RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס
16 באוקטובר 2011
ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic Pristionchus פקיפיקוס ללימודי הביולוגיה האבולוציונית, התפתחותיים, התנהגותיים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע טרנספורמציה מוצלחת של DNA זר ולבצע השתקה (knock down) של תפקוד גנים בנמטודות מסוג Priyanka Pacificus. עבור טרנסגנזה, התחילו בהכנת ה-DNA הגנומי המתאים עם קצוות דביקים (cohesive ends) תואמים.
עבור השתקת RNA (RNA interference), סנתזו את הגן הרצוי באמצעות ערכה לשעתוק RNA דו-גדילי. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה של ה-DNA או ה-RNA הדו-גדילי לתוך ה-goads של PRIs DIANCA pacificus. סננו את אוכלוסיית ה-F1 לאיתור הפנוטיפ של הסמן הנבחר עבור טרנסגנזה, ובחרו את הפנוטיפ של השתקה (knockdown) עבור השתקת RNA בטרנסגנזה.
המשיכו לעקוב אחר התוצאות של תולעים טרנסגניות מדור F2 כדי לקבל תוצאות המראות ביטויים גנתיים ספציפיים באמצעות רפורטר GFP במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני Ray Hong מאוניברסיטת California State ב-Northridge, והדגמה זו תסקור את השלבים למניפולציה גנטית בנמטודות ספציפיות. באורגניזם מודל מתפתח, ביצוע RNAi וטרנסגנזיס יכולים לספק תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית ובהתנהגות על ידי אפיון תפקודי גנים וביטויים.
בני אדם שאינם מכירים שיטה זו יפיקו תועלת מצפייה באופן הנחת התולעת על משטח ההזרקה וביצוע ההזרקה במישור המוקד הנכון שבו ה-gonads נראים. בניגוד ל-gans, ה-goads ספציפיים ל-SCA, שכן ה-goads חוצים זה את זה בצד הגבי ונדרכים בהדרגה ככל שהנמטודה מתפתחת משלב J four מאוחר לבוגרת. בנוסף, יש להוסיף לטרנסגנים ולסמן ההזרקה המשותף (co injection marker) DNA גנומי שעבר עיכול עם אנזימי הגבלה תואמים כדי להכין את תערובת ההזרקה.
במעבדה של ג'סיקה סינגל יודגם תהליך של מיקרו-הזרקה במקרה של PRIs באופן ספציפי עבור טרנסגנזיס. לצורך ההזרקה נדרשים מבני 3D NA, marker של הזרקה משותפת דומיננטית. הטרנסגן של ה-reporter המטרה ומבני ה-genomic D-N-A-D-N-A מעוכלים באמצעות אנזימי הגבלה תואמים. מבני ה-DNA נאספים באמצעות פרוטוקול של שקיעה באתנול.
תמיסת ההזרקה מוכנה בריכוזים המופיעים בטבלה. ודאו את הגדרות מד הלחץ של מיכל החנקן. כעת טענו 1 עד 2 µL מתמיסת ההזרקה לתוך המחט.
הניחו את המחט במניפולטור למיקרו-הזרקה. שברו את קצה המחט על ידי נגיעה קלה בדופן של צינור קפילרי דק שהונח על תג
בחרו תולעת אחת והעבירו אותה לפד הזרקה. תחת המיקרוסקופ, מקמו את הגונדה של התולעת לכיוון המחט, כך שהוולבה תהיה רחוקה מהמחט. כעת הנמיכו את המחט למיקום הנראה בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
הביאו את הגונד העליון ואת המחט לאותו מישור מיקוד. דקרו בעדינות את התולעת והזרימו פנימה את תערובת ההזרקה. שימו לב להפרדה של הביצים לכיוון הקצה הדיסטלי, המעידה על הזרקה מוצלחת.
מקמו מחדש את המחט כדי להזריק לגונד הנמוך וחזרו על ההזרקה. מכיוון שגונד זה נמצא מתחת למעי, פריסת הביצים לא תהיה גלויה ולכן קשה יותר להעריך את הצלחת ההזרקה. עם זאת, לאחר ההזרקה, התולעת צריכה להישאר שלמה ללא בליטות של הגונד החוצה.
