לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

המטרה הכללית של הליך זה היא להדמיות של דגימות חלבון מנוקות באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת רשתות המיקרוסקופיה האלקטרונית שישאו את הדגימה. השלב השני של ההליך הוא הכנת תמיסת הצביעה השלילית.

בשלב הבא, הדגימה מונחת על רשת למיקרוסקופיה אלקטרונית ועוברת צביעה שלילית. לבסוף, רשת ה-EM מוכנסת למיקרוסקופ אלקטרוני, ותמונות מוקלטות תחת תנאים אופטיים מתאימים. תמונות DEM בשדה בהיר קונבנציונלי הן בעלות ניגודיות גבוהה ופירוט חד, ומראות מקרו-מולקולות בודדות המפוזרות על רקע חסר מאפיינים.

מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית היא שיטה פשוטה להדמיה של החלבון הנחקר. ניתן להשתמש בה כבדיקה שגרתית לבחינת החלבון המזוקק, הן לצורך ניתוח מבני והן לבדיקות ביוכימיות וביופיזיות אחרות. כאן נדגים כיצד להכין דגימה בצביעה שלילית עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה, מכיוון שחלק מהשלבים קשים ללמידה מתוך תיאורים טקסטואליים ואיורים. התחילו בשימוש בפיפטה מזכוכית להנחת טיפה אחת של collodion לתוך כלי ביקר גדול המכיל מים, על פני השטח של המים. בעוד ה-collodion מתפשט, הוא עשוי ללכוד אבק מפני השטח של המים.

הסיר והחלף שכבת פלסטיק מאובקת של קולודיון (collodion) באמצעות טיפה נוספת. לאחר מכן, הנח בין 50 ל-100 רשתות EM אחת אחת על שכבת הפלסטיק הצפה, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מטה. בחר רשתות בעוצמה של 400 mesh עבור צביעה שלילית שגרתית ובחר רשתות בעוצמה של 200 mesh.

לאיסוף תמונות בזווית נטייה (tilt pair). בחרו פיסת נייר ללא קמטים בעלת ספיגה איטית, שגודלה מעט גדול משטח הגרידים. הניחו את הנייר מעל הגרידים והמתינו עד שהנייר יהיה רטוב לחלוטין.

הנייר לא אמור לספוג מים מהר מדי. אנו משתמשים בנייר מפנקס זול. הרשתות נמצאות כעת בין יריעת הפלסטיק לבין הנייר.

השתמשו בפינצטה כדי להניח את הנייר בצלחת פטרי לייבוש איטי באוויר. הימנעו משיטות ייבוש מהירות יותר שכן הן עלולות לגרום לקמטים. מכונת ציפוי הפחמן שבה השתמשנו במעבדתנו היא Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

מצויד במד עובי סרט Creston. המד עושה שימוש במאזן קוורץ הרגיש למשקעי פחמן. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן אינו דורש מכשיר זה. התחל בחידוד והטענה של מוטות הפחמן במכונה לציפוי פחמן.

בשלב הבא, מרחו גריז ואקום על שקופית זכוכית כך שחצי מהאזור המטblישאר ללא ציפוי. לאחר ציפוי הפחמן, יש להשתמש באזורים המשומנים של השקופית כדי להעריך את עובי ציפוי הפחמן. הניחו את הנייר עם הרשתות על הבמה תחת פעמון הזכוכית של מכונת ציפוי הפחמן. מקמו את זכוכית הגריז.

הזליגו את השקופית לצד הסריגים. שנאקו את תא הוואקום עד ללפחות 10 micro tours, אחרת פריקה חשמלית (sparking) תיצור חלקיקים גדולים רבים בסריג. כעת הגבירו את הזרם באיטיות רבה.

קצהו החד של מוט הפחמן יהפוך לבהיר ביותר. אין להתבונן בו בעין בלתי מוגנת כאשר הציפוי מתחיל; השקופית תשנה את צבעה לאפור כהה ככל ששכבת הפחמן נבנית. יש להפסיק את זרם החשמל בעובי הפחמן הרצוי, תוך התחשבות בשקיפות של פעמון הוואקום. לאחר כיול רמת הכהות של השקופית לעובי הפחמן, שיטה זו מדויקת ככל שמאפשר ומקבילה למד עובי שכבה יקר יותר.

