הדמיית דינמיקת סידן בתאי שיער בקו הרוחב של דג זברה זחל

קח זחל דג זברה טרנסגני משותק המותקן בתא זלוף.

הזחל מבטא מדדי סידן מקומיים בקרום בתאי השיער של הנוירומה, מרכיב במערכת הקו הרוחבי המזהה תנועת מים.

תאי השיער מורכבים מצרורות שיער אפיקליים ואזורים פרה-סינפטיים בסיסיים, היוצרים סינפסות עם נוירונים אפרנטיים להעברת אותות.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש בהגדלה נמוכה כדי למקם פיפטה של סילון נוזל ליד הזחל.

הגדל את ההגדלה כדי לאתר תורן עצבי, מקם מחדש את הפיפטה בקרבתו ועבור

להדמיה פלואורסצנטית.

לספק פולסים נוזליים כדי להסיט צרורות שיער, ולפתוח תעלות מכניות לזרם קטיון אפיקלי, כולל יוני סידן.

אינדיקטורים פלואורסצנטיים חלשים נקשרים לסידן, וגורמים לעלייה מקומית בקרינה.

זרם הקטיונים מפריד את התא, ומפעיל כניסת סידן דרך תעלות מגודרות מתח בקדם-סינפסה הבסיסית, שם הוא נקשר לאינדיקטורים ומגביר את הקרינה באופן מקומי.

דמיין את הדינמיקה של הסידן האפיקלי והבסיסי בזמן אמת.

בהליך זה, מילוי חוזר של 10 מיקרוליטר של מאגר עצבי למחט סילון נוזלים שבורה כהלכה באמצעות קצה טעינת ג'ל. טען את התמיסה באופן שווה לקצה ללא בועות. לאחר מכן הכנס את המחט למחזיק הפיפטה המחובר למיקרומניפולטור הממונע.

הנח את תא הזלוף לתוך מתאם תא עגול על המיקרוסקופtagה. הזיזו את הבמה הממונעת כך שהזחל יהיה במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, סובב את מתאם התא העגול כך שציר ה-A-P של הזחל מיושר בערך עם מסלול מחט סילון הנוזל.

באמצעות אור מועבר וניגודיות הפרעות דיפרנציאליות, הביאו את הזחל למיקוד ומרכזו אותו תחת המטרה פי 10. לאחר מכן העלו את יעד ה-10x. בעזרת המיקרומניפולטור הממונע, הורידו את מחט סילון הנוזל למרכז שדה הראייה, כך שהיא מוארת על ידי האור המועבר ובקושי נוגעת במאגר העצבי.

הורד את המטרה פי 10 כדי להתמקד בזחל על מנת לאשר את מיקומו. מקד את המטרה במחט הסילון הנוזלית. הזז את מחט סילון הנוזל עם המיקרומניפולטור בציר x ו-y עד שהיא ממוקמת במקביל לצד הגבי של הזחל.

לאחר מכן, התמקדו שוב בזחל. הורידו את המחט כלפי מטה בציר ה-z, ומקמו את המחט לאורך הצד הגבי של הדג, במרחק של מילימטר אחד מהגוף. הזז בזהירות את מתאם התא העגול כדי להבטיח שמחט סילון הנוזל מיושרת לאורך קו האמצע של הזחל.

לאחר מכן, עבור ליעד 60x מים. ודא שהמטרה שקועה במאגר העצבי. השתמש במיקוד העדין כדי לאתר תורן עצבי. לאחר מכן, הזיזו את הבמה הממונעת כדי למקם את הנוירומסט המעניין במרכז שדה הראייה.

שמור את קצה מחט הסילון הנוזלי לאורך הצד הגבי של הדג. אל תיגע בקצה מחט סילון הנוזל לזחל או למשטח החדר. מקם את מחט סילון הנוזל עם המיקרומניפולטור כך שתהיה 100 מיקרומטר מהקצה החיצוני של התורן.

לאחר מכן התמקדו בקצות צרורות השיער האפיקליים. החלק התחתון של מחט סילון הנוזל צריך להיות בפוקוס במישור זה. הגדר את מהדק הלחץ במהירות גבוהה ממצב ידני למצב חיצוני כדי לקבל קלט מתוכנת ההדמיה. אפס את הלחץ המהיר clamp על ידי לחיצה על כפתור האפס, והשתמש בכפתור נקודת ההגדרה כדי להגדיר את לחץ המנוחה מעט חיובי. אשר את תפוקת המנוחה של מהדק הלחץ במהירות גבוהה באמצעות מד לחץ PSI המחובר לפלט שלב הראש.

כדי לקבוע את הלחץ הדרוש לגירוי צרורות השיער, הפעל גירוי בדיקה עם פלט של 0.125 ו-0.25 וולט למשך 200 עד 500 אלפיות השנייה. עבור כל גירוי בדיקה, מדוד את מרחק הסטייה של קצות צרורות השיער (הקינוציליה). בחר לחץ שמזיז את הצרורות למרחק של כ -5 מיקרומטר. ודא שקצות הקינוציליה יישארו בפוקוס כל הזמן.

כדי להשיג תמונות במישור יחיד, בחר גירוי שיספק במהלך רכישת 80 פריימים לאחר פריים 30 בשלוש שניות. כדי למדוד תגובות סידן רגישות למכניקה, התמקדו בבסיס צרורות השיער האפיקליים והתחילו ברכישת תמונה. כדי למדוד תגובות סידן פרה-סינפטיות, התמקדו בבסיס תאי השיער והתחילו ברכישת תמונה.