Name: PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: למד פרוטוקול PCR לזיהוי מולקולרי מהיר של זני Imperata cylindrica בעלי מראה זהה. השיטה מאפשרת הבחנה בין דשא קוגון פולשני לבין עשב הדם היפני הנויי ומונעת התפשטות מינים פולשניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אלן טסקר (USDA-כנימות, ריברדייל, MD), סטיבן קומפטון (Clemson), שרי Aultman (Clemson), קרייג רמזי (USDA-כנימות, פורט קולינס, CO), ובטי Marose (UMD) לקבלת סיוע בהשגת דגימות . אנו מודים לתלמידים אנדרו אדריאן (UA-Huntsville) ודרק Thacker (UA-Huntsville) על עזרתם בבדיקת פרוטוקול זה, ויוסף Herdy עבור עבודתו צילומי וידאו. עבודה זו מומנה על ידי דגים הלאומי קרן חיות הבר.

<ol><li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).</li>
<li>CABI, Crop Protection Compendium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCABI%2C++%22Commonwealth+Agricultural+Bureau+International+%28CABI%29%22">Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI)</a>. , Wallingford, UK. (2007).</li>
<li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+-+Biology%2C+ecology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li>
<li>Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Fort+Collins+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).</li>
<li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+in+the+United+States%3A+History%2C+ecology%2C+impacts%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li>
<li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li>
<li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+E+%22Invasive+Plant+Species+of+the+World%3A+A+Reference+Guide+to+Environmental+Weeds%22">Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).</li>
<li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+from+shaded+and+exposed+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li>
<li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li>
<li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li>
<li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Invasive+Plant+Science+and+Management%22%5BJournal%5D)">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li>
<li>Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).</li>
<li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+of+Miscanthus%2C+Saccharum+and+related+genera+%28Saccharinae%2C+Andropogoneae%2C+Poaceae%29+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li>
<li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li>
<li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+%28Poaceae%29+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Systematics+and+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li>
<li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+boric+acid%3A+a+Tris-free%2C+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li>
<li>Chou, C. -H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+%28L.%29+Beauv.+var.+major+%28Cogongrass%29+populations+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin+of+Academia+Sinica+%28Taipei%29%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

