Name: תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו שיטה מהירה להערכת פוטנציאל הסכרה של ביומסה צמחית באמצעות פלטפורמה אוטומטית. השיטה כוללת טיפול מקדים, הידרוליזה באנזימים וכימות סוכרים בפורמט 96-well ליישומים תעשייתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות Viksø-נילסן (Novozymes) על המתנה של האנזימים cellulolytic. עבודה זו מומנה על ידי חידוש FP7 ועל ידי פרויקטים BBSRC BB/G016178 ו BB/G016194.

1. הכנת הדגימות בדרך כלל אנחנו עובדים עם נובעת עשבוניים או צמחים עציים. במקרה של חומרים עשבוניים אנו גדלים הצמחים לפדיון, לאחר התפתחות הזרע שאנו אוספים נובעת יבש פעם הזדקנות תושלם. נובעת הן קצוץ לתוך 4 חלקים מ"מ להציב 2 בקבוקוני מ"ל עם שלושה כדורים כרסום. במקרה של חומרים וודי, הדגימות הם הקרקע נסורת גס עם קובץ עץ כמובן ולאחר מכן להציב טחנת כדור לעיבוד נוסף. דגימות ממוקמות במעמד בתוך שחיקה / עיצוב התחנה (איור 1). תחנה זו ברצף טוחן, מערבב, ושוקל כל המדגם. מספר החזרות הדרוש לדגימה היא הוקמה על ידי בדיקת חומר הקרקע בסדרה של ניסויים ראשוניים בהם השתנות פנימי בגודל חלקיק מסוים נקבע. 2 בקבוקוני מ"ל הם דקרו בתחתית ואת החומרים לוותר על הרטט של הבקבוקון על כן נבחר. הזרוע רוטט נשלטת על ידי משוב מן האיזון המאפשר מחלק מדויקת של אבקה. הרובוט dispenses 4 מ"ג / גם בניתוח רגיל 4 חזרות יש צורך ברוב המקרים. זה מאפשר 20 דגימות צמח / צלחת להיות מנותח. 2. Pretreatment לאחר דגימות מעוצבות, הצלחות 96-מעובדים היטב על ידי מערכת טיפול אוטומטי נוזלי (איור 2). הנה המקדים קלה מתבצע על ידי הוספת חומרים צמח 350 μL של חומצה או אלקליין פתרונות וחימום את הצלחת על גוש מותאם. כדי למנוע אידוי במהלך הניתוח, 96 צלחות חתומות היטב עם מאט סיליקון. הטמפרטורה וזמן טיפול מקדים יכול להיות שונה על פי החומרים הנלמד. הטמפרטורה המקסימלית, לעומת זאת, היא 100 ° C. הליך חלופי לבדיקה pretreatments קשים היא pretreat החומרים מעל הקו ולבטל את pretreatmet מן התהליך. 3. הידרוליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי החומרים הם pretreated, הרובוט מסיר אוטומטית את הפתרון המקדים, ושוטף, כל הבארות, 5 פעמים עם 850 μL הצפת Acetate 25 מ"מ. שטיפות מתבצעת על ידי הוספת מאגר לפתרון לפני הטיפול, ולאחר מכן הסרת 50% מהנפח הכולל לאחר המאפשר מוצקים במדגם להתיישב. גובה השאיפה מוגדר מחצית מסת הנוזל, כדי למנוע aspirating מוצקים מתחתית הבאר, יש הפסד זניח של מוצקים באמצעות גישה זו. אחרי אלו רוחץ את ה-pH בבאר הוא 4.5 ואת החומר מוכן הידרוליזה אנזימטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת המכילה אנזים פתרון של cellulases ו hemicellulases נוסף על ידי הרובוט. לתוך כל טוב, 850 μL של תערובת האנזים הוא חילק את צלחת מועבר לתוך 50 ° C רועד חממה. הידרוליזה הסטנדרטי הוא ביצע עבור 8 שעות, אבל הפעם יכול להיות מותאם לצורך הניסוי. טעינת אנזים הסטנדרטית המשמשת עבור עשבים הוא 7 FPU / g של חומר. </li></ol> 4. איתור של הפחתת סוכרים קביעת הפחתת סוכרים שוחרר לאחר הידרוליזה בוצעה באמצעות שונה 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) שיטה 3. MBTH נבחרה השיטה המתאימה ביותר כי זה היה הכי קל להפוך את רגישים פחות להפרעות תרכובות כגון חלבונים. שינינו את השיטה רגישה מאוד לשימוש בפלטפורמת רובוטית, כך שזה יכול לכמת במדויק את ריכוזי סוכרים נוכח hydrolysates ביומסה, עם נפח סופי של 250 μL אשר מתאים צלחת תקן 96 אופטי טוב. כל הפעולות הבאות נעשות באופן אוטומטי ושלושה קביעות עצמאית של הפחתת סוכרים בוצעו עבור כל תגובה saccharification. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 μL של hydrolyzate נלקח הצלחת היטב עמוקה מהולה μL 45 של 25 חיץ נתרן אצטט מ"מ צלחת עקפה 96 PCR היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μL של NaOH 1N ו - 50 μl של תמיסה המכילה 0.43 מ"ג / מ"ל ​​MBTH ו 0.14 מ"ג / מ"ל ​​DTT נוספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, הצלחת PCR היה מחומם על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler או מכשיר דומה אשר מספקת בדיוק את אותה כמות של חום לכל 96 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה וכתוצאה מכך הועבר צלחת אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב oxidising (0.2% FeNH4 (SO4) 2, Sulfamic Acid 0.2% ו 0.1% HCl). מערבבים היטב ולהשאיר לפתח לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת כל צריך להכיל גם תגובות תקן של 50 nmol, 100 ו - 150 nmol גלוקוז nmol. הצלחות אופטיים לקרוא 620 ננומטר. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמאות לסוגים שונים של ניתוחים מוצגות באיור 3 ו -4. כל התוצאות התקבלו באמצעות פלטפורמה אוטומטית. איור 3 מחדשמציג את העלייה הפחתת סוכרים שפורסמו על ידי 8 incubations h מ צפצפה הקרקע עם כמויות גדלות והולכות של אנזימים cellulolytic. איור 4 מציג את ההשפעות של חומצה המקדים אלקליין על דגימות צפצפה. טיפול מקדים NaOH הוא יעיל יותר כי המקדים בדילול H2SO4 בקידום שחרורו של סוכרים במהלך הידרוליזה. הסכום של סוכרים נמדד לאחר הידרוליזה פוחתת כאשר המקדים מבוצע באמצעות ריכוזים גבוהים יותר מאשר NaOH 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לתחנת רובוטית עבור שחיקה 96 עיצוב טוב של ביומסה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. לתחנת טיפול נוזלי עבור ניתוח תפוקה גבוהה saccharification <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. השפעת מקדמי אנזים שונה על שחרורו של הפחתת שווי סוכר ממדגמים צפצפה <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. השפעת pretreatments שונים saccharification של דגימות צפצפה. סוכרים א שוחרר לאחר pretreament עם אחוזים שונים של H2SO4 על 90 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. B. סוכרים שוחרר לאחר pretreatments NaOH בטמפרטורת הזמן אותו מאשר המקדים את החומצה .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

