לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה
December 22nd, 2011
דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM, מכתים את המדגם באופן חזותי את המדגם אלקטרון במיקרוסקופ. משתמשי המחשב השני יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים הללו בקלות לנצל שלילי כתם EM כמו assay שגרתי, בנוסף מבחני ביוכימיים אחרים, להערכת דגימות חלבון שלהם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין דגימות חלבון מטוהרות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי. זה מושג על ידי הכנת רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים שיתמכו בדגימה. השלב השני בהליך הוא הכנת תמיסת הכתם השלילי.
לאחר מכן, הדגימה מוחלת על רשת מיקרוסקופ האלקטרונים ומוכתמת שלילית. לבסוף, רשת ה-EM נטענת במיקרוסקופ אלקטרונים, והתמונות מוקלטות בתנאים אופטיים מתאימים. תמונות DEM קונבנציונליות של שדה בהיר הן בעלות ניגודיות גבוהה ומפורטות בחדות, ומציגות מקרומולקולה בודדת מפוזרת על רקע חסר תכונות.
מיקרוסקופ אלקטרונים של כתם שלילי הוא שיטה פשוטה להמחשת החלבון האהוב עליך. זה יכול לשמש כבדיקה שגרתית לבחינת החלבון המטוהר שלך, לניתוח מבני או לבדיקות ביוכימיות וביופיזיקליות אחרות. כאן אנו מדגימים כיצד להכין דגימה מוכתמת שלילית למיקרוסקופ אלקטרונים.
הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מכיוון שחלק מהשלבים קשים ללמוד מתיאורי טקסט ואיורים. התחל בשימוש בפיפטה מזכוכית כדי להניח טיפה אחת של קולודיון לתוך מים גדולה על פני המים. ככל שהקולודיון מתפשט, הוא עלול ללכוד אבק מפני המים.
הסר והחלף סרט מאובק של פלסטיק קולודיון בטיפה נוספת. לאחר מכן מקם בין 50 ל -100 רשתות EM בזו אחר זו על סרט הפלסטיק הצף הצד המבריק כלפי מטה. בחר 400 רשתות רשת עבור כתם שלילי שגרתי ובחר 200 רשתות רשת.
לאיסוף תמונות זוג הטיה. בחר פיסת נייר לא מקומטת בעלת ספיגה איטית הגדולה מעט משטח הרשתות. הנח את הנייר על גבי הרשתות והמתן עד שהנייר יירטב לחלוטין.
הנייר לא אמור לספוג מים מהר מדי. אנו משתמשים בנייר מפנקס זול. הרשתות דחוסות כעת בין סרט הפלסטיק לנייר.
השתמש בזוג מלקחיים כדי להניח את הנייר בצלחת פטרי לייבוש איטי באוויר. הימנע משיטות ייבוש מהירות יותר מכיוון שהן עלולות להוביל לקמטים. מכונת ציפוי הפחמן המשמשת במעבדה שלנו היא קרסטון 2 0 8 C קרבון טורבו ואקום גבוה.
מצויד בצג עובי סרט Creston. המוניטור משתמש באיזון קוורץ הרגיש למרבצי פחמן. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן אינו דורש מכשיר זה התחל על ידי השחזה וטעינה של מוטות הפחמן במכונת ציפוי פחמן.
המעיל הבא, מגלשת זכוכית עם שומן ואקום המותירה מחצית מהשטח הקפוא לא מצופה לאחר ציפוי פחמן, האזורים המשומנים של השקופית משמשים להערכת עובי שכבת הפחמן. הניחו את הנייר עם הרשתות על הבמה מתחת לצנצנת הפעמון של מכונת ציפוי הפחמן. מקם את הזכוכית המשומנת.
החלק לצד הרשתות. שאב את תא הוואקום עד לפחות 10 מיקרו סיורים, אחרת ניצוץ ייצור חלקיקים גדולים רבים ברשת. עכשיו הגדילו את הזרם לאט מאוד.
הקצה החד של מוט הפחמן יהפוך לבהיר במיוחד. אל תתבונן בו בעין בלתי עם תחילת הציפוי, מגלשת הזכוכית תשנה את צבעה לאפור כהה ככל ששכבת הפחמן מצטברת, תחתוך את הזרם בעובי הפחמן הרצוי ותקח בחשבון את שקיפות צנצנת הפעמון. בעת ביצוע שיפוט זה, ברגע שהחושך של השקופית מכויל לעובי הפחמן, שיטה זו מדויקת כמו צג עובי הסרט היקר יותר.
בסיום התהליך, אוורור את תא הוואקום והסר רשתות מצופות לשימוש מאוחר יותר. שכבת הפלסטיק הדקה לא תשפיע על איכות התמונה המוכתמת לרעה, אך ניתן להסיר אותה על ידי השריית הרשתות בכלורופורם למשך מספר שעות לפני שתמשיך. הכינו תמיסה חדשה בפורמט L או השתמשו בתמיסה שאוחסנה בחושך פחות משבועיים.
