Name: טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למד שיטת כרומטוגרפיה לטיהור ריבוזומים שמרים פעילים באמצעות עמודת SFO link טעונה ציסטאין. השיטה מפרידה במהירות ריבוזומים מזיהומי אקסונוקלאזות ופרוטאזות לניתוחים ביוכימיים מדויקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לכל חברי המעבדה Dinman, כולל אשטון Belew, קארן ג&#39;ק, Sharmishtha Musalga, סרגיי Sulima, Shivani Reddy, מיכאל רודין על עזרתם קלט על הפרויקט הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AM מן איגוד הלב האמריקני (AHA 0630163N) ו JDD מן המכונים הלאומיים לבריאות (5R01 GM058859-12). ג&#39;אל נתמכה על ידי מהשקעה Recovery Act האמריקאי תוספת של 2009 כדי להעניק את ההורה (3R01GM058859-11S1).

1. הכנת ציסטאין טעונה Sulfolink שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sulfolink שרף (פירס) בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום כולל של 10 מ"ל של slurry של 50% ג'ל Sulfolink צימוד כפי שסופק בשתי צלוחיות פלסטיק 10 מ"ל על ידי היצרן, עם 5 מ"ל מופץ לתוך בקבוקון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות מבחנות ב XG 850 ובזהירות להסיר supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג'ל שלוש פעמים חיץ צימוד (50 מ"מ טריס, pH 8.5, 5 mM EDTA) על ידי resuspending את החרוזים 5 מ"ל, centrifuging בקצרה על 850 XG והסרת supernatant ידי פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים חמש מיליליטר של תמיסה של 50 mM ציסטאין-L במאגר צימוד צינור כל תמהיל slurry שעה 1 במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שאריות L-ציסטאין ידי שטיפה כמתואר צעד 1.4 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הג'ל ב 10 מ"ל של חיץ מחייב [20 mM HEPES, pH 7.6, 5 מ"מ Mg (OAc) 2, 60 מ"מ NH 4 Cl, 2 מ"מ DTT], ואת לאזן שרף על ידי שטיפה ב 10 מ"ל של חיץ מחייב3 פעמים כמתואר בשלב 1.4. שרף למזוג לתוך 10 מ"ל צנטריפוגות כובע, עמודה מאוחסנים 4 ° C. קיבולת שרף עבור RNA מחייב הוא ~ 20 מ"ל 260 יחידות. </li></ol> 2. טיהור chromatographic של הריבוזומים באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף הערה: אם עובדים עם המתח שבו פעילות הפרוטאז מוכיחה להיות בעיה, עיכוב קוקטיילים פרוטאז ניתן להשתמש בכל מאגרי הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו את כל הרכיבים על הקרח ולהכין את כל פתרונות באמצעות RNase ללא מים סינון סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים שמרים לילה לשלב אמצע יומן (OD 595 = 0.6-1.2) במדיה המתאימה. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף 1 תאים גרם במאגר צנטריפוגות מחייב XG ב 3700 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ מחייב נפח הכולל המשוער של 2 מ"ל, ולשבש באמצעות נפח שווה של 0.5 מ"מ חרוזי זכוכית מקורר עד 4 ° C uלשיר Biospec מיני חרוז מקצף (Bartlesville, בסדר). דוגמאות ניתן לפצל צינורות מרובים כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של תאים שלמים, אברונים, ופסולת תאית על ידי צנטריפוגה ב XG 30,000 במשך 30 דקות ב ultracentrifuge Beckman Coulter אופטימה-E מקס (Fullerton, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, גלולה שרף במשך דקה אחת ב 1000 XG להסיר את פתרון האחסון. שני מ"ל של שרף משמש גרם כל אחד של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר lysate supernatants התא ספין 30,000 XG (S30), מטפלת כדי למזער את הזיהום מן השבר או שומנים בחלקו העליון או את הפסולת בתא בתחתית הצינורות, ואת המקום ישירות slurry Sulfolink טעונה. שכבת השומנים ניתן להימנע או על ידי הסרה או על ידי לחיצה מתוך pipet לאחר קצה חצה לתוך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת S30/Sulfolink על הקרח ללא ערבוב במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמודות תוך 15 צינורות חרוטי מ"ל ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבורr דקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את השברים flowthrough בחזרה את העמודות, לערבב ביד, ואת לדגור עבור 15 דקות נוספות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמודות תוך 15 צינורות חרוטי מ"ל ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך דקה אחת. בטל flowthrough. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות שווי ולהוסיף 5 מ"ל של חיץ מחייב. מערבבים ביד עד טורים resuspended, להסיר את כובעי, ו בצנטריפוגה צנטריפוגות עמודות XG ב 1000 למשך דקה אחת. חזור על פרוטוקול כביסה פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ"ל של חיץ elution (20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 מ"מ KCl, 2mm DTT, 0.5 מ"ג / מ"ל הפרין) על כל עמודה. מערבבים slurries ביד, דגירה על קרח במשך 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עמודות לתוך חדש 15 מ"ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך דקה 1. איסוף eluate. חזור על השלב elution פעם נוספת, כך כרכים הסופי מדגם משולב הן ~ 3 מ"ל. שרף משמש ניתן לכבס עם חיץ elution ללא