<html> הילדים בארה&quot;ב תעשיות נוף ניזונים טיפוח ומכירת מיני צמחים אקזוטיים רומן. זה, יחד עם הגלובליזציה הגוברת של הסחר, מגביר את הסיכוי זן צמחים פולשניים יהיה להיכנס, להקים, ופרש בארה&quot;ב היכולת לווסת פדרלי צמחים כאלה מסתמך על מידע שהוא לעיתים קרובות אינה זמינה, כולל פוטנציאל להפוך פולשנית , טקסונומיה נכונה, ואבחנה גנטית בין מינים יליד לאזרח. בגלל הידע שלנו על צמחים פולשניים בדרך כלל מוגבל, צמחים מיובאים עם מאפיינים פולשניים מוסתרים הוכנסו רק ברצון ללמוד לאחר מכן כי הם פולשים משאבים חקלאיים וטבעיים שלנו. פרוטוקול זה נועד לטפל בבעיות כאלה הקשורים עם י cylindrica זנים ידי מתן השיטה הראשונה מולקולרית פשוטה שיכולה במדויק להבחין בין wild-type cogongrass וצורת חזרה של עמיתו JBG נוי שלה. &quot;jove_content&gt; עבור פיתוח של פרוטוקול זה, wild-type cogongrass נאסף אוכלוסיות שהתאזרח בבית יחידת קריק יערנות בריכה סנטה רוזה במחוז ליד ג&#39;יי, פלורידה ביוני 2008. JBG היה רכש מהמשתלה מסחרי (הציפור הכחולה משתלת, Inc ..) בחודש יוני 2008 וכן מאוסף של בעל הבית בקולומביה, מיזורי JBG חוזר התקבלו בחצר מוזיאון קמפבל הגיאולוגית ב אוניברסיטת קלמסון, SC ביוני 2008; מאוניברסיטת פארק ריברדייל, MA ביוני 2009; ו מן החצר הקדמית של בעל הבית בקולומביה, מיזורי בשנת 2009 (מזוהה על ידי לילנד Cseke). כל הצמחים נשמרו בחממה ממוקם באוניברסיטת אלבמה בהאנטסוויל (Huntsville, AL). רצף גנטי של ה-DNA שנאספו מצמחים אלה כלל בהשוואות עומק של 9 אזורים דנ&quot;א עצמאיים הנפוצים לצמחים ברקוד 2. בכל מקרה, רצף של JBG היו במשחק 100% לאלו של JBG לחזור, ובכך עוזרלוודא כי אכן JBG לחזור לטופס, ירוק פולשנית. רק ITS גרעיני trnL-F אזורים הכלורופלסט יש הבדלים שניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין גנטית cogongrass ו JBG. באזור שלה יש בסך הכל 3 SNPs (פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד) בין cogongrass ו JBG, ואילו באזור trnL-F יש 2 SNPs ו 2 InDels (הוספות ומחיקות). אלה הבדלים גנטיים שונים מותר ספציפיים primers ה-PCR יש לפתח שיכולים להבחין בין wild-type cogongrass ו JBG חוזר. את התוצאות הכי אמין הגיעו primers שמקורם באזור trnL-F plastid. כך, פרוטוקול זה מבוסס על ההבדלים בין רצף ה-F-trnL אזורים בגנום הכלורופלסט של cogongrass, JBG וחזרו JBG (איור 4). כדי לסייע ביצירת פריימרים ספציפיים יותר את הזנים הנדונים ועל מנת למנוע תוצאות חיוביות שגויות ממינים הקשורים באופן הדוק, אלידוע וסעד trnL-F רצפים של א זנים cylindrica הושוו trnL-F רצפים ממינים דשא הקשורים (43 רצפים עצמאיים מ 29 מינים, כגון Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, קמיליה Miscanthus, Saccharum officinarum, halepense דורה). אמנם, בחנו מגוון ספציפיים רצפים פריימר על 29 מינים של הדשא, את הספציפיות של מגוון ספציפיים primers לא נבדקה באופן מקיף על יכולתו להגביר את ה-DNA מרוב מיני דשא אחרים. כתוצאה מכך, רקמת משמש להפקת DNA יש לזהות היטב כמוני cylindrica לפני החל בפרוטוקול זה. אם הדשא לא ניתן לזהות או cogongrass או JBG, אז אנחנו מציעים רצף של מוצר ה-PCR על מנת לוודא כי הם רצפים התאמה מדויקת כדי cogongrass או JBG. נכון לעכשיו, השיטה המדויקת ביותר כדי לוודא את זהותו של הדגימה הדשא נתון הוא לבצע PCR על שניהם לאrnL-F ואזורים שלה, שייבדק על ידי רצף של מוצרי ה-PCR והשוואה של רצפים על רצפים של מינים ידועים לזהות במדויק. ה-DNA יכול להיות מוגבר באמצעות primers בקרה המפורטים בפרוטוקול זה (לאזור trnL-F) או פריימרים אחרים הזמינים בפרסומים אחרים 13-15. סידור העבודה הוא הרבה יותר ועלות