הדמיה תלת מימדית של אסטרוציטים בעלי תווית חיסונית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

קחו קטע מוח של עכבר מוכתם חיסוני עם אסטרוציטים עם תווית פלואורסצנטית. הציטופלזמה של האסטרוציט זוהרת באדום, בעוד שהגרעין זוהר בכחול.

הנח את השקופית על מיקרוסקופ קונפוקליtagה מתחת לעדשת אובייקט מתאימה.

באמצעות תוכנת הרכישה, התאם את המיקוד ובחר את הפלואורופורים המסמנים את הציטופלזמה של האסטרוציטים ואת הגרעין.

התחל בהדמיה חיה ובצע אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה כדי להפחית את הרעש בתמונה הנרכשת.

תחת פרמטרי רכישה, בחר מצב סריקה במהירות נמוכה לצילום תמונה דו-ממדית באיכות גבוהה יותר.

זהו את המיקום העליון ביותר של האסטרוציט כנקודת ההתחלה של מחסנית Z ואת המיקום הנמוך ביותר כנקודת הקצה.

הגדר את מספר הפרוסות המכסות את עומק התא המלא.

מזגו את הפרוסות כדי ליצור תמונה תלת-ממדית של האסטרוציטים.

כדי להתחיל במיקרוסקופיה קונפוקלית, הנח שקופית על שלב המיקרוסקופ ובחר את המטרה פי 63. לאחר פתיחת תוכנת הרכישה, לחץ על הגדרה חכמה בכרטיסייה רכישה ובחר את הפלואורופורים המתאימים. כאן משתמשים ב-DAPI ו-Alexa Fluor 555.

לאחר מכן, לחץ על האות הטוב ביותר, ואחריו החל. לאחר מכן לחץ על הגדר חשיפה כדי לאפשר למחשב לקבוע את פרמטרי החשיפה האופטימליים.

כדי למטב את התמונה, פתחו את החלון 'ערוצים' והעבירו את התמונה למצב 'חי'. כוונן את המיקוד במידת הצורך. לאחר מכן לחץ על 1 AU כדי לייעל את חור הסיכה. התאימו את ההגברה לעוצמה מיטבית.

לבסוף, הגדר את הרווח הדיגיטלי בין 2 ל-3. לאחר מיטוב זה, עצור את התמונה החיה ופתח את חלון מצב רכישה. התאם את גודל המסגרת על ידי לחיצה על X על Y, ובחר 1024 על 1024. כמו כן, בחר מהירות איטית.

לאחר מכן, פתח את הכרטיסייה ממוצע ובחר מספר גדול או שווה ל-4. לאחר מכן לחץ על כפתור הצמד ושמור את התמונה הדו-ממדית שצולמה. כדי להגדיר הדמיה תלת מימדית, פתח את הכרטיסייה הגדרות חכמות וסמן את פריט Z-Stack, מה שיגרום לחלון הערימה להיפתח.

כדי להגדיר את המיקום הראשון והאחרון עבור Z-Stack, לחץ שוב, לחץ על Live והתאם את המיקוד למיקום העליון ביותר של האסטרוציטים. לחץ על קבע תחילה. כעת התאימו את המיקוד למיקום הנמוך ביותר של האסטרוציט ולחצו על הגדר אחרון. לאחר מכן הפסק את התצוגה החיה.

לאחר מכן, בחר את המרווח על ידי לחיצה על אופטימלי כדי להגדיר את מספר הפרוסות. כאן, המרווח הוא 1.01 מיקרומטר. לבסוף, לחץ על התחל ניסוי ושמור את התמונות לאחר השלמת הסריקה.