ניתן להשתמש בוריאציות של פרוטוקול הסכריפיקציה הסטנדרטי באותה פלטפורמה לצורך קביעת הפעילות של אנזימים צלולוליטיים (למשל, על ידי שינוי ריכוזי האנזימים בצלחת או שימוש בנייר כתסבס); להשוואת היעילות של תערובות אנזימים שונות על חומר ספציפי; לבדיקת מהלך הזמן של הסכריפיקציה; וכן
פרוטוקול סכריפיקציה (saccharification) סטנדרטי להשוואת פוטנציאל הסכריפיקציה בחומרי צמחים שונים כולל הידרוליזה של שמונה שעות (איורים 3 ו-4). רוב חומרי הצמחים שנבדקו דורשים ארבע חזרות. בתנאים אלו, הפלטפורמה יכולה לעבד 80 דגימות ליום. ניתוח זה משמש לסריקת אוכלוסיות גדולות של שעורה, תירס ו-brachypodium כדי לקבוע את השונות בפוטנציאל הסכריפיקציה ואת הגנים המעורבים בקביעתה4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> גריסה &amp; במשקל רובוט </td><td> Labman אוטומציה </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל שפופרת מיקרו עם כובעים </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ פלדה חרוזים חלד </td><td> Qiagen בע&quot;מ </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene מרובע גם צלחות אחסון </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> טול 050-050C </td></tr><tr><td> Whatman כובע מחצלת עבור 96 צלחות טוב מרובע </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Hanling נוזלי רובוט </td><td> טקאן גרופ בע&quot;מ </td><td> חופש Evo 200 </td></tr><tr><td> Sulphuric חומצה </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> נתרן אצטט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S8750-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 גם PCR צלחות חצאית מלאה </td><td> Sarstedt בע&quot;מ </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone מימה hydrochloride </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 129739-25 גרם </td></tr><tr><td> DL-dithiothreitol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> קורנינג microplate 96 קרקעית שטוחה טוב </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> אמוניום ברזל (III) סולפט dodecahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F1668-250 </td></tr><tr><td> Sulfamic חומצה </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 242772-500 גרם </td></tr><tr><td> חומצת כלור </td><td> פישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה saccharification assay חומרים lignocellulosic

