד אנושי הוריים העמידים לפורמיצין (purmycin).

התאים שהופקו מהגידול או פיברובלסטים מרובים בצלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטרים בנוכחות של 1 µg/mL Puramycin בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. פעולה זו תסלק תאי קרצינומה מזוהמים ו/או תאים עכבריים.

תרבית את התאי הסטרומליים עד להגעה למצב של התמזגות (confluent) ואחסן אותם בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius באמצעות תוכה להקפאה. שים לב כי התאים העמידים לפורמיסין שהתקבלו, אשר סומנו כ-42 day old XP calf one או control fibroblast one, הם תאים אלמוותיים וחיוביים ל-GFP. פיברובלסטים מזיכרון אנושי מגבירים את הפנוטיפ המיופיברובלסטי המעודד גידול בתוך הקסנוגרפט של הגידול באמצעות אינטראקציה עם תאי קרצינומה במהלך התקדמות הגידול. ערבב 1 times 10 to the six תאי MCF seven RAs ו-3 times 10 to the 6 תאי 42 day old P calf.

העבירו תאים ב-400 µL של מצע תרבית עם 50% Matrigel להזרקה בתוך מבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.5 mL. הכינו בנוסף שלוש פעמים 10⁶ פיברובלסטים של ביקורת בני 42 יום, תאים ללא תאי קרצינומה, בתוך מבחנת Eppendorf, כדי להגביר עוד יותר פנוטיפים מיופיברובלסטיים מעודדי גידול של תאי exp calf. הזרקו תת-עורית לעכבר נקי (nude mouse) תערובת של תאים אלו יחד עם תאי CF seven RAs. הזרקו בנוסף פיברובלסטים של ביקורת בלבד, ללא תאי סרטן, כדי להכין את תאי הביקורת במידת הצורך.

דגרו תאי exp calf one למשך תקופות נוספות של 200 ימים בתוך הקסנוגרפט של הגידול כדי להפיק תאי exp C two, במטרה להעצים את הפנוטיפ המיופיברובלסטי המעודד גידולים סרטניים. כמו כן, הפיקו תאי control. Fibroblasts two כביקורת מול תאי exp calf two על ידי הזרקת תאי control fibroblasts one ללא תאי קרצינומה לעכבר, הוציאו את הגידולים והעבירו אותם לכלי תרבית רקמה.

בצעו דיסקציה והפרדה של השתל הסנו (seno graft) של הגידול או הפיברובלסטים לתליה של תאים בודדים והעבירו לתרבית. תרבתו את התאים בצלחת פטרי בקוטר 15 סנטימטר עם 10%F-C-S-D-M-E-M בנוכחות pur mycin עד להשגת התלכדות (confluence), לאחר מכן בצעו טריפסינזציה (trypsinization) ואחסנו את התאים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius באמצעות מディア הקפאה. התאים העמידים ל-pur mycin שהתקבלו נקראים 242 day old exp calf two cells או control fibroblasts two cells. תאי GFP labeled exp calf two ותאי control fibroblasts two שהופקו מגרפטים של גידולי שד (breast tumor xenografts) נותחו באופן אימונוהיסטוכימי; כפי שמוצג בתמונה זו, התאים נצבעו בחיוביות חזקה לסמנים מזנכימליים, כולל fermenting prolo four hydroxylase, collagen one A, fibronectin, S 100, A four ו-fibroblasts surface protein הספציפיים לאדם.

תוצאות אלו מעידות על מקור אנושי ועל אופי מזנכימלי של תאים אלו. לעומת זאת, cytokeratin, המהווה סמן לתאים אפיתליאליים, לא נצבע בפיברובלסטים אלו החיוביים ל-GFP. ממצאים אלו מצביעים על כך שתאי EXP C two ותאי פיברובלסטים ביקורת שניים מקורם בפיברובלסטים של בלוטת העלה אנושית ההוריים שהוכנסו בתחילה לקסנוגרפטים של עכברים.

באופן חשוב, מספר רב יותר של תאי XP calf two נצבעו חיובי ל-alpha SMA ולחלבון גליקופרוטאין של המטריקס החוץ-תאי tenascin C, שניהם מהווים סמנים של מיופיברובלסטים, בהשוואה לתאי פיברובלסטים של ביקורת. שימו לב כי שיעור גבוה יותר של מיופיברובלסטים חיוביים ל-alpha SMA נמצא בתאי exp calf two בהשוואה לזה שנצפה בתאי exp calf one בני 42 יום. נתונים אלו מדגימים כי פיברובלסטים של זיכרון אנושיים תייקבים הופכים בהדרגה למיופיברובלסטים מסוג calf בתוך קסנוגרפטים של גידולים במהלך התקדמות הגידול לאחר התפתחותו.

מודל קסנוגרפט של גידול במשלים סלל את הדרך עבור חוקרים העוסקים במיקרו-סביבה של הגידול, כדי לחקור את תהליכי האבולוציה של פיברובלסט נורמלי לסרטן. כך אומרים פיברובלסט.