תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic
3 ביולי 2011
שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.
היי, אני קארה טד, אני ליאו. לך אליי. ואני סיימון מקווין מייסון.
העיכול של ביומסה צמחית הוא נושא מעניין מאוד כיום. הסיבה לכך היא שיש הרבה סוכרים הקשורים בפוליסכרידים של דפנות תאי הצמח המרכיבים את הביומסה הזו, ואם נוכל להוציא את הסוכרים האלה בצורה שמישה, נוכל לתסוס אותם כדי לייצר כל מיני מוצרים כמו דלקים וכימיקלים. למרבה הצער, חומרים אלה קשים מאוד לעיכול והבנה טובה יותר של מה שולט בעיכול זה היא עניין של דחיפות מסוימת.
אז כדי להיות מסוגלים להשתמש בחומר צמחי לייצור קבוצת התחדשות, אנחנו צריכים להיות מסוגלים למדוד את פוטנציאל הייצור במפעלים האלה. אז כאן באוניברסיטת יורק, אנו מסננים אוכלוסיות גדולות של חומר צמחי כדי לקבוע את פוטנציאל הפיקציה שלהם. פיקציה היא תהליך של פירוק פחמימות מורכבות למרכיבי החד-סוכר שלה כדי לייצר כימיקלים יקרי ערך באמצעות תהליכים תעשייתיים שונים.
כדי למדוד את פוטנציאל הפיקציה, אנו משחזרים תהליכים תעשייתיים ברמת מיקרוסקאלה שבה אנו מכניסים את הביומסה לטיפול מקדים והידרוליזה של אנזימים כדי לקבוע את הסוכרים המשתחררים. זה מזהה זנים מעניינים בגנוטיפים. מערכת התפוקה הגבוהה פועלת בפורמט צלחת IG שש בארות.
תנאים קלים של הידרוליזה משמשים לחשיפת הבדלים עדינים בין גנוטיפים, והוא גם גמיש מספיק כדי לתמוך בחומרי מצע שונים כמו גם להעריך אנזימים שונים. השיטה בה אנו משתמשים כוללת עיצוב של חומר צמחי כאבקה, אשר לאחר מכן מטופלת מראש בחומצה מדוללת או אלקליין ב-90 מעלות למשך 20 דקות. לאחר מכן, עיכול אנזימים מתבצע באמצעות תערובת צלולאז מסחרית בטמפרטורה של 50 מעלות למשך שמונה שעות.
לבסוף, נעשה שימוש בשיטת MBTH כדי לקבוע את שחרור הסוכרים המפחיתים. החומר הצמחי נקצר כגבעולים יבשים, שנחתכים כמקטעים של ארבעה מילימטרים. אלה מונחים בשני בקבוקונים של מיליליטר יחד עם שלושה כדורי מתכת של חמישה מילימטרים.
הבקבוקונים מסומנים בנפרד בברקודים, שנסרקים כדי להבטיח מעקב אחר הדגימות. הדגימות נטענות לתוך רובוטי הטחינה והעיצוב ברובוטים. הדגימות נטחנות ומעורבבות באופן אוטומטי כדי לאפשר חלוקת הביומסה לצלחת של 96 בארות.
הבקבוקונים מנוקבים, ואז הבקבוקון ממוקם מחדש בזרוע הרובוטית כך שהוא יושב בתוך משפך שרוטט כדי להוציא את האבקה. הרטט של המשפך מווסת על ידי איזון כדי להשיג את כמות היעד של מסה לבאר המוחלקת. הביומסה מחולקת ל -10 עמודות של הלוחות, ומשאירה שני עמודים לתקנים.
על ידי ביצוע ארבע חזרות לכל דגימה, אנו מעמיסים 20 דגימות לכל צלחת. ההידרוליזט של צלחת זו ישולש ללוחות PCR, וכתוצאה מכך שלוש לוחות אופטיים. בדרך זו, יש לנו שלוש קביעות של הפחתת סוכרים לבאר ביומסה.
לאחר העיצוב, הלוחות אטומים במחצלת סיליקון כדי למנוע אידוי. כשהם מוכנים, הם מועברים לרובוט הטיפול בנוזלים. בטיפול בנוזלים, טיפול מקדים ברובוט, הידרוליזה של אנזים וקביעת סוכרים משתחררים נעשים באופן אוטומטי.