אינטנסיבית יותר באמצעות הליך פשוט שלנו. האיכות של פריימרים המשמשים PCR היא קריטית להצלחת ההליך. עשינו את primers עבור הליך זה זמין אלכסוני ביו, Inc ( <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). יתרון הזמנת את primers מ ביו אלכסוני היא שהם לאחסן מספר רב של aliquots של צבע יסוד אחד מתוך סדרת ייצור זהה מדגם כמו primers השתמשנו לאופטימיזציה במעבדה שלנו. כתוצאה מכך, primers לא רק את רצף זהה, אך לאהיי באים הרבה הייצור המדויק ששימשה בפרוטוקול זה. באמצעות פריימרים ממגרש זאת, יכול לסייע במניעת משתנים חיצוניים בהליך הנובעים הבדלים באיכות של primers PCR. כמו כן, בעוד אחרים polymerases Taq אמור לעבוד בסדר עבור ה-PCR, איכות פולימראז Taq בשימוש תהיה השפעה על איכות תוצאות ה-PCR. כדי לאפשר מרקם טוב יותר PCR ריאגנטים, יש לנו מותאם פרוטוקול באמצעות חומרים כימיים מ Clontech. 2 Advantage פולימראז (Clontech, Mountain View, קליפורניה, חתול # 639201 או 639202) הוא תערובת של פולימראז חזקים, Taq חם ההתחלה האנזים הוכחה קריאה המסייע לספק סגוליות גבוהה amplifications מדויקות יותר. כי פרוטוקול זה מסתמך על ה-DNA הכלורופלסט, אשר ירש אימהי של עשבים, אירועים הכלאה בין גנוטיפים cogongrass ו JBG לא יכול ליפול בפח עם הליך הזיהוי המולקולרי שלנו. במקרים בהם hypridization הוא suspected, מומלץ להשתמש באזורים גרעיני שעברו בירושה משני ההורים. הנפוץ ביותר לא plastid האזור משתנה לשקול genotyping המפעל הוא האזור גרעינית ריבוזומלי ITS 13-15,17. נכון לעכשיו, אנו מתקדמים לקראת ריבוב הגברה של האזור הכלורופלסט trnL-F עם זה של אזור הגרעין שלה בצינור PCR אחת. ריבוב plastid עם אזורים דנ&quot;א גרעיני היה פוטנציאל לעקוף את מגבלות השימוש לבד, עם זאת, שיטות אלו דורשות אופטימיזציה והערכה נוספת כדי לקבוע היתכנות על מקרה לגופו. השימוש כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) וטכנולוגיות חדשות יותר, כגון אלומות מולקולריות (בדיקות פריימר ניאון), הם גם העריכו כמו שיטות genotyping כשל ומדויק הצמח. הפרוטוקול המובא כאן מספק גישה מהירה ואמינה להבחין JBG לחזור מזה של wild-type cogongrass. אנו ממליצים להשתמשRS פרוטוקול זה לפנות אלינו על מנת לדווח על תוצאות הנובעת משימוש של פרוטוקול זה. מידע משותפים אלה יסייעו לספק מידע על התפלגות JBG חוזר. זה גם יעזור הרגולטורים ב USDA לקבל החלטות מושכלות על פעולות שניתן צריך לעקוף את התפשטות פוטנציאל הכלאה של זנים פולשניים מאוד cogongrass.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DNeasy הצמח מיני קיט </td><td> Qiagen, ולנסיה, CA </td><td> 69104 או 69106 </td><td> כל הגנומי מכובד במפעל ערכת ה-DNA כי התשואות DNA באיכות טובה אמורה לפעול על נהלים אלה. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> בקרה חיובית קדימה פריימר </td></tr><tr><td> trnL (אקסון &#39;5), C </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> הפוך פריימר בקרה חיובית </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> קדימה wild-type cogongrass פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> להפוךwild-type cogongrass פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> קדימה JBG ו JBG לחזור פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> הפוך JBG ו JBG לחזור פריימר </td></tr><tr><td> היתרון ultrapure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> 2 היתרון פולימראז </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639201 או 639202 </td><td> טוב הוכחה לקריאה, חם תחילת Taq פולימראז </td></tr></tbody></table>

