JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 3:00 דק' • June 17th, 2025
קח פרוסת מוח של עכבר קבועה כימית בצלחת מרובת בארות.
הרקמה מכילה אקסונים המוקפים במעטפות מיאלין עשירות בשומנים. גופי התאים מכילים גופי ניסל המורכבים מרטיקולום אנדופלזמי מחוספס וריבוזומים.
דגירה בתמיסת חדירה המכילה כתם ניסל פלואורסצנטי. התמיסה מחלחלת לממברנות התאים, ומאפשרת לכתם להיקשר ל-RNA הריבוזומלי בתוך גופי ה-Nissl ולתייג את גופי התאים.
הנח את הרקמה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם ספקטרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן, או CARS, מערכת הדמיה.
משאבה מסונכרנת ישירה וקרני לייזר סטוקס על הרקמה, מכוונות לעורר קשרים מולקולריים במעטפת המיאלין העשירה בשומנים.
הציגו קרן לייזר בדיקה כדי לקיים אינטראקציה עם הקשרים הנרגשים ולייצר אות אנטי-סטוקס ספציפי למיאלין.
גלאי פוטו לוכד את האות כדי ליצור תמונה ספציפית למיאלין.
השתמש בהדמיה קונפוקלית כדי ללכוד אותות מגופי ה-Nissl המסומנים בתווית.
שכב על התמונות הקונפוקליות וה-CARS להמחשת ארכיטקטורה עצבית.
לאחר הכנת הרקמות כמתואר בכתב היד, צבעו חלקים צפים חופשיים עבור Nissl ומדיה נוגדנים כדי להמחיש את גופי התאים. לאחר מכן, דגרו את החלקים על שייקר מעבדה רגיל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לפני הבאת הדגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר ה-CARS למשך שעה לפחות. לאחר מכן, יישר את לייזר ה-CARS על ידי חפיפה מרחבית של המשאבה וקרני הלייזר של סטוקס, והתאם את העיכוב בין שתי קרני הלייזר.
קוהלר אופטיקת המעבה והסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדמית. לאחר מכן, כוונן את הפריסקופ החיצוני כדי למרכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ. לקבלת הזיהוי הטוב ביותר קדימה של CARS שאינו נסרק, ודא שהמעבה מקושר.
עבור הדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית, והדמיית CARS, התאימו את לייזר CARS עם גלאים קדמיים ו-epi-CARS שאינם סרוקים על ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיה פלואורסצנטית. כעת, הניחו את החלקים בכלי תרבית עם תחתית כיסוי ו- PBS כדי למנוע ייבוש הרקמה. כמו כן, השתמש במשקולת זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי.
שימוש בממשק המשתמש הגרפי. הגדר את פרמטרי רכישת התמונה עבור הדמיה קונפוקלית פלואורסצנטית של CARS ו-Nissl. הנח את הדגימה על במת המיקרוסקופ. מקד את הדגימה וצלם את התמונות.