בשולחן שני המטרים יש מיכלים לריאגנטים השונים הדרושים, כמו גם מקום אחסון לכלי הפלסטיק. ישנן חממות לטיפול מקדים והידרוליזה, כמו גם תרמו-סייקלרים לקביעת הסוכר. הטיפול המקדים נעשה בצלחת הבאר העמוקה.
על ידי הוספת תמיסות חומצה או אלקליין מדוללות לאבקת הביומסה. הלוחות מועברים לגוש החימום ומודגרים בחום של 90 מעלות למשך 20 דקות. בסיום הדגירה הזו, מסירים את הטיפול המקדים על ידי שטיפה חמש פעמים עם מאגר 500 מיקרוליטר אצטט.
לאחר שטיפת הטיפול המקדים, מוסיפים קוקטייל אנזימים. זו תערובת סטנדרטית. הוא מכיל תאית, נובוזים 1, 8 8 ביחס של ארבעה לאחד כריכוז של שבעה FPU לבאר.
הלוחות מודגרים במשך שמונה שעות בחום של 50 מעלות תוך כדי טלטול. 75 מיקרוליטר מההידרוליזט שנוצר מועבר לצלחת PCR. בעמודות 11 ו-12 של לוחות ה-PCR מתווספים תקני הגלוקוז.
לאחר מכן מתווספים 25 מיקרוליטר של טוחנת אחת של נתרן הידרוקסיד לכל הבארות. לבסוף, 50 מיקרוליטר של מגיב MBTH מוזרמים לתוך צלחת ה-PCR. לוחית הבאר העמוקה מאוחסנת לאחר השלמת העברת ההידרוליזט לצלחת ה- PCR השלישית.
ואילו לוחות ה-PCR מועברים לתרמו-סייקלרים לדגירה ב-60 מעלות למשך 15 דקות. השלב האחרון בתהליך הוא העברת תערובת התגובה ללוחות אופטיים לפיתוח צבע. לאחר הדגירה, לוחות ה-PCR מוסרים מהמחזור התרמי.
מאה מגיב מחמצן מיקרוליטר מתווסף לתערובת התגובה המועברת. כדי להקל על התפתחות הצבע, תהליך הטיפול בנוזלים מופעל ארבע פעמים תוך 24 שעות, כאשר השטיפה לפני הטיפול, תוספת של אנזים אורכת כשעתיים. הידרוליזה של האנזים אורכת שמונה שעות, וקביעת הסוכר אורכת שעתיים נוספות.
בזמן שהצלחת הראשונה דוגרת במשך שמונה שעות, הצלחת הבאה מתחילה את התהליך. עם הקצאה זו של משאבי רובוט, מושגת שלוש מנות של 80 דגימות ליום כדי לקבוע את כמות הסוכרים המפחיתים המשתחררים. הלוחות האופטיים מדורגים ב-620 ננומטר.
התוצאות המתקבלות מנותחות כדי לכמת את הסוכרים המשתחררים כננומול למיליגרם לשעת תגובה. אז תודה שצפיתם, ואני מקווה שזה יעניק השראה למחקר שלכם בדלקים ביולוגיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מהירה להערכת פוטנציאל הסכריפיקציה של דגימות שונות של ביומסה צמחית באמצעות פלטפורמה אוטומטית. התהליך כולל קדם-טיפול, הידרוליזה וכמותיות של סוכרים משוחררים בפורמט של תפוקה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הצומח
- המרה של ביומסה
- אנרגיה מתחדשת
רקע
- ביומסה של צמחים מכילה סוכרים בפוליסכרידים שקשה לעיכול.
- הבנת יכולת העיכול היא קריטית לניצול חומר צמחי לייצור דלקים מתחדשים.
- המחקר מתמקד בקביעת פוטנציאל הסכריפיקציה של גנוטיפים שונים של צמחים.
- סריקה בתופעת גבוהה (High-throughput screening) יכולה לזהות זנים מבטיחים ליישומים תעשייתיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למדידת פוטנציאל הסכריפיקציה (saccharification) של ביומסה צמחית.
- סיוע בהפקת סוכרים לתהליכי תסיסה לייצור דלקים וכימיקלים.
- שיפור ההבנה של הגורמים המשפיעים על יכולת העיכול של הביומסה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ביומסה של צמחים עוברת טיפול מקדים באמצעות תמיסות חומציות או בסיסיות.
- הידרוליזה אנזימטית מבוצעת באמצעות תערובת צלולאז מסחרית.