לתמיסה טרייה טובה יש צבע צהוב, pH של כארבע ופועלת נקייה מאוד ללא משקעים. התחל בשימוש במערכת זמינה מסחרית כדי לזהור. פרוק את הרשתות המצופות פחמן.
במקום הבא, שתי טיפות של 20 מיקרוליטר מים מזוקקים ו-2 טיפות של 25 מיקרוליטר של תמיסת משתנה טרייה על חתיכת פרפיל. בעזרת מלקחיים אנטי נימיים בכוח הפוך, החזק רשת משוחררת זוהר, הצד המצופה פחמן כלפי מעלה. באופן קריטי, מלקחיים אלה אינם שואבים נוזלים מהרשתות.
כעת מרחו שני מיקרוליטרים של דגימת חלבון על הרשת והמתינו בזמן שהחלבונים נספגים ברשת. זה בדרך כלל לוקח 30 שניות, אבל דגימות מדוללות מאוד ידרשו יותר זמן, מה שיכול להשפיע על ריכוזי המאגר. בסיום, מחק את דגימת החלבון באמצעות נייר פילטר.
לאחר מכן שטפו את הרשת פעמיים על ידי נגיעה קצרה לפני השטח שלה בטיפת מים וייבוש תוך מספר שניות. לאחר שהמים נגעו לזמן קצר ברשת לטיפת כתם וייבשו אותה במהירות. באותה טכניקה, אפשר לרשת להיות במגע עם טיפת כתם שנייה למשך 20 שניות.
לבסוף, יבש את הרשת באוויר על מכסה המנוע של הספסל, או רצוי בוואקום לפני הפעלת ה- EM, בדוק את היישור של מיקרוסקופ ה- EM הטוען קובץ יישור מושלם אם זמין, אמור להחזיר אותו למצב כמעט מושלם. כעת טען את רשת ה-EM על מחזיק דגימה סטנדרטי הטיה יחיד. לאחר מכן, הכנס את המחזיק לבמה.
לאחר מכן המתן להשלמת מחזור השאיבה והכנס את המחזיק לעמודה. כעת התחל לחפש אזור לדוגמה עם כתם טוב. מיקוד ידני בשיטת הניגודיות המינימלית או באמצעות מצלמת CC, D וחישוב ארבעת החיים.
ספקטרום הכוח שלך. לאחר מכן הגדר את המיקוד העמוק לפי הצורך, בדרך כלל למינוס 1.5 מיקרון. ריכוז הכתמים יכול להשתנות על פני הרשת, לכן חפש חלבונים עם ניגודיות לבנה.
הימנע מאזורים עם כתם לא אחיד או כתם חיובי שבהם ניגודיות החלבון הופכת לשחורה. שימוש בגישה המתוארת ליצירת רשתות והדמיה של דגימות מוכתמות שליליות. מספר חלבונים מוכרים צולמו למטרות הדגמה.
שימו לב לפרטים ולניגודיות החדה שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור דגימות של מקרומולקולות מוכתמות שלילית לתצפית במיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע שעות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שחזור תלת מימד על מנת להבין טוב יותר מבנים מולקולריים.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיית דגימות חלבון מטוהרות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים עם צביעה שלילית (EM). השיטה נגישה למשתמשים מתחילים ומשמשת כבדיקה שגרתית לניתוח מבני של חלבונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- מיקרוסקופיית אלקטרונים
- ניתוח חלבונים
רקע
- צביעה שלילית EM היא טכניקה נפוצה להדמיית חלבונים.
- היא מאפשרת ניתוח מבני איכותני וכמותי כאחד.
- פרוטוקולים להכנת דגימות והדמיה חיוניים ליישום מוצלח.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של מבני חלבונים.
מטרת המחקר
- לספק מדריך מקיף להכנת רשתות EM וצביעת דגימות.
- להדגים את הדמיית החלבונים באמצעות צביעה שלילית EM.
- לאפשר שימוש שגרתי בשיטה זו בניתוח חלבונים.
שיטות ששימשו
- הכנת רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים.
- יישום תמיסת צביעה שלילית על דגימות חלבון.
- הדמיית דגימות במיקרוסקופ אלקטרונים.
- הקלטת תמונות בתנאים אופטימליים.
תוצאות עיקריות
- הושגו תמונות בעלות ניגודיות גבוהה של חלבונים.
- הוכחו בהצלחה פרוטוקולים מפורטים.
- סיוע ויזואלי שיפר את ההבנה של צעדים מורכבים.
- התוצאות תומכות בשימוש בצביעה שלילית EM לניתוח חלבונים שגרתי.
מסקנות
- צביעה שלילית EM היא שיטה יעילה להדמיית חלבונים.
- הפרוטוקולים שסופקו ניתנים לביצוע קל על ידי משתמשים מתחילים.
- טכניקה זו יכולה להשלים בדיקות ביוכימיות אחרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