הפרין ואחריו איזון עם buffe מחייבr, ומאוחסנים 10 כרכים מ"ל של חיץ מחייב ב 4 ° C עבור שימוש חוזר מאוחר יותר. </li></ol> 3. Puromycin טיפול הערה: שיטה חלופית כדי להסיר זיהום מינים tRNA הוא לעבור גלוקוז עשיר התקשורת גלוקוז מדולדל לקדם נגר הריבוזום. עם זאת, זה משנה את המצב המטבולי של התאים שמרים, אשר יכול להשפיע על התפקוד ועל ריכוז הריבוזום. כדי להפשיט את הריבוזומים מ אנדוגני peptidyl-tRNA, טיפול עם puromycin מבוצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנטרל את ה-pH 7.5 פתרון 100 מ"מ puromycin ידי הוספת 1M KOH dropwise בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון puromycin לנטרל ריכוז 1mm ~ הסופי eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ"מ GTP לריכוז סופי של 1 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בקצב של 30 ° C. </li></ol> 4. טיהור של ריבוזומים על ידי שקיעה דרך כריות גליצרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד מ"למאגר כרית (20 HEPES מ"מ, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 מ"מ KCl, 2 מ"מ DTT, גליצרול 25%) לתוך צינור 4 נפח מ"ל ultracentrifuge פוליקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שכבה puromycin טיפול בשברים elution על גבי כרית, דגימות צנטריפוגות ב 100,000 XG לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות מן הרוטור צנטריפוגות, ואת לשאוב supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כדורי המכיל ריבוזומים מטוהרים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הריבוזומים של 100 μl של חיץ כרית על ידי שיבוש עדין בעזרת מוט זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרעה, לכסות עם צינורות parafilm ולנער במהירות בינונית במערבולת חדר קר במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תכולת לצינור microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות המרבית על 4 ° C, ולהסיר supernatants לצינורות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.1-4.7 באמצעות 2 מ"ל של כרית חיץ, למעט 100 μl של חיץ אחסון (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 50 מ"מ NH Cl 4, 5 מ"מ Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, גליצרול 25%) משמש צעדים 4.4 ו - 4.5 במקום חיץ כרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הריבוזומים מטוהרים spectrophotometrically (1 260 = 20 pmoles של הריבוזומים שמרים), ולאחסן ב -80 ° C. תוצאות אופייניות של 1 גרם שמרים הם 300-400 pmoles של הריבוזומים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה של מינים RNA המופק בכל אחד משלושת השלבים העיקריים של פרוטוקול מוצג באיור 2. בעוד rRNAs הם הזנים העיקריים נוכח lysates תא הכולל (T) אלה גם מכילים מספר רב של מינים אחרים RNA. הריבוזומים מטוהרים מהעמודה Sulfolink (SL) מכילים גם כמות גדולה של tRNAs בגלל זיקה גבוהה של המיטה עמודה עבור מינים אלה גם כן. הטיפול של חלק זה עם תוצאות puromycin ב הידרוליזה של פפטידים מ peptidyl-tRNAs, ומקדם דיסוציאציה של מינים אלה מן הריבוזומים. Puromycin התייחסו דגימות (PM) חוסר שיתוף purifyinג'מינים tRNA, וכך לייצג הריבוזומים טהור לחלוטין. כפי שדווח בעבר 8, ריבוזומים האלה הם שלמים מאוד פעיל ביוכימית, מה שהופך אותם מצעים אידיאלי עבור ניתוחים תפקודית מבנית מפורט. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה שיטה. לטיהור chromatographic של הריבוזומים באמצעות ציסטאין המקושרים sulfolink שרף מתואר. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. ניתוח נציג ההכנות הריבוזום. סך מינים היו RNA המופק lysates תא הכולל (T), Sulfolink הריבוזומים מטוהרים (SL) ו Sulfolink מטוהרים הריבוזומים מטופלים לאחר מכן עם puromycin ו משקעים באמצעות כרית גליצרול (PM). ליין M מייצג סמנים RNA גודל. להקות ייצוג rRNAs 25s ו 18S, כמו גם tRNAs ושאר מינים RNA מצוינים. כלסמטאות עמוסות 2 מיקרוגרם של רנ"א.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקולים טיהור ריבוזום בעצם כרוך תאים lysing, קצירת חלק מן cytosolic ספין במהירות נמוכה ולאחר מכן pelleting הריבוזומים על ידי צנטריפוגה מהירות גבוהה 1. בעוד כמה שיטות הרומן שימשו לטיהור הריבוזומים חיידקי, אותו לא היה נכון לגבי אאוקריוטים 2-4. למרות צעדים נוספים נוספו לאורך שנים, רוחץ מלח למשל, וכריות גליצרול (למשל לראות 5), מחקרים ביוכימיים ומבניים של הריבוזומים שמרים כבר הקשו על ידי נטייתם להיות מושפל על ידי אנזימים משפיל אנדוגני במהלך תהליך טיה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Sulfolink שרף Coupling </td><td> לנקב </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> מיני חרוז מקצף 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> אופטימה מקס ultracentrifuge E </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> מקרא RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי זכוכית 0.5 מ&quot;מ </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> טריס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