- סריקה בתופעת גבוהה (High-throughput screening) מבוצעת בפורמט של פלטת 96 בארות.
- סוכרים מחזרים נמדדים כמותית באמצעות שיטת MBTH לאחר ההידרוליזה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה מהירה של פוטנציאל הסכריפיקציה במספר דגימות.
- ניתן לזהות הבדלים דקים בעיכול בין גנוטיפים שונים.
- התהליך האוטומטי מגדיל את התפוקה ומאפשר ניתוח של 80 דגימות ליום.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לסריקת ביומסה של צמחים עבור יישומים תעשייתיים.
- היא מספקת תובנות לגבי העיכוליות של חומרי צמחים שונים.
- גישה זו יכולה לסייע בבחירת זני צמחים לייצור דלק ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות סכריפיקציה (saccharification) בתפוקה גבוהה מאפשרות הערכה כמותית ומהירה של יכולת העיכול של ביומסה ליגנוצלולוזית, המהווה צוואר בקבוק קריטי באופטימיזציה של חומרי גלם לביו-רפיינרי. פלטפורמה זו תומכת בסינון בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת שונות תלוית-גנוטיפ בשחרור הסוכרים. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החזויית לבחירת חומרי גלם ולפיתוח תהליכים בשרשראות אספקה של ביוטכנולוגיה תעשייתית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של גורמי העמידות והעיכול של דופן התא הצמחי.
- תומך בזיהוי של וריאנטים גנטיים או זני רבייה בעלי פרופילי סכריפיקציה (saccharification) משופרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות השפעת הרכב דופן התא על שחרור סוכר.
- מספק מיון מבוסס נתונים לקידום חומרי גלם בפורטפוליו של דלקים וכימיקלים מתחדשים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מדידות סכריפיקציה סטנדרטיות וניתנות לשחזור על פני מערכי דגימות גדולים.
- מבצע אוטומציה של הכנת דגימות, טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית בפורמט של 96 בארות.
- מפיק פלטים כמותיים (סוכרים מחזרים) המתאימים לניתוח השוואתי ולסריקה המשכית.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של פורמולציות אנזימטיות וסוגי סובסטראטים לצורך אופטימיזציה של תהליכים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים של עיכול במכנה של מעבדה לתנאי תהליך תעשייתיים לצורך רלוונטיות תרגומית.
- תומך ברציפות משלב סריקת הגנוטיפ ועד לתיקוף חומרי גלם פרה-קליניים בפיתוח ביו-רפיינרי (biorefinery).
- מפחית את הסיכון לכשיל תהליכים בשלבים מאוחרים באמצעות אספקת מדדי עיכול חזויים בשלב מוקדם של תהליך העבודה.
אינטגרציה של צינור עיבוד וזרימת עבודה
בדיקה זו, בעלת תפוקה גבוהה, משתלבת ברצף שבין הגילוי לפיתוח של חומרי גלם מתחדשים, ומגשרת בין סריקת גנוטיפים מוקדמת לבין תיקוף תהליכים פרה-קליני.
- ביולוגיה של התגליות: מכמת את פוטנציאל הסכריפיקציה כדי להבהיר צווארי בקבוק ביולוגיים בפירוק דופן התא.
- סריקה: מספק תוצאות בדיקה בעלות סבירות גבוהה ובתפוקה גבוהה להערכת גנוטיפים ואנזימים.
- אנליטיקה: מספק נתוני שחרור סוכר ביחידות של nanomole/mg/hour להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פרופילי עיכול במעבדה לדרישות של ביו-זיקוק תעשייתי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אוטומטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למיני צמחים ומערכות אנזימים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בבחירת חומרי גלם ובתכנון התהליך.
- ערך תפעולי: מתקנן זרימות עבודה, משפר את השחזוריות ומאפשר סקילביליות של תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור קידום חומרי גלם ואופטימיזציה של אנזימים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של גנוטיפים ותנאי תהליך עבור צינורות ייצור בביוטכנולוגיה תעשייתית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של דופן התא הצמחי ובניתוח הידרוליזה אנזימטית.
- תלוי בתשתיות של טיפול אוטומטי בנוזלים, טחינה ומכשור אנליטי.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למיני צמחים ותערובות אנזימים שונות באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- התפוקה והשחזוריות תלויות בהקצאת משאבים רובוטיים ובתחזוקתם.