החזירו את המחט למצב המתנה. הוסיפו טיפה של M9 buffer כדי להציל את התולעת באמצעות מעט חיידקי OP 50 על פיק. געו את התולעת ב-OP 50 כך שהיא תידבק אליהם.
כעת העבירו את התולעת לצלחת עם נקודות של 50 µL של OP 50. אחסנו את התולעות המוזרקות בטמפרטורה של 20 °C למשך כארבעה ימים להטלה וגידול של דור F1. כעת בצעו סריקה של התולעות לאיתור הפנוטיפ הנבחר.
בחרו פרטים בודדים מדור F1 בעלי הפנוטיפ שנצפה, העבירו אותם לצלחת זריעה חדשה ואחסנו בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. לבסוף, עבור קווים טרנסגניים, העבירו פרטים בודדים מדור F2 לצלחות נפרדות. אחסנו דורות עוקבים בטמפרטורה של 20 degrees Celsius.
מניפולציה של תפקוד גנים ברמת האורגניזם באמצעות RNAi וטרנסגנזה היא היבט מרכזי במודל ה-Ppac pacificus עבור ביולוגיה התפתחותית-אבולוציונית; בהשוואה לתולעת מסוג wild type משמאל, קו הטרנסגנזה היציב F four PPR L three גורם לפנוטיפ roller דומיננטי המראה ביטוי GFP בנוירוני הראש. לעומת זאת, ניסוי RNA I זה יוצר מוטנטים של PRL one המציגים knockdown מלא של תנועת הגלגול הנצפית בדרך כלל במוטנט gain of function של PRL one roller TU 92. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים כל הזרקה תוך חמש דקות. חשוב לזכור שיש לבודד באופן פרטני את כל ה-F twos מקווי טרנסגנזה F1 בלתי תלויים של roller כדי להקים קווי F two פרומי בלתי תלויים.
זאת מכיוון שמצאנו כי ביטוי GFP הוא משתנה מאוד בין שני קווי F והעברת הפנוטיפ של ה-roller אינה נמצאת במתאם עם רמת ביטוי G.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את הטכניקות להחדרת DNA המועבר באופן יציב ו-RNA דו-גדילי זמני לנמטודה הנקרומנית Pristionchus pacificus. שיטות אלו חיוניות למניפולציה של תפקודי גנים ולחקר תהליכים ביולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- טרנסגנוזה מאפשרת מניפולציה של תפקודי גנים באורגניזמי מודל.
- השתקת RNA (RNAi) משמשת להדבקה (knock down) של תמלילי mRNA ספציפיים.
- Pristionchus pacificus משמש כמודל למחקרי אבולוציה והתנהגות.
- הבנת תפקוד הגנים חיונית להשגת תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- החדרה מוצלחת של DNA זר לתוך Pristionchus pacificus.
- השתקת תפקוד גנים באמצעות טכניקות של RNA interference.
- סיוע למחקרים בביולוגיה אבולוציונית, התפתחותית והתנהגותית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת DNA גנומי עם קצוות דבקים (cohesive ends) תואמים לצורך טרנסגנזה.
- סינתזה של RNA דו-גדילי עבור השתקת RNA (RNA interference).
- מיקרו-הזרקה של DNA או RNA דו-גדילי לגונדות של Pristionchus pacificus.
- סריקה של אוכלוסיית F1 לצורך זיהוי פנוטיפים של סמנים נבחרים.
תוצאות עיקריות
- טרנספורמציה מוצלחת של DNA זר בנמטודות.
- השתקה יעילה של תפקוד גן באמצעות RNAi.
- זיהוי שינויים פנוטיפיים בדור ה-F1.
- הדגמת התועלת של Pristionchus pacificus במחקרים גנטיים.
מסקנות
- הטכניקות המתוארות יעילות למניפולציה גנטית בנמטודות.
- שיטות אלו יכולות לקדם מחקר בתחומים ביולוגיים שונים.