הריבוזומים האיקריוטים הם הרבה יותר יציב לעומת עמיתיהם eubacterial ו archael שלהם, ובכך פוזות אתגר משמעותי לחוקרים. מדאיג במיוחד הוא העובדה תמוגה של תאים משחרר מספר גדול של פרוטאזות ו nucleases אשר יכול לבזות הריבוזומים. לכן, חשוב להפריד בין הריבוזומים של אנזימים אלה מהר ככל האפשר. למרבה הצער, שיטות קונבנציונליות ultracentrifugation ההפרש עלים הריבוזומים חשופים אנזימים אלה לתקופות ארוכות של זמן בלתי מתקבל על הדעת, המשפיעים על השלמות המבנית ואת הפונקציונליות שלהם. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מנצלים שיטה chromatographic באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף. יישום פשוטה ומהירה מפחית באופן משמעותי את שיתוף טיהור פעילויות proteolytic ו nucleolytic, ייצור של תשואות גבוהות, ריבוזומים שלמים שמרים מאוד פעיל ביוכימית. אנו מציעים שיטה זו צריך להיות גם ישים הריבוזומים יונקים. הפשטות שלהשיטה, ועל טוהר פעילות משופרת של הריבוזום מטוהרים chromatographically מייצג התקדמות טכניים משמעותיים לחקר הריבוזומים האיקריוטים.

זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.

ריבוזומים איקריוטיים הם לביליים הרבה יותר בהשוואה למקביליהם האובקטריאליים והארכאיים, דבר המהווה אתגר משמעותי עבור חוקרים.