pcr מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של imperata cylindrica</em

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) הוא אחד מעשרת המפעלים המובילים פולשניים הגרועים ביותר בעולם, המשפיעים לרעה על משאבים חקלאיים וטבעיים ב 73 מדינות שונות ברחבי אפריקה, אסיה, אירופה, ניו זילנד, אוקיאניה ואמריקה 1-2. Cogongrass טפסים במהירות, להפיץ, דוכני monodominant כי את מקומו של מגוון רחב של מיני צמחים מקומיים בתורו לאיים על בעלי חיים מקומיים התלויים המין העקורים צמחים מקומיים עבור מספוא ומחסה. כדי להוסיף על הבעיה, מגוון נוי [א cylindrica var. koenigii (Retzius)] משווק באופן נרחב תחת שמות &quot;Rubra&quot; Imperata cylindrica, אדום ברון, ועשב הדם היפנית (JBG). מגוון זה הוא סטרילי putatively ו פולשנית ונחשב נוי רצוי עלים בצבע אדום שלה. עם זאת, בתנאים הנכונים, JBG יכול לייצר זרע בר קיימא (קרול Holko, 2009 תקשורת אישית) והוא יכול לחזור ירוק אניטופס nvasive כי היא לעתים קרובות נבדל cogongrass כפי שנדרש על המאפיינים הייחודיים של מגוון wild-type פולשנית 4 (איור 1). זה עושה את הזיהוי באמצעות מורפולוגיה משימה קשה אפילו מאומנים היטב הטקסונומים הצמח. חזרה של JBG כדי פנוטיפ ירוק אגרסיבי הוא גם לא נדיר. באמצעות השוואות רצף של קידוד אזורי ב-DNA משתנה גם גרעיני הכלורופלסט, יש לנו אישר כי JBG חזר לסורו פולשנית ירוק בתוך מדינות מרילנד, דרום קרוליינה, מיזורי. JBG נמכרה ושתל במצב כמעט בכל ביבשת ארה&quot;ב שבה אין התפשטות פעיל cogongrass. היקף הבעיה לחזור ב לא הבין היטב כי הצמחים הם חזרו והרסו מתועד לעתים קרובות. יישום של פרוטוקול זה מספק שיטה מולקולרית כדי לזהות JBG חוזר והוא יכול לסייע לשמור על אלו סוגים של שיתוף המתרחשיםND ואולי והכלאה. Cogongrass הוא outcrosser מחייבים, וכאשר חצה עם גנוטיפ אחר, יכול לייצר רוח התפזרו קיימא הזרעים להפיץ cogongrass למרחקים רחבים 5-7. JBG יש גנוטיפ שונה במקצת מאשר cogongrass ו יוכלו ליצור כלאיים קיימא עם cogongrass. כדי להוסיף על הבעיה, JBG קר יותר בצל סובלנית יותר cogongrass 8-10, ואת זרימת גנים בין שני זנים עשוי ליצור כלאיים, כי הם יותר אגרסיביים, בצל סובלנית, וקרה הארדי מ wild-type cogongrass. בעוד wild-type cogongrass כיום פושט מעל 490,000,000 דונם ברחבי העולם, בארה&quot;ב ובדרום מזרח הוא פושט על 500,000 דונם והוא מסוגל לכבוש ביותר של ארה&quot;ב כפי שהוא מתפשט במהירות צפונה בשל נישה רחבה שלה 3,7,11 הפוטנציאל הגיאוגרפי. הפוטנציאל של מעבר גנטית היא דאגה רצינית עבור התוכנית הפדרלית USDA-כנימות שבוע רעילים. נכון לעכשיו, משרד החקלאות, כנימות אוסר JBG במדינות ש&quot;שפה יש מכת cogongrass הגדולות (למשל, פלורידה, אלבמה, מיסיסיפי). עם זאת, למנוע שני סוגים של שילוב יכול להוכיח קשה יותר cogongrass ו JBG להרחיב הפצות שלהם. יתר על כן, חלוקת JBG לחזור אינו ידוע כרגע, ללא יכולת לזהות סוגים אלה באמצעות מורפולוגיה, כמה מכת cogongrass עשוי להיות תוצאה של JBG חוזר. למרבה הצער, שיטות מולקולריות שוטפות של זיהוי בדרך כלל לסמוך על AFLP (מוגבר אורך פולימורפיזמים שבר) ואת רצפי DNA, הן אלו זמן רב ויקר. כאן, אנו מציגים 1 חסכונית ואמינה המבוססת על שיטת ה-PCR genotyping מולקולרית במדויק להבחין בין cogongrass ו JBG לחזור.