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

סוכרים שמרכיבים ביומסה במפעל lignocellulosic יכול להיות שבור למטה כדי לייצר מגוון של סוכרים, כי לאחר מכן ניתן להשתמש הקמת biorefinery. אלה חומרי הגלם יהווה פלטפורמה התעשייה החדש, שהוא גם בר קיימא פחמן ניטרלי, כדי להחליף את התלות הנוכחי על דלק מאובנים. סרבנות על הדקונסטרוקציה שנצפתה חומרים lignocellulosic מופק על ידי מספר מאפיינים מהותיים של קירות תא הצמח. תאית הקריסטל מוטבע סוכרים כגון מטריקס ו xylans arabinoxylans, ואת המבנה כולו עטוף על ידי פנוליות הפולימר ליגנין, שהוא גם קשה לעיכול 1. כדי לשפר את העיכול של חומרי הצמח אנחנו צריכים לגלות את צווארי הבקבוק העיקריים saccharification של קירות התא וגם מוטציה מסך אוכלוסיות הרבייה להעריך את משונות saccharification 2. משימות אלה דורשות גישה תפוקה גבוהה וכאן אנו מציגים פלטפורמה אנליטית כי ניתן לבצע ניתוח saccharification בפורמט 96-היטב צלחת. פלטפורמה זו פותחה כדי לאפשר את הקרנת העיכול lignocellulose של אוכלוסיות גדולות של מיני צמחים שונים. יש לנו scaled למטה הכרכים תגובה עבור המקדים עדין, הידרוליזה אנזימטית חלקית ונחישות סוכר, כדי לאפשר במספרים גדולים כדי להעריך במהירות מערכת אוטומטית. זו פלטפורמה אוטומטית עובדת עם כמויות מיליגרם של ביומסה, ביצוע כרסום כדור בתנאים מבוקרים כדי לצמצם את חומרי צמח לגודל החלקיקים סטנדרטית באופן לשחזור. לאחר הדגימות הם הקרקע, הרובוט עיצוב אוטומטי dispenses הסכומים שצוינו נרשם חומר לתוך בארות המקביל צלחת 96 באר עמוקה (איור 1). בדרך כלל, אנו מחלקים את אותו חומר תוך 4 בארות יש 4 משכפל לניתוח. לאחר הצלחות מלאים בחומר צמח בפריסה הרצויה, הם מועברים באופן ידני לתחנת טיפול נוזלי (איור 2). בתחנה זו הדגימות כפופים המקדים קלה עם חומצה או לדלל או אלקליין מודגרות בטמפרטורות של עד 90 ° C. הפתרון המקדים יוסר לאחר מכן את הדגימות שטפה עם חיץ להחזיר אותם pH מתאים הידרוליזה. הדגימות מודגרת מכן בתערובת אנזים לאורך זמן משתנה של 50 ° C. Aliquot נלקח hydrolyzate לבין הפחתת סוכרים נקבעים באופן אוטומטי על ידי שיטת colorimetric MBTH.

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

ניתן לפרק פוליסכרידים המרכיבים ביומסה ליגנוצלולוזית של צמחים כדי להפיק מגוון של סוכרים שניתן להשתמש בהם לאחר מכן לביסוס...

