הדמיית סידן ספונטנית עבור דינמיקה ספציפית לתא באסטרוציטים

קח כיסוי מצופה פולימר המכיל תרבית מעורבת של נוירון-אסטרוציטים בתא ההקלטה.

תאים טרנספטנטיים אלה מבטאים חלבונים רגישים לסידן על ממברנות הפלזמה וה-ER, וזוהר על קשירת סידן כדי לעקוב אחר דינמיקת הסידן התת-תאית.

הוסף מדיה המכילה יוני סידן וכסה את החדר כדי למנוע אידוי.

הנח את החדר מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

יוני סידן נקשרים לחלבונים הרגישים לסידן. עם הקרנה באור כחול, החלבונים הרגישים לסידן על הממברנה החיצונית של חדר המיון זוהרים בירוק. השתמשו בפלואורסצנטיות הירוקה הזו כדי לאתר אסטרוציטים.

לאחר מכן, הקרינו באור ירוק. החלבונים הרגישים לסידן על קרום הפלזמה זוהרים באדום. אשר את נוכחותה של פלואורסצנטיות אדומה באותו אסטרוציט המציג פלואורסצנטיות ירוקה.

הקלט תמונות זמן-lapse של חלבונים רגישים לסידן על קרום הפלזמה, ואחריהם החלבונים הרגישים לסידן על הממברנה החיצונית של ER.

נתח את התמונות כדי לצפות בפעילות סידן ספונטנית ספציפית לתא באסטרוציט שנבחר.

התקן את הכיסוי המכיל את התאים שהועברו באמצעות Lck-RCaMP2 ו-OER-GCaMP6f לתוך תא ההקלטה של המיקרוסקופ. הוסף 400 מיקרוליטר ממדיום ההדמיה, והניח מכסה על גבי החדר. בחר את ערכת המסננים עבור GCaMP6f ואת מקור האור. אתר את האסטרוציטים המבטאים OER-GCaMP6f.

לאחר מכן, בחר סט פילטרים ומקור אור עבור RCaMP2. ולאשר אם Lck-RCaMP2 מתבטא באותם אסטרוציטים. הקלט תמונות זמן-lapse של Lck-RCaMP2 ב-2 הרץ למשך שתי דקות, ושמור את נתוני ההדמיה.

לאחר מכן, שנה את הגדרת המסנן בחזרה לזו עבור GCaMP6f. הקלט תמונות זמן-lapse של OER-GCaMP6f ב-2 הרץ למשך שתי דקות. לאחר מכן שמור את נתוני ההדמיה.