PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica

המטרה העיקרית של הליך זה היא לספק פרוטוקול גנוטיפ מולקולרי חסכוני ומהיר שיכול להבדיל בין זנים של Retta cylindrica, הנקראים בדרך כלל עשב גון, שלא ניתן להבחין ביניהם על ידי מורפולוגיה בלבד. זה מושג על ידי זיהוי ובידוד רקמה ממגוון עשב גון מעניין. השלב הבא הוא חילוץ DNA גרעיני ומטויח מהרקמה שנאספה.

תגובת השרשרת הבאה של פולימראז מבוצעת על ה-DNA המופק באמצעות פריימרים ספציפיים למגוון המכוונים להבדלי רצף באזור ה-PLA שהופך ל-LF, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות מתאימות. השלב האחרון הוא לבצע אלקטרופורזה של ג'ל בכל אחת מארבע תגובות ה-PCR כדי להמחיש את תוצרי ה-PCR המוגברים. בסופו של דבר, מגוון עשב הגון שנאסף נקבע באמצעות ניתוח של המגוון המתקבל איסורים ספציפיים על מוצרי PCR על הג'ל תוכניות פולשניות עולות לארצות הברית כ-3.4 מיליארד דולר בשנה, וגורמות נזק משמעותי למשאבי חקלאות וטבע כאחד.

אימפרטו אלקטריקה, הידוע גם בשם קוגן, דשא הוא אחד מעשרת העשבים הפולשים הגרועים ביותר בעולם. עשב קוגן יוצר התפשטות מהירה בדוכני מונו שמחליפים צמחייה מקומית, ובתורם, בעלי החיים התלויים בצמחייה המקומית הזו עשב GaN שורץ כיום 490 מיליון דונם ברחבי העולם וכ-500,000 דונם בארצות הברית ומגוון נוי של ti של tus centrica משווק באופן נרחב תחת השמות tus Centrica, ארברה, בארן אדום, ודם יפני גס כפי שנקרא לזה JBG. זן זה הוא סטרילי ולא פולשני לכאורה, ונחשב לנחשק בזכות העלים האדומים שלו.

בתנאים מסוימים, עשב דם יפני יכול לייצר זרעים ברי קיימא ולחזור לצורה ירוקה לחלוטין שלא ניתן להבחין בה מעשב קוגן מסוג בר. כפי שאתה יכול לראות, לשניהם יש עלים ירוקים והם גדולים יותר מזן נוי מסורתי עם עלים גדולים יותר. בנוסף, לצמחים המוחזרים והפראיים יש קני שורש גדולים יותר וזן הנוי מגדיל את פוטנציאל הרבייה הא-מיני שלו.

ההיפוך מבצע זיהוי באמצעות מורפולוגיה בלבד. משימה קשה. שיטות מולקולריות מספקות אמצעי להבחנה מדויקת בין צמחים פולשים וחומרים צמחיים שאינם ניתנים לזיהוי באמצעים חזותיים רגילים.

שיטות מולקולריות הן קריטיות להגנה מפני התפשטות והחדרה של צמחים פולשים. יישום פרוטוקול מולקולרי זה מספק אמצעי להבחין במדויק בין עשב דם יפני לעשב קוגן. פרוטוקול זה יכול לסייע במניעת התרחשות משותפת עם עשב קוגן והיווצרות אפשרית של כלאיים ברי קיימא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כגון פולימורפיזם באורך שבר מוגבר, או ניתוח FLP ודברים כמו ריצוף DNA, הוא שהיא מספקת טכניקת גנוטיפ מולקולרית חסכונית ומהירה מאוד שיכולה להבחין בקלות בהבדל בין עשב קוגן מסוג בר לבין זנים של עשב דם יפני. מדגים את הטכניקה ג'וזף הרי, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. ראשית זהה דגימה מאתר שבו גדלים עשב גון או עשב דם יפני ויש להבדיל ביניהם.