שלום, אני קארה טד, אני ליאו. הגיע תורי. ואני סיימון מקווין מייסון.ספיגביליות (digestibility) של ביומסה צמחית היא נושא בעל עניין רב בעת הנוכחית. זאת מכיוון שסוכרים רבים קשורים לפוליסכרידים של דפנות התאי הצמחי המרכיבים ביומסה זו, ואם נשכיל להפיק סוכרים אלו בצורה שמישה, נוכל להמיר אותם בתהליך תסיסה לייצור מגוון מוצרים, כגון דלקים וכימיקלים. למרבה הצער, חומרים אלו קשים מאוד לעיכול, ולהשגת הבנה טובה יותר של הגורמים השולטים בספיגביליות זו יש דחיפות רבה.כדי שנוכל להשתמש בחומר צמחי לייצור קבוצת התחדשות, עלינו להיות מסוגלים למדוד את פוטנציאל ה-ification בצמחים אלו. לכן, כאן באוניברסיטת יורק, אנו סורקים אוכלוסיות גדולות של חומר צמחי כדי לקבוע את פוטנציאל ה-fication שלהן. Fication הוא התהליך של פירוק פחמימות מורכבות למרכיבי המונוסכריד שלהן כדי לייצר כימיקלים בעלי ערך באמצעות תהליכים תעשייתיים שונים.כדי למדוד פוטנציאל סכריפיקציה, אנו משחזרים תהליכים תעשייתיים ברמת מיקרו, שבהם אנו מעבירים את הביומסה קדם-טיפול והידרוליזה אנזימטית כדי לקבוע את כמות הסוכרים ששוחררו. תהליך זה מאפשר לזהות זנים מעניינים בגנוטיפים. מערכת העיבוד בספיקה גבוהה פועלת בפורמט של פלטת IG בעלת שישה בארות.תנאי הידרוליזה מתונים משמשים לחשיפת הבדלים דקים בין גנוטיפים, והם גמישים מספיק כדי לתמוך בחומרי מצע שונים וכן כדי להעריך אנזימים שונים. השיטה שבה אנו משתמשים כוללת עיצוב של חומר צמחי כאבקה, אשר עוברת לאחר מכן טיפול מקדים בחומצה או בבסיס מהולים ב-90 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, מבוצע עיכול אנזימטי באמצעות תערובת cellulase מסחרית ב-50 °C למשך שמונה שעות.לבסוף, נעשה שימוש בשיטת MBTH כדי לקבוע את שחרור הסוכרים החמצוניים. חומר הצמח נאסף כגבעולים יבשים, הנחתכים למקטעים של ארבעה מילימטרים. אלו מונחים למבחנות בנפח של שני מיליליטר יחד עם שלושה כדורי מתכת בקוטר של חמישה מילימטרים.המבחנות מסומנות באופן פרטני באמצעות ברקודים, שנסרקים כדי להבטיח את עקביות המעקב של הדגימות. הדגימות נטענות לתוך רובוטי הטחינה והעיצוב. הדגימות נטחנות ומעורבבות באופן אוטומטי כדי לאפשר חלוקה של הביומסה לתוך פלטה בעלת 96 בארות.המבחנות ננקבות, ולאחר מכן המבחנה ממוקמת מחדש בזרוע הרובוטית כך שהיא נמצאת בתוך משפך הרוטט לפיזור האבקה. רעידות המשפך מנוהלות על ידי מאזניים כדי להשיג את הכמות המטרה של מסה לכל באר המופצת. הביומסה מופצת ל-10 עמודות בלוחיות, כאשר שתי עמודות נשמרות עבור סטנדרטים.על ידי ביצוע ארבע חזרות לכל דגימה, אנו טוענים 20 דגימות לכל פלטה. את ההידרוליזאט של פלטה זו נחלק לשלוש פלטות PCR, מה שיניב שלוש פלטות אופטיות. בדרך זו, נקבל שלוש קביעות של סוכרים מרחזרים עבור כל באר של ביומסה.לאחר העיצוב, הפלטות נאטמות באמצעות משטח סיליקון כדי למנוע התאיידות. כאשר הן מוכנות, הן מועברות לרובוט לטיפול בנוזלים. ברובוט לטיפול בנוזלים, טיפול מקדם, הידרוליזה אנזימטית וקביעת הסוכרים שהשתחררו מבוצעים באופן אוטומטי.על השולחן באורך שני מטרים מונחים מכלים עבור הרכיבים השונים הדרושים, וכן שטח אחסון עבור כלי הפלסטיק. קיימים דגריטורים לשלב הקדם-טיפול ולהידרוליזה, וכן תרמוסייקלרים לקביעת כמות הסוכר. הקדם-טיפול מבוצע בפלטת בארות עמוקות.על ידי הוספת תמיסות חומצה או בסיס מהולות לאבקת הביומסה. את הפלטות מעבירים לבלוק חימום ומדגירים בטמפרטורה של 90 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה, מסירים את חומרי הקדם-טיפול על ידי שטיפה חמש פעמים עם 500 µL של בופר אצטט.לאחר שטיפת טיפול המקדם, מוסיפים תערובת אנזימים. זוהי תערובת סטנדרטית. היא מכילה cellulose ו-novozyme 1, 8 8 ביחס של ארבעה לאחד בריכוז של 7 FPU למערכת (well).את המצעים מדגירים במשך שמונה שעות ב-50 °C תוך כדי ניעור. 75 µL מההידרוליזאט שהתקבל מועברים לפלטת PCR. בעמודות 11 ו-12 של פלטות ה-PCR מוסיפים את תמיכדי הגלוקוז.בשלב הבא, מוסיפים 25 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M לכל הבארות. לבסוף, טפטף 50 µL של ריאגנט MBTH לתוך לוחית ה-PCR. לוחית הבארות העמוקות נשמרת לאחר השלמת העברת ההידרוליזט ללוחית ה-PCR השלישית.בעוד שפלטות ה-PCR מועברות למכשיר הטרמוסייקלר לדגירה ב-60 מעלות למשך 15 דקות. השלב האחרון של התהליך הוא העברה של תערובת התגובה לפלטות אופטיות לצורך פיתוח הצבע. לאחר הדגירה, פלטות ה-PCR מוצאות מהטרמוסייקלר.מאה µL של ריאגנט מחמצן מתווספים לתערובת התגובה שהועברה. כדי להקל על פיתוח הצבע, תהליך טיפול בנוזלים מבוצע ארבע פעמים בתוך 24 שעות, כאשר שטיפת הקדם-טיפול והוספת האנזים אורכות כשעתיים. ההידרוליזה האנזימטית נמשכת שמונה שעות, וקביעת כמות הסוכר אורכת שעתיים נוספות.בזמן שהפלטה הראשונה מדגגרת במשך שמונה שעות, הפלטה הבאה מתחילה בתהליך. באמצעות הקצאה זו של משאבי הרובוט, מושג תפוקת של 80 דגימות ליום כדי לקבוע את כמות הסוכרים החמצניים ששוחררו. הפלטות האופטיות נקראות באורך גל של 620 nanometers.התוצאות המתקבלות מנותחות כדי לכמת את סוכרי השחרור כננומול למילגרם לשעת תגובה. תודה שצפיתם, ואני מקווה שסרטון זה יעניק השראה למחקריכם בתחום הדלקים הביולוגיים.