אנו מספקים פרוטוקול חסכונית ומהירה genotyping מולקולרי מעסיקה מגוון ספציפיים primers ה-PCR כי ה-DNA היעד רצף ההבדלים בתוך אזור trnL-F הכלורופלסט spacer להבחין בין סוגים שונים של<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) שלא ניתן להבחין על ידי המורפולוגיה לבד. זנים אלו כוללים את העשב מזיק רשומים פדרלי, cogongrass מקרוב בנושא, התפשטות רחבה במגוון נוי, אני<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (עשב דם יפני).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

I. cylindrica (עשב קוגון) מסוג פרא הוא אחד מעשרת הצמחים הפולשים הגרועים ביותר בעולם, אשר משפיע לרעה על משאבים חקלאיים וטבעיים ב...

המטרה העיקרית של הליך זה היא לספק פרוטוקול גנוטיפ פולרי מהיר וחסכוני, המסוגל להבחין בין זנים של Retta cylindrica, המכונה בדרך כלל gon grass, שאינם ניתנים להבחנה על בסיס מורפולוגיה בלבד. דבר זה מושג תחילה על ידי זיהוי ובידוד רקמה מזן gon grass רלוונטי. השלב הבא הוא מיצוי DNA גרעיני ופלסמי מהרקמה שנאספה.בשלב הבא, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוצעת על ה-DNA שהופק, תוך שימוש בפריימרים ספציפיים לזן המכוונים להבדלי רצפים באזור ה-turn LF של ה-PLAs, וכן בבקרה חיובית ושלילית מתאימות. השלב הסופי הוא ביצוע אלקטרופורזה בג'ל עבור כל אחת מארבע תגובות ה-PCR כדי להנחית ולהדגים את תוצרי ה-PCR שהוגברו. בסופו של דבר, נקבע הזן של דשא הגון (gon grass) שנאסף באמצעות ניתוח של פסי תוצרי ה-PCR הספציפיים לזן שהתקבלו בג'ל. צמחים פולשים עולים לארצות הברית כ-3.4 מיליארד דולרים מדי שנה, וגורמים לנזק משמעותי הן למשאבים חקלאיים והן למשאבים טבעיים.הסוג הפראי של *Imperata cylindrica*, המכונה גם דשא קוגן (Cogan grass), נחשב לאחד מעשרת העשבים הפולשים הגרועים ביותר בעולם. דשא קוגן מתפשט במהירות ומקים אוכלוסיות מונו-ספציפיות הדוחקות צמחייה מקומית, ובכך משפיעות על בעלי החיים התלויים בצמחייה זו. דשא קוגן פולש כיום ל-490 מיליון דונם ברחבי העולם ולכ-500,000 דונם בארצות הברית. זן נושאי של *I. cylindrica* משווק באופן נרחב תחת השמות *I. cylindrica*, Arbra, Red Baron ודשא דם יפני, אליו נתייחס כ-JBG. זן זה נחשב כסטרילי ולא פולשני, והוא מבוקש בשל עלייו בעלי הגוון האדום.בתנאים מסוימים, דשא דם יפני יכול להפיק זרעים חיוניים ולחזור לצורה ירוקה לחלוטין שאינה ניתנת להבחנה מדשא קוגן מסוג בר. כפי שניתן לראות, לשניהם יש עלים ירוקים והם גדולים יותר מהזן הדקורטיבי המסורתי ובעלי עלים גדולים יותר. בנוסף, לצמחים שחזרו לצורתם המקורית ולצמחים מסוג בר יש רזומות גדולות יותר, מה שמגדיל את הפוטנציאל לרבייה אל-מינית של הזן הדקורטיבי.הנסיגה הופכת את הזיהוי למבוסס על מורפולוגיה בלבד. זוהי משימה מאתגרת. שיטות מולקולריות מספקות אמצעי להבחנה מדויקת בין צמחים פולשים לבין חומרי צמחים שלא ניתן לזהות באמצעים חזותיים רגילים.