עשב דם יפני נבדל בקלות מעשב גון מסוג בר על ידי העלים האדומים הבוהקים שלו. עם זאת, כמעט ולא ניתן להבחין בין עשב הדם היפני לבין עשב קוגן מכיוון שלשניהם יש עלים ירוקים ארוכים יותר, שטח עלים גדול יותר וקני שורש גדולים יותר מעשב הדם היפני הנוי. ניתן להשתמש בשיטה זו על רקמות עלים טריות, קפואות ומיובשות לאחרונה.

אם מאחסנים רקמות למיצוי DNA במועד מאוחר יותר, השיטה הטובה ביותר היא להקפיא ולאחסן את הרקמה במינוס 80 מעלות צלזיוס באופן מיידי. אם יש צורך באחסון יבש, הניחו את הטישו במעטפת נייר ואחסנו את המעטפה בסיליקה ג'ל מיובש או בחומרי ייבוש פעילים אחרים בטמפרטורת החדר. אם יש להשתמש ברקמה טרייה, ודא שה-DNA מופק תוך שלוש שעות מהאיסוף כדי למנוע פירוק.

הליך זה משתמש בערכת המיני של צמחי DNEZ מבית Kyogen על פי הוראות היצרן עם שינוי קל אחד. הנה. ההליך הותאם כך שנעשה שימוש ביותר מ-100 מיליגרם של רקמה טרייה או קפואה או יותר מ-20 מיליגרם של רקמה מיובשת. ראשית טוחנים יותר מ-100 מיליגרם של רקמת עלים טרייה או קפואה, או יותר מ-20 מיליגרם של רקמת עלים יבשה לאבקה דקה באמצעות שלושה סיבובים של חנקן נוזלי עם טחינה במכתש ועלי צוננים.

שקלו את האבקה הקפואה מרקמה טרייה או קפואה ל -100 מיליגרם אליקוט. אם משתמשים ברקמת עלים יבשה, שקלו את האבקה ל -20 מיליגרם אליקוט. לאחר שלב זה, המשיכו במיצוי ה-DNA לפי הוראות היצרן באמצעות ספקטרופוטומטר כגון בדיקת ספקטרופוטומטר NanoDrop, DNA, איכות וכמות תפוקות DNA טובות צריכות להיות בין 50 ל-150 ננוגרם למיקרוליטר עם 2 60 על 2 80 ו-2 32 80 יחסים קרובים ל-2.0 כפי שנראה. הנה.

בצע אלקטרופורזה באמצעות ג'ל סטנדרטי של 1% AROS. ודא את נוכחותם של פסים גדולים יחסית הגדולים מ-10 KB עם פסים לא קטנים מזיהום RNA אם ריכוז ה-DNA גבוה, דלל דגימות ל-70 ננוגרם למיקרוליטר לשלבים הבאים. פריימרים ה-PCR המשמשים בפרוטוקול זה המצוינים על ידי החצים האדומים והירוקים מבוססים על הבדלי רצף בין אזור ה-LF המטויח של עשב קוגן לבין גנוטיפים של עשב דם יפני.

הבדלים אלה באים בצורה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים והוספות ומחיקות המסומנות על ידי החצים השחורים האנכיים, המאפשרים פיתוח של פריימרים ספציפיים למגוון על ידי איתור הפריימרים באתרים של רצפים ייחודיים, רצפי הפריימר כלולים בחלק הכתוב של הפרוטוקול עבור כל דגימת DNA מבודדת שהוגדרה שתי תגובות PCR של 50 מיקרוליטר בצינורות PCR דקים של 0.2 מיליליטר על ICE באמצעות כל ערכת פריימר על פי הפרוטוקול הכתוב. אם ריכוז ה-DNA נמוך, ניתן להוסיף עוד DNA לכל תגובה תוך התאמת כמות המים המזוקקים הכפולים ללא נוקלאז כך שנפח התגובה הכולל יישאר 50 מיקרוליטר.

