תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic
July 3rd, 2011
שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.
היי, אני קארה טד, אני ליאו. לך אליי. ואני סיימון מקווין מייסון.
העיכול של ביומסה צמחית הוא נושא מעניין מאוד כיום. הסיבה לכך היא שיש הרבה סוכרים הקשורים בפוליסכרידים של דפנות תאי הצמח המרכיבים את הביומסה הזו, ואם נוכל להוציא את הסוכרים האלה בצורה שמישה, נוכל לתסוס אותם כדי לייצר כל מיני מוצרים כמו דלקים וכימיקלים. למרבה הצער, חומרים אלה קשים מאוד לעיכול והבנה טובה יותר של מה שולט בעיכול זה היא עניין של דחיפות מסוימת.
אז כדי להיות מסוגלים להשתמש בחומר צמחי לייצור קבוצת התחדשות, אנחנו צריכים להיות מסוגלים למדוד את פוטנציאל הייצור במפעלים האלה. אז כאן באוניברסיטת יורק, אנו מסננים אוכלוסיות גדולות של חומר צמחי כדי לקבוע את פוטנציאל הפיקציה שלהם. פיקציה היא תהליך של פירוק פחמימות מורכבות למרכיבי החד-סוכר שלה כדי לייצר כימיקלים יקרי ערך באמצעות תהליכים תעשייתיים שונים.
כדי למדוד את פוטנציאל הפיקציה, אנו משחזרים תהליכים תעשייתיים ברמת מיקרוסקאלה שבה אנו מכניסים את הביומסה לטיפול מקדים והידרוליזה של אנזימים כדי לקבוע את הסוכרים המשתחררים. זה מזהה זנים מעניינים בגנוטיפים. מערכת התפוקה הגבוהה פועלת בפורמט צלחת IG שש בארות.
תנאים קלים של הידרוליזה משמשים לחשיפת הבדלים עדינים בין גנוטיפים, והוא גם גמיש מספיק כדי לתמוך בחומרי מצע שונים כמו גם להעריך אנזימים שונים. השיטה בה אנו משתמשים כוללת עיצוב של חומר צמחי כאבקה, אשר לאחר מכן מטופלת מראש בחומצה מדוללת או אלקליין ב-90 מעלות למשך 20 דקות. לאחר מכן, עיכול אנזימים מתבצע באמצעות תערובת צלולאז מסחרית בטמפרטורה של 50 מעלות למשך שמונה שעות.
לבסוף, נעשה שימוש בשיטת MBTH כדי לקבוע את שחרור הסוכרים המפחיתים. החומר הצמחי נקצר כגבעולים יבשים, שנחתכים כמקטעים של ארבעה מילימטרים. אלה מונחים בשני בקבוקונים של מיליליטר יחד עם שלושה כדורי מתכת של חמישה מילימטרים.
הבקבוקונים מסומנים בנפרד בברקודים, שנסרקים כדי להבטיח מעקב אחר הדגימות. הדגימות נטענות לתוך רובוטי הטחינה והעיצוב ברובוטים. הדגימות נטחנות ומעורבבות באופן אוטומטי כדי לאפשר חלוקת הביומסה לצלחת של 96 בארות.
הבקבוקונים מנוקבים, ואז הבקבוקון ממוקם מחדש בזרוע הרובוטית כך שהוא יושב בתוך משפך שרוטט כדי להוציא את האבקה. הרטט של המשפך מווסת על ידי איזון כדי להשיג את כמות היעד של מסה לבאר המוחלקת. הביומסה מחולקת ל -10 עמודות של הלוחות, ומשאירה שני עמודים לתקנים.
על ידי ביצוע ארבע חזרות לכל דגימה, אנו מעמיסים 20 דגימות לכל צלחת. ההידרוליזט של צלחת זו ישולש ללוחות PCR, וכתוצאה מכך שלוש לוחות אופטיים. בדרך זו, יש לנו שלוש קביעות של הפחתת סוכרים לבאר ביומסה.
לאחר העיצוב, הלוחות אטומים במחצלת סיליקון כדי למנוע אידוי. כשהם מוכנים, הם מועברים לרובוט הטיפול בנוזלים. בטיפול בנוזלים, טיפול מקדים ברובוט, הידרוליזה של אנזים וקביעת סוכרים משתחררים נעשים באופן אוטומטי.
בשולחן שני המטרים יש מיכלים לריאגנטים השונים הדרושים, כמו גם מקום אחסון לכלי הפלסטיק. ישנן חממות לטיפול מקדים והידרוליזה, כמו גם תרמו-סייקלרים לקביעת הסוכר. הטיפול המקדים נעשה בצלחת הבאר העמוקה.
על ידי הוספת תמיסות חומצה או אלקליין מדוללות לאבקת הביומסה. הלוחות מועברים לגוש החימום ומודגרים בחום של 90 מעלות למשך 20 דקות. בסיום הדגירה הזו, מסירים את הטיפול המקדים על ידי שטיפה חמש פעמים עם מאגר 500 מיקרוליטר אצטט.
לאחר שטיפת הטיפול המקדים, מוסיפים קוקטייל אנזימים. זו תערובת סטנדרטית. הוא מכיל תאית, נובוזים 1, 8 8 ביחס של ארבעה לאחד כריכוז של שבעה FPU לבאר.
הלוחות מודגרים במשך שמונה שעות בחום של 50 מעלות תוך כדי טלטול. 75 מיקרוליטר מההידרוליזט שנוצר מועבר לצלחת PCR. בעמודות 11 ו-12 של לוחות ה-PCR מתווספים תקני הגלוקוז.