שיטות מולקולריות הן קריטיות להגנה מפני התפשטות והחדרה של צמחים פולשים. יישום פרוטוקול מולקולרי זה מספק אמצעי להבחנה מדויקת בין צמחי Japanese blood grass שהחזירו את תכונותיהם המקוריות לבין Kogan grass. פרוטוקול זה עשוי לסייע במניעת הופעה משותפת עם Kogan grass ומניעת אפשרות להיווצרות של היברידים בעלי יכולת השרדה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון פולימורפיזם של אורכי מקטעים מוגברים (AFLP) או ריצוף DNA, הוא שהיא מספקת שיטה יעילה כלכלית ומהירה לטיפוס גנטי מולקולרי, שיכולה להבחין בקלות בין דגמי בר של kogan grass לבין זנים של Japanese blood grass. את הטכניקה ידגים ג'וזף הרי, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. ראשית, זהו דגימה מאתר שבו גדלים kogan grass או Japanese blood grass ויש צורך להבדיל ביניהם.ניתן להבדיל בקלות בין דשא דם יפני לבין דשא קוגן מסוג פרא באמצעות העלים האדומים הבוהקים שלו. עם זאת, דשא דם יפני שהחזר את תכונותיו (revert) כמעט ואינו ניתן להבחנה מדשא קוגן, שכן לשניהם עלים ירוקים ארוכים יותר, שטח עלים גדול יותר וריזומות גדולות יותר מאשר לדשא דם יפני דקורטיבי. ניתן להשתמש בשיטה זו על רקמות עלים טריות, קפואות וכאלה שיובשו לאחרונה.אם מאחסנים רקמות לצורך הפקת DNA במועד מאוחר יותר, השיטה הטובה ביותר היא להקפיא ולאחסן את הרקמה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס באופן מיידי. אם נדרש אחסון יבש, יש להניח את הרקמה במעטפת נייר ולאחסן את המעטפת בסיליקה ג'ל מיובשת או בחומרים מייבשים פעילים אחרים בטמפרטורת החדר. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, יש לוודא כי ה-DNA מופק תוך שלוש שעות מהאיסוף כדי למנוע דה-גרדציה.נוהל זה משתמש בערכה קטנה (mini kit) של DNEZ plants מבית Kyogen בהתאם להוראות היצרן עם שינוי מינורי אחד. הנוהל הותאם כך שישמשו יותר מ-100 milligrams של רקמה טרייה או קפואה, או יותר מ-20 milligrams של רקמה מיובשת. ראשית, גרסו יותר מ-100 milligrams של רקמת עלה טרייה או קפואה, או יותר מ-20 milligrams של רקמת עלה יבשה, לאבקה דקה באמצעות שלושה סבבים של חנקן נוזלי תוך써 גרס במכתש ועלי פיתה מקוררים.שקלו את האבקה הקפואה מרקמה טרייה או קפואה למנות של 100 milligram. במידה שמשתמשים ברקמת עלים יבשה, שקלו את האבקה למנות של 20 milligram. לאחר שלב זה, המשיכו במיצוי ה-DNA בהתאם להוראות היצרן תוך שימוש בספקטרופוטומטר, כגון בדיקת NanoDrop spectrophotometer; תנובות DNA איכותיות בכמות טובה צריכות להיות בין 50 ל-150 nanograms per microliter, עם יחסי 260/280 ו-230/280 קרובים ל-2.0, כפי שניתן לראות כאן.בצעו אלקטרופורזה באמצעות ג'ל 1%AROS סטנדרטי. ודאו את נוכחותן של פסים גדולים יחסית, הגדולים מ-10 KB, עם מעט או ללא מריחה הנובעת מזיהום RNA; אם ריכוז ה-DNA גבוה, דללו את הדגימות ל-70 nanograms per microliter עבור השלבים הבאים. הפריימרים ל-PCR המשמשים בפרוטוקול זה, המסומנים בחצים האדומים והירוקים, מבוססים על הבדלי רצף בין אזור המרווח LF (plastered turn LF spacer region) של גנוטיפים של Cogan grass ו-Japanese blood grass.הבדלים אלו מופיעים כפולימורפיזם של נוקליאוטיד בודד (SNP) והכנסות ומחיקות (insertions and deletions), המסומנים בחצים שחורים אנכיים, ואשר מאפשרים פיתוח של פריימרים ספציפיים לזן. על ידי מיקום הפריימרים באתרים של רצפים ייחודיים, רצפי הפריימרים מופיעים בחלק הכתוב של הפרוטוקול עבור כל דגימת DNA מבודדת. הכינו שתי תגובות PCR בנפח של 50 µL בתוך מבחנות PCR בעלות דופן דקה בנפח 0.2 mL על קרח, תוך שימוש בכל סט פריימרים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. אם ריכוז ה-DNA נמוך, ניתן להוסיף יותר DNA לכל תגובה תוך התאמת כמות המים הזיקוקים הכפולים נטולי הנוקליאז, כך שנפח התגובה הכולל יישאר 50 µL.