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן והרכב של פחמימות קיר נגזר.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון אנזימים יעילים בפירוק רב-סוכרים מורכבים בביומסה צמחית באמצעות ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה או ICB. האנזימים מבצעים הידרוליזה של ICB כדי לשחרר אוליגוסכרידים מסיסים הקשורים לצבע, ופעילות האנזים מוערכת על ידי ניתוח קולורימטרי של תוצר התגובה.

בדיקת אנזימים כרומוגנית בלתי מסיסה מבוססת ביומסה: בדיקה להערכת פעילות הפירוק של אנזימים מפרקים ביומסה צמחית

ניתן לאסוף פסולת תעשייתית ולשנות אותה כדי לנתח צמיחה מיקרוביאלית. טכניקות מיצוי ליגנוצלולוז מספקות רכיבים לניתוח יכולת פירוק ביולוגית ספציפית. כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה מזהה תוצרי תסיסה של מיקרואורגניזמים הגדלים על פסולת עיסת. שיטות אלה קובעות את היכולת המטבולית של מיקרואורגניזמים לפרק פסולת עיסה.

שיטות להקלה על גידול חיידקים בזרמי פסולת של טחנות עיסת ואפיון פוטנציאל הפירוק הביולוגי של חיידקים מתורבתים

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

טכניקות אבולוציה והבידוד מסתגלים מתוארות והפגינו להניב נגזרות של stipitis זן Scheffersomyces NRRL Y-7124 כי הם מסוגלים לצרוך hexose במהירות וסוכרים מעורבים פנטוז ב אנזים saccharified hydrolyzates undetoxified וכדי לצבור יותר מ -40 גרם / אתנול L.

טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול

מוצג הטיפול המקדים בביומסה ליגנוצלולוזית בנוזלים יוניים פרוטיים בעלות נמוכה, וכתוצאה מכך עיסה עשירה בתאית דליגנית וליגנין מטוהר. העיסה מולידה תשואות גלוקוז גבוהות לאחר סכריזציה אנזימטית.

המקדים של ביומסה Lignocellulosic עם נוזלים יוניים בעלות נמוכה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

OrganoCat היא שיטה לטיפול מראש ופירוק של ליגנוקולוז בתנאים קלים לתוך ליגנין, סוכרים מותססים, עיסת תאית. במערכת ממס ביוגנית, דו-פאזית של מים ו-2-מתיל-טרהידרופורן עם 2,5-furancarboxylic חומצה כזרז, מוצרי OrganoCat מופרדים במקום להתאוששות מוצר פשוטה.

שבר ביומסה ליגנוקולוסית באמצעות תהליך OrganoCat

למדו שיטה מהירה להערכת פוטנציאל הסכרה של ביומסה צמחית באמצעות פלטפורמה אוטומטית. השיטה כוללת טיפול מקדים, הידרוליזה באנזימים וכימות סוכרים בפורמט 96-well ליישומים תעשייתיים.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

גלה סרטונים נוספים