לאחר מכן מתווספים 25 מיקרוליטר של טוחנת אחת של נתרן הידרוקסיד לכל הבארות. לבסוף, 50 מיקרוליטר של מגיב MBTH מוזרמים לתוך צלחת ה-PCR. לוחית הבאר העמוקה מאוחסנת לאחר השלמת העברת ההידרוליזט לצלחת ה- PCR השלישית.
ואילו לוחות ה-PCR מועברים לתרמו-סייקלרים לדגירה ב-60 מעלות למשך 15 דקות. השלב האחרון בתהליך הוא העברת תערובת התגובה ללוחות אופטיים לפיתוח צבע. לאחר הדגירה, לוחות ה-PCR מוסרים מהמחזור התרמי.
מאה מגיב מחמצן מיקרוליטר מתווסף לתערובת התגובה המועברת. כדי להקל על התפתחות הצבע, תהליך הטיפול בנוזלים מופעל ארבע פעמים תוך 24 שעות, כאשר השטיפה לפני הטיפול, תוספת של אנזים אורכת כשעתיים. הידרוליזה של האנזים אורכת שמונה שעות, וקביעת הסוכר אורכת שעתיים נוספות.
בזמן שהצלחת הראשונה דוגרת במשך שמונה שעות, הצלחת הבאה מתחילה את התהליך. עם הקצאה זו של משאבי רובוט, מושגת שלוש מנות של 80 דגימות ליום כדי לקבוע את כמות הסוכרים המפחיתים המשתחררים. הלוחות האופטיים מדורגים ב-620 ננומטר.
התוצאות המתקבלות מנותחות כדי לכמת את הסוכרים המשתחררים כננומול למיליגרם לשעת תגובה. אז תודה שצפיתם, ואני מקווה שזה יעניק השראה למחקר שלכם בדלקים ביולוגיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מהירה להערכת פוטנציאל הסכריפיקציה של דגימות ביומאסה צמחיות שונות באמצעות פלטפורמה אוטומטית. התהליך כולל טיפול מוקדם, הידרוליזה וכימות של סוכרים משוחררים בפורמט תפוקה גבוהה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- המרת ביומאסה
- אנרגיה מתחדשת
רקע
- ביומאסה צמחית מכילה סוכרים בפוליסכרידים שקשה לעכל.
- הבנת הנסיגה חיונית לשימוש בחומר צמחי בייצור דלק מתחדש.
- המחקר מתמקד בקביעת פוטנציאל הסכריפיקציה של גנוטיפים צמחיים שונים.
- סינון תפוקה גבוהה יכול לזהות זנים מבטיחים ליישומים תעשייתיים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה למדידת פוטנציאל הסכריפיקציה של ביומאסה צמחית.
- לאפשר את מיצוי הסוכרים לתסיסה לדלקים וכימיקלים.
- לשפר את ההבנה של גורמים המשפיעים על נסיגת הביומאסה.
שיטות ששימשו
- ביומאסה צמחית מטופלת מראש עם תמיסות חומציות או בסיסיות.
- הידרוליזה אנזימטית מתבצעת באמצעות תערובת צלולאז מסחרית.
- סינון תפוקה גבוהה מתבצע בפורמט של צלחת 96 באר.
- כימות סוכרים מחזרים מתבצע באמצעות שיטת MBTH לאחר הידרוליזה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה מהירה של פוטנציאל הסכריפיקציה על פני מספר דגימות.
- ניתן לזהות הבדלים עדינים בנסיגה בין גנוטיפים.
- התהליך האוטומטי מגדיל את התפוקה, ומאפשר ניתוח של 80 דגימות ליום.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לסינון ביומאסה צמחית ליישומים תעשייתיים.
- היא מספקת תובנות לגבי הנסיגה של חומרי צמח שונים.
- גישה זו יכולה לסייע בבחירת זנים צמחיים לייצור דלק ביולוגי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput saccharification assays enable rapid, quantitative assessment of lignocellulosic biomass digestibility, a critical bottleneck in biorefinery feedstock optimization. This platform supports early-stage screening and mechanistic de-risking by revealing genotype-dependent variability in sugar release. The approach enhances predictive confidence for feedstock selection and process development in industrial biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of plant cell wall recalcitrance and digestibility factors.
- Supports identification of genetic or breeding variants with improved saccharification profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying the impact of cell wall composition on sugar release.
- Provides data-driven triage for feedstock advancement in renewable chemical and fuel portfolios.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible saccharification measurements across large sample sets.
- Automates sample preparation, pretreatment, and enzymatic hydrolysis in a 96-well format.
- Generates quantitative outputs (reducing sugars) suitable for comparative analysis and downstream screening.
- Enables scalable evaluation of enzyme formulations and substrate types for process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns laboratory-scale digestibility data with industrial process conditions for translational relevance.
- Supports continuity from genotype screening to preclinical feedstock validation in biorefinery development.
- Reduces risk of late-stage process failure by providing predictive digestibility metrics early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput assay integrates into the discovery-to-development continuum for renewable feedstocks, bridging early genotype screening with preclinical process validation.
- Discovery Biology: Quantifies saccharification potential to clarify biological bottlenecks in cell wall deconstruction.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay outputs for genotype and enzyme evaluation.
- Analytics: Delivers nanomole/mg/hour sugar release data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects laboratory digestibility profiles to industrial biorefinery requirements.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated platform adaptable to diverse plant species and enzyme systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in feedstock selection and process design.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for feedstock advancement and enzyme optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genotypes and process conditions for industrial biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell wall biology and enzymatic hydrolysis analytics.
- Depends on automated liquid handling, grinding, and analytical instrumentation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptable to various plant species and enzyme mixtures with protocol adjustments.
- Throughput and reproducibility are contingent on robotic resource allocation and maintenance.