אין להשתמש ביותר מ-5 µL של DNA או ב-10% מהנפח הכולל לכל תגובה, שכן זיהומים המכילים את דגימות ה-DNA עלולים לעכב תגובות PCR; כדי להבטיח שכל ריאגנטי ה-PCR פועלים, יש להכין ביקורת חיובית. בעזרת הפריימרים של הביקורת החיובית, הכינו את הביקורת השלילית באמצעות אותה מערכת פריימרים של הביקורת החיובית, אך עם מים מזוקקים פעמיים במקום ה-DNA שחולץ; בשלב זה, ישנם בסך הכל ארבע תגובות PCR עבור כל דגימה שנבדקת. לאחר מכן, בצעו הגברה ב-PCR בתרמוסייקלר (thermocycler) המצויד במכסה מחומם, תוך שימוש בפרמטרי מחזור ה-PCR המופיעים בפרוטוקול הכתוב; ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של טמפרטורת ההישמט (annealing) של הפריימרים, זמני ההארכה ומספר המחזורים, בהתאם לאיכות ה-DNA, לפריימרים, לפולימראז או לסוג התרמוסייקלר שבו נעשה שימוש.לאחר השלמת תגובות ה-PCR, הפר את תוצרי ה-PCR על ג'ל 1% באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית. הרץ את הדגימות במתח של כ-120 וולט עד שחזית ה-D תגיע לשלושה רבעים מאורך הג'ל הכולל. הדמיין את הג'ל תחת אור UV ובדוק את הפסים שהתקבלו כדי לראות אם מקטע DNA מתאים הוגבר.ג'ל מייצג זה מציג את תוצאות האלקטרופורזה של תוצרי PCR שהופקו מדגימות DNA של Kogan grass, Japanese blood grass ו-Japanese blood grass revert בשילוב עם פריימרים ספציפיים ל-Kogan grass ו-JBG, כמו גם בקרת חיוביות של turn LF ובקרת שליליות ללא תבנית (no template). סט הפריימרים של בקרת החיוביות turn LF פועל באותה יעילות עבור Cogan grass, Japanese blood grass, Japanese blood grass revert ודגשרי דשא אחרים, ויוביל להופעת פס באורך 890 base pairs. אם כל ריאגנטי ה-PCR נקיים מזיהומי DNA, תגובת בקרת השליליות לא תניב תוצר PCR.אם דגימת ה-DNA מופקת מעשב קוגן מסוג פרא (wild type), תגובת PCR באמצעות מערכת הפריימרים הספציפית לעשב קוגן תניב פס בודד באורך של כ-595 זוגות בסיסים, בעוד שהפריימרים הספציפיים ל-JBG לא יניבו פס. באופן דומה, אם דגימת ה-DNA מופקת מ-JBG או מתגובת J-B-G-A-P-C-R שהוחזרה, שימוש במערכת הפריימרים הספציפית ל-JBG יניב פס בודד באורך של כ-594 זוגות בסיסים, בעוד שהפריימרים הספציפיים לעשב קוגן לא יניבו פס.מכיוון של-JBG ול-JBG שהחזירו את תכונותיהם (reverted JBG) יש רצפי חומצות גרעיניות זהים, יהיו להם דפוסי רצועות זהים. עם זאת, ההבדלים המורפולוגים בין JBG לבין JBG שחזרו הם ברורים למדי, כך שבעוד שתוצאות ה-PCR יהיו זהות, ניתן להבחין בקלות בין זני ה-JBG ברמת הצמח. ריצוף DNA של תוצרי ה-PCR יכול לזהות שינויים אפשריים ברצפי ה-DNA עבור אקוטיפים שונים של cogan grass.פיתוח טכניקה זו מספק את השיטה המולקולרית המפושטת הראשונה שיכולה להבחין במדויק בין סוג הבר (wild type) של K and grass לבין הצורה ההוזרת (reverted form) של זן הנוי שלו, Japanese blood grass. אנו מעודדים את המשתמשים בפרוטוקול זה ליצור איתנו קשר כדי לדווח על התוצאות שהתקבלו מהשימוש בפרוטוקול. שיתוף מידע זה יסייע באספקת נתונים על התפוצה של Japanese blood grass.דבר זה יסייע גם למסמיחים ב-USDA לקבל החלטות מושכלות לגבי פעולות שעשויות להיות נחוצות כדי למנוע את התפשטותם ואת ההכלאה הפוטנציאלית של זני Cogan grass הפולשניים ביותר.