עם סיום התהליך, שחררו את הוואקום מתא הוואקום והוציאו את רשתות הציפוי לשימוש מאוחר יותר. שכבת הפלסטיק הדקה לא תשפיע על איכות התמונה בצביעה שלילית, אך ניתן להסירה על ידי השריה של הרשתות בכלורופורם למשך מספר שעות לפני ההמשך. הכינו תמיסת urin L formate טרייה או השתמשו בתמיסה שנשמרה בחושך למשך פחות משבועיים.

לתמיסה טרייה ואיכותית יש צבע צהוב, pH של סביב ארבעה, והיא נקייה מאוד ללא משקעים. התחילו בשימוש במערכת זמינה מסחרית לביצוע Glow Discharge. בצעו פריקה חשמלית (Discharge) לסבבים מצופי הפחמן.

בשלב הבא, הניחו שתי טיפות של 20 µL של מים מזוקקים ושתי טיפות של 25 µL של תמיסת פורמט שתן טרייה על פיסת פרפיל. בעזרת פינצטה אנטי-קפילרית בעלת כוח דחיפה הפוך, החזיקו רשת שעברה פריקה של מטען חשמלי, כאשר הצד המצופה בפחמן פונה כלפי מעלה. חשוב לציין כי פינצטות אלו אינן שואבות נוזלים מהרשתות.

כעת יש להניח שני מיקרוליטרים של דגימת חלבון על הרשת ולהמתין עד שהחלבונים ייספגו בה. תהליך זה אורך בדרך כלל 30 שניות, אך דגימות מדוללות מאוד ידרשו זמן רב יותר, דבר העשוי להשפיע על ריכוזי התמיכה. בסיום, יש לספוג את שאריות דגימת החלבון באמצעות נייר סינון.

לאחר מכן, שטפו את הרשת פעמיים על ידי הגעה קצרה של פני השטח שלה לטיפת מים וייבוש מהיר באמצעות ספיגה תוך מספר שניות. לאחר מגע קצר של המים ברשת, הגעתה לטיפה של צבע ויבשו אותה במהירות באמצעות ספיגה. באותה טכניקה, השאירו את הרשת במגע עם טיפה שנייה של צבע למשך 20 שניות.

לבסוף, ייבשו את הרשת באוויר תחת מ㠃 מנדף, או רצוי בוואקום לפני סשן ה-EM; בדקו את כיוון מיקרוסקופ ה-EM, וטעינת קובץ יישור (alignment file) מושלם, אם זמין, אמורה להחזיר אותו למצב כמעט מושלם. כעת, טענו את רשת ה-EM לתוך מחזיק דגימות סטנדרטי בעל הטיה בודדת (single tilt). לאחר מכן, הכניסו את המחזיק אל הבמה.

לאחר מכן, המתן לסיום מחזור השאיבה והכנס את המחזיק אל העמוד. כעת התחל בחיפוש אזור דגימה עם צביעה טובה. בצע מיקוד ידני באמצעות שיטת הניגוד המינימלי או באמצעות מצלמה מסוג CC, D וחישוב ה-live four.

ספקטרום ההספק שלך. לאחר מכן הגדר את המיקוד העמוק (deep focus) לפי הצורך, בדרך כלל ל-1.5- מיקרון. ריכוז הצביעה עשוי להשתנות ברחבי הגריד, לכן חפש חלבונים עם ניגודיות לבנה.

הימנעו מאזורים עם צביעה לא אחידה או צביעה חיובית שבהם הניגודיות של החלבון הופכת לשחורה. השתמשו בגישה המתוארת להכנת רשתות והדמיה של דגימות שנצבעו בצביעה שלילית. מספר חלבונים מוכרים הודגמו למטרות הדגמה.

שימו לב לפירוט ולניגודיות החדה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים דגימות של מקרו-מולקולות בצביעה שלילית לצורך תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע שעות.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שחזור תלת-ממדי, כדי להבין טוב יותר מבנים מולקולריים.