אל תשתמש ביותר מחמישה מיקרוליטרים של DNA או 10% מהנפח הכולל לתגובה מכיוון שזיהומים הכלולים בדגימות ה-DNA עלולים לעכב תגובות PCR כדי להבטיח שכל ריאגנטים של PCR פועלים, הגדר היטב את הבקרה החיובית. באמצעות פריימרים בקרה חיובית הגדר את הבקרה השלילית באמצעות אותו פריימר בקרה כמו הבקרה החיובית, אך עם מים מזוקקים כפולים במקום ה-DNA המופק בשלב זה, יש בסך הכל ארבע תגובות PCR עבור כל דגימה שנבדקת. לאחר מכן, בצע הגברות PCR בתרמו-סייקלר המצויד במכסה מחומם תוך שימוש בפרמטרי הרכיבה של PCR באופטימיזציה של הפרוטוקול הכתוב לטמפרטורת כריעה ראשונית, זמני הארכה ומספר מחזורים עשויים להיות נחוצים בהתאם לאיכות פריימרים ה-DNA הדבקה בפולימראז או סוג התרמו-ציקלר בו נעשה שימוש.

לאחר השלמת תגובות ה-PCR, הפרד את מוצרי ה-PCR על ג'ל של 1% באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית. הפעל את הדגימות בסביבות 120 וולט עד שחזית D מגיעה לשלושה רבעים מהאורך הכולל של הג'ל. דמיין את הג'ל תחת אור UV ובדוק את הרצועות המתקבלות כדי לראות אם הוגבר שבר DNA מתאים.

ג'ל מייצג זה מציג את תוצאות האלקטרופורזה של מוצרי PCR שמקורם בעשב קוגן, עשב דם יפני ועשב דם יפני דגימות DNA בשילוב עם עשב קוגן ופריימרים ספציפיים ל-JBG, כמו גם בקרה חיובית של סיבוב LF ובקרה שלילית ללא תבנית. סט הפריימר לבקרה חיובית של תור LF עובד באותה מידה עבור עשב קוגן, עשב דם יפני, עשב דם יפני ועשבים אחרים, ויביא ללהקה של 890 זוגות בסיסים. אם כל ריאגנטים של PCR נקיים ממזהמי DNA, תגובת הבקרה השלילית לא תביא לתוצר PCR.

אם דגימת ה-DNA נגזרת מעשב קוגן מסוג בר, תגובת PCR באמצעות ערכת הפריימר הספציפית לעשב קוגן תביא לפס יחיד בסביבות 595 זוגות בסיסים, בעוד שהפריימרים הספציפיים ל-JBG לא יביאו לשום פס. באופן דומה, אם דגימת ה-DNA נגזרת מתגובת JBG או תגובת J-B-G-A-P-C-R משוחזרת, שימוש בערכת הפריימר הספציפית של JBG יביא לפס יחיד בסביבות 594 זוגות בסיסים. בעוד שהפריימרים הספציפיים לדשא קוגן לא יביאו לשום רצועה.

מכיוון של-JBG ול-JBG החוזר יש רצף חומצות גרעין זהה, לפיכך יהיו להם דפוסי פסים זהים. עם זאת, ההבדלים המורפולוגיים בין JBG ל-JBG הם די ברורים, כך שבעוד שתוצאות ה-PCR יהיו זהות, קל להבחין בין זני JBG ברמת הצמח. ריצוף DNA של מוצרי ה-PCR יכול לזהות שינויים אפשריים ברצפי ה-DNA עבור אקוטיפ שונה של עשב קוגן.

פיתוח טכניקה זו מספק את השיטה המולקולרית הפשוטה הראשונה שיכולה להבחין במדויק בין סוג K לדשא לבין הצורה ההפוכה של זן הנוי שלו עשב דם יפני. אנו מעודדים את המשתמשים בפרוטוקול זה ליצור איתנו קשר כדי לדווח על התוצאות הנגזרות מהשימוש בפרוטוקול זה. מידע משותף כזה יעזור לספק מידע על תפוצת עשב הדם היפני.

זה גם יעזור לרגולטורים ב-USDA לקבל החלטות מושכלות לגבי פעולות שעשויות להידרש כדי לעקוף את ההתפשטות וההכלאה הפוטנציאלית של זני עשב הקוגן הפולשניים ביותר.