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) היא כלי יעיל לאבחון רמות ה-mRNA ברקמות חרקים שונים, שלבי התפתחות. בדוח זה אנו מציגים את השימוש qRT-PCR כדי לברר רמות ה-mRNA ברקמות הזחל שונים שלבי ההתפתחות של מינים פולשניים חרקים, דקור ברקת אפר.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

הגישה הישירה PCR מוצגת כאן מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של צמח unpurified ורקמות בעלי חיים.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מעקב גנומית דנ א (gDNA) זיהום בדגימות ה-RNA. השיטה הציג מנצל תחל ספציפיות עבור אזור פנימי מרווח משועתקים (ITS) של גנים ribosomal DNA (rDNA). השיטה מתאים זיהוי אמין, רגיש לזיהום DNA ברוב פרוקריוטים, אאוקריוטים.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול המתואר כניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM)-היעד מבוסס המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע). שיטה זו משתמשת שינויים פלואורסצנטית במהלך ההיתוך של דופלקס ה-DNA והוא מתאים הקרנת תפוקה גבוהה של הן הכניסה/מחיקה (Indel) ו-substition בסיס יחיד (SBS).

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.

קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים

מוצג כאן פרוטוקול לזיהוי שדה של קמומילה מטריקריה באמצעות מערכת qPCR ניידת. פרוטוקול קל לביצוע זה אידיאלי כשיטה לאמת את זהותו של מין בוטני במקומות שבהם הגישה לציוד מעבדה ומומחיות מוגבלת, כגון חוות ומחסנים.

זיהוי שדה של קמומילה מטריקריה באמצעות מערכת qPCR ניידת

מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת, המשלבת האבקות שדה ומעבדות ותצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות עם זיהוי של S-genotypes על ידי PCR וניטור הפריחה לבחירת מאביקים.

קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי

פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע סקרים אקולוגיים בקנה מידה גדול של נמטודות Caenorhabditis עצמית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ארגון יעיל וניתוח של נתונים אקולוגיים ומולקולריים הקשורים לנמטודות שנאספו מהטבע.

גישה מדרגית מאוד לביצוע סקרים אקולוגיים של נמטודות קאנורהבדיטיס Selfing

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.

קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

למד פרוטוקול PCR לזיהוי מולקולרי מהיר של זני Imperata cylindrica בעלי מראה זהה. השיטה מאפשרת הבחנה בין דשא קוגון פולשני לבין עשב הדם היפני הנויי ומונעת התפשטות מינים פולשניים.

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica

גלה סרטונים נוספים