המטרה הכללית של הליך זה היא לטהר ריבוזומי שמרים שלמים ובעלי פעילות גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי ליזיס של התאים והצללה של הליזט באמצעות סנטריפוגציה במהירות גבוהה. כדי לקבל את הפרקציית S 30, נעשה שימוש בעמודת SFO link טעונה בציסטין לטיהור הריבוזומים.לאחר מכן מסירים tRNAs מזוהמים באמצעות טיפול ב-purmycin כשלב טיהור סופי. הריבוזומים עוברים אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טיהור באולטרה-צנטריפוגה, הוא שהשימוש בעמודת sulfa link מפריד במהירות את הריבוזומים מאקסונוקליאזות ופרוטאזות מזוהמות.בנוסף, שלב הטיפול ב-puromycin מפריד את הריבוזומים ממיני RNA מזוהמים, כגון tRNAs. שלבים אלה מבטיחים ייצור של כמויות גדולות של ריבוזומים מטוהרים, שלמים ובעלי פעילות גבוהה, לשימוש במחקרים ביוכימיים ומבניים. את הפרוצדורה ידגים ג'ונתן לשן, עמית פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.התחילו את הפרוטוקול על ידי העברה בפיפט של תמיסה סמיכה (slurry) בריכוז 50% של gel coupling sulfa, כפי שסופק על ידי היצרן, לשני מבחנות פלסטיק של 10 מיליליטר, כך שחמישה מיליליטר יופצו לכל מבחנה. לאחר צנטריפוגה קצרה של המבחנות ב-850 ×g, הסירו בזהירות את העילאיים. שטפו את הג'ל שלוש פעמים בבופר צימוד (coupling buffer) על ידי השעיה מחדש של החרוזים בחמישה מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה ב-850 ×g. הסירו את העילאי באמצעות פיפט. לאחר שטיפת הסורבן, הוסיפו לחלק מחמישה מיליליטר של תמיסת L cysteine בריכוז 50 millimolar בבופר צימוד לכל מבחנה.ערבב את תרחיף השסע למשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 °C. לאחר מכן, הסר את שאריות ה-L cysteine על ידי שטיפת הסורבן שלוש פעמים עם תמירון הקישור (coupling buffer) בלבד. לאחר מכן, השהה מחדש את הג'ל ב-10 milliliters של תמירון קישור (binding buffer) והשג equilibrium לסורבן על ידי שטיפתו שלוש פעמים.לבסוף, העבירו את שרף החילוף לעמודת צנטריפוגה של 10 milliliters וסגרו אותה במכסה. ניתן לשמור את שרף החילוף בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, כאשר קיבולת השרף היא כ-20 עד 60 units per milliliter במהלך טהרות כרומטוגרפית של ריבוזומים, תוך שימוש בשרף sulfa link טעון בציסטין.יש לשמור את כל הרכיבים על קרח ולהכין את כל התמיסות באמצעות מים נקיים מ-RNA וסינון סטרילי. גדלו תאי שמרים למשך לילה עד לשלב הלוגריתמי האמצעי (mid log phase) במצע המתאים. לאחר שקיעת התאים על ידי סבב צנטריפוגה, שטפו גרם אחד של תאים בבופר קישור (binding buffer) וסובבו שוב בצנטריפוגה, ולאחר מכן השביו את התאים במיליליטר אחד של בופר קישור לנפח כולל מקורב של שני מיליליטרים.בצע פירוק של התאים באמצעות נפח שווה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.5 millimeter שקוללו לארבע מעלות Celsius, ובעזרת מכשיר mini bead beader. הסר תאים שלא פורקו, אברונים ושאריות תאיות על ידי סבב צנטריפוגה במהירות של 30,000 ×g למשך 30 דקות באולטרה-צנטריפוגה. במקביל, השג משקע של השרף במשך דקה אחת במהירות של 1000 ×g. הסר את תמיסת האחסון מיד לפני השימוש.משתמשים בשני מיליליטר של שרף עבור כל גרם אחד של תאים. לאחר אולטרסנטריפוגציה של הדגימות, מסירים את העל-משקעים (supernatants) של ליזאט התאים מהסבב ב-30,000 ×g המכונה S 30. יש להקפיד למזער זיהום הן מהfracציה השומנית בחלק העליון והן משאריות התאים בתחתית המבחנות.העבירו את העל-נוזלים ישירות אל תמיסת ה-SFO link הטעונה. דגרו את תערובת ה-S 30 SFO link על קרח למשך 15 דקות. הניחו את העמודות במבחנות קוניות של 50 milliliter וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך דקה אחת, העבירו את פראקציות ה-flow through בחזרה אל העמודות, סגרו את העמודות והפכו אותן כדי לערבב.דגרו את הדגימות למשך 15 דקות נוספות על קרח. לאחר מכן, העבירו את העמודות למבחנות קוניות של 50 milliliter וסבבו בצנטריפוגה ב-1000 times G למשך דקה אחת, והשליכו את הנוזל שעבר (flow through). לאחר הוספת חמישה milliliters של חוצץ קישור (binding buffer), סגרו את העמודות במכס והפכו אותן כדי לערבב עד להשעיה מחדש.הסרו את הפקקים וסובבו את העמודות בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך דקה אחת. חזרו על פרוטוקול שטיפה זה פעמיים נוספות. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של תמיסת אלוציה (elution buffer) לכל עמודה.ערבבו את התרחיפים ידנית והדגירו על קרח למשך שתי דקות. כשלב סופי, הניחו את העמודות במבחנות קוניות חדשות בנפח 50 milliliter וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 times G למשך דקה אחת, אספו את האלוציות וחזרו על שלב האלוציה פעם נוספת, כך שנפחי הדגימות המשולבים הסופיים יהיו בערך שלושה milliliters. על מנת להסיר את הריבוזומים מ-endogenous peptol, מבוצע טיפול ב-T-R-N-A-A באמצעות pur mycin.ראשית, נטרלו תמיסת pur mycin בריכוז 100 millimolar ל-pH 7.5 על ידי הוספה של potassium hydroxide בריכוז one molar באופן טיפתי. הוסיפו בטמפרטורת החדר. הוסיפו את תמיסת ה-pur mycin המנוטרלת עד לריכוז סופי של כ-one millimolar באלוואט (eluate).לאחר מכן, הוסיפו GTP בריכוז 100 millimolar עד לריכוז סופי של one millimolar. דגרו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. לאחר הדגירה, העבירו one milliliter של cushion buffer לתוך מבחנה פוליקרבונט לאולטרסנטריפוגה בנפח של four milliliter.שכבב בעדינות את פראקציות האלוציה שעובדו ב-puromycin מעל הכרית וסבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-100,000 ×g למשך הלילה. לאחר שאיבת הנוזלים העליונים (supernatants), שטוף את המשקעים המכילים את הריבוזומים המנוקים ב-1 mL של בופר כרית. חזור על שטיפה זו עם 1 mL נוסף של בופר כרית.לאחר מכן, רזה פיזר את הריבוזומים ב-100 µL של cushion buffer על ידי פירוק עדין באמצעות מקל זכוכית. לאחר מכן, כסה את המבחנות בפרפראפיל ונער במהירות בינונית בוורטקס בחדר קר. לאחר שעה של ניעור, העבר את התכולה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וסבב למשך חמש דקות במהירות מקסימלית בטמפרטורה של 4 °C.העבירו את העל-מישובים למבחנות חדשות. הניחו את העל-מישובים כשכבה מעל שני מיליליטרים של cushion buffer במבחנה לאולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-100,000 ×g למשך לילה. למחרת, הוציאו את המבחנות מהרוטור של הצנטריפוגה ושאבו את העל-מישובים.בעזרת השיטה שתיארה כעת, יש לשטוף את המשקעים ולהמיס מחדש את הריבוזומים בבפר בשימור. לבסוף, יש לכמת את הריבוזומים המנוקים באופן ספקטרופוטומטרי לפני האחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.מוצגת כאן דוגמה לסוגי RNA שחולצו מכל אחד משלושת השלבים המרכזיים של הפרוטוקול, הכוללים את הליסאטים של תאים כוללים, את ה-sulf olink, ריבוזומים מטוהרים, ואת הריבוזומים המטוהרים ב-sufu link שטופלו לאחר מכן ב-pur mycin ושקעו דרך כרית גליצרין. מוצגים גם סממני גודל של RNA, בעוד שה-RNAs שלנו הם הסוגים העיקריים הנוכחים בליסאטים של תאים כוללים. אלו מכילים גם מספר רב של סוגי RNA אחרים.ריבוזומים שנוקו בעזרת עמודת sulfa link מכילים כמות גדולה של tRNAs, בשל זיקה גבוהה של מצע העמודה למולקולות אלו. טיפול של פרקציה זו ב-piro mycin גורם להידרוליזה של פפטידים מ-peptol tRNAs, ומעודד את הדיסוציאציה של מולקולות אלו מהריבוזומים. דגימות שעברו טיפול ב-pure mycin נטולות tRNA שספחו בתהליך הניקוי, ולפיכך הן מייצגות ריבוזומים טהורים לחלוטין.כפי שדווח בעבר, ריבוזומים אלה שלמים מאוד ופעילים ביוכימית, מה שהופך אותם לסובסטראטים אידיאליים לניתוחים תפקודיים ומבניים מפורטים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות למעקב אחר קישור של ליגנדים לריבוזומים וניתוח מבני, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון, מהם התכונות הביוכימיות והביופיזיות של ריבוזומים איקריוטיים.

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לטיהור של המיטוכונדריה של...

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

 טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.

ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לייצור מערכת TX-TL נטולת תאים PURE רקומביננטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

למד שיטת כרומטוגרפיה לטיהור ריבוזומים שמרים פעילים באמצעות עמודת SFO link טעונה ציסטאין. השיטה מפרידה במהירות ריבוזומים מזיהומי אקסונוקלאזות ופרוטאזות לניתוחים ביוכימיים מדויקים.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

גלה סרטונים נוספים