- Pristionchus pacificus הוא אורגניזם מודל בעל ערך לחקר תפקוד גנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מניפולציה גנטית מהימנה באורגניזמי מודל מתפתחים כמו Pristionchus pacificus מרחיב את יכולות תיקוף המטרה מעבר למערכות מסורתיות. שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים שמורים אבולוציונית באמצעות השתקה ישירה של גנים (gene knockdown) וטרנסגנזה יציבה. היא תומכת בפיתוח מודלים פרה-קליניים על ידי אספקת מערכת ניתנת לשליטה גנטית לצורך סריקת פנוטיפים וגילוי סמנים ביולוגיים במערכי בדיקה מבוססי נמטודות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השתקה מתווכת RNAi של מוטציות דומיננטיות כגון prl-1(tu92) להערכת תפקוד גנים בפנוטיפים של התניידות.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקול הזרקה מיקרוסקופית הניתן לשחזור ליצירת קווים טרנסגניים יציבים המבטאים רפורטרים של GFP תחת פרומוטורים ספציפיים לרקמה.
- ערך ניבוי: מסייע בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על השפעות השתקת גנים על פנוטיפים עצביים ושריריים בצאצאי F1.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר אוכלוסיות F1 מסונכרנות המתאימות לסריקת תוכן גבוהה של פנוטיפים של knockdown באמצעות סממנים גלויים, כגון תנועת גלגול.
- פלט כמותי: מאפשר כימות מבוסס פלואורסצנציה של ביטוי טרנסגן (למשל, GFP) בדורות F2 לצורך ניתוח תגובת מינון וחדירות (penetrance).
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית של מיקרו-הזרקה הישימה למספר טרנסגנים וקונסטרוקציות RNAi ב-P. pacificus.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: תומך במחקרי שימור אבולוציוני של מסלולים נוירוגניים ומטבוליים הרלוונטיים למודלים של מחלות אנוש.
- המשכיות תרגומית: מאפשר מעבר מהשתקת גנים ב-F1 להקמת קו יציב ב-F2 לצורך הערכה פנוטיפית אורכית.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחית תוצאות חיוביות שגויות בתיקוף מטרות על ידי אישור הקישור בין פנוטיפ לגנוטיפ באמצעות ניתוח הצלה והפרדה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה נשמרת בתוך זרימות עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה של תפקוד גנים לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead), כאשר התוצאים מסייעים בבחירת המטרה ובביצוע מעקב מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות השתקה הפיכה של גנים (gene knockdown) וביטוי יתר יציב כדי להבהיר קשרים בין גן לפנוטיפ.
- סריקה: מייצרת זנים טרנסגניים המוכנים לבדיקה עם רפורטרים ניתנים לזיהוי, לצורך מחקרי רגישות לתרכובות ומחקרי אינטראקציה גנטית.
- אנליטיקה: מספקת פלטי תוצאות של פלואורסצנציה כמותית ודירוג פנוטיפי כדי להשוות מצבים גנטיים ולהעריך חדירות (penetrance).
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה גנטית לתוצאות פנוטיפיות במערכת בעלת מסלולים התפתחותיים שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת מיקרו-הזרקה ניתנת להעברה לצורך תיקוף חוזר של מטרות במגוון גנים וזנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי אפשור הפרעה גנטית ישירה במודל נמטודה הניתן לשליטה גנטית.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור טרנסגנזה ו-RNAi עם פרמטרי הזרקה מוגדרים ולוחות זמנים לסריקה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי מטרה באמצעות הצלה פנוטיפית (phenotypic rescue) והפרדה.
- השפעה על תיק המטרות: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על תפקוד שמור ויכולת טיפול תרופתי במודלים רחוקים מבחינה אבולוציונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של דיסקציה של נמטודות ומיקרו-הזרקה להגעה ספציפית לגונד.
- תלוי במכשיר למיקרו-הזרקה, בבקרת לחץ חנקן ובהכנת מחטי קפילריה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת DNA/RNA, כולל עיכול על ידי אנזימי הגבלה והשקיעה באתנול.
- כולל תיאום בין צוותים לתחזוקת זנים, סריקה פנוטיפית ומעקב בין-דורי.
- מוגבל בשל נדידה ונטראלית של גונדס דידלפיים, דבר המצריך הזרקה דו-צדדית להבטחת העברה עקבית לקו הנבט.
