Name: RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למד שיטות להכנסת DNA זר ו-RNAi בנמטודות Pristionchus pacificus באמצעות מיקרו-הזרקה. טכניקות אלו מאפשרות לחקור תפקודי גנים בביולוגיה התפתחותית והתנהגותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים מאוד RJ זומר ו-X וואנג לסיוע עם microinjection, כמו גם הערות תובנה מן הבודקים אנונימי. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק SC2GM089602.

<ol><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pristionchus+pacificus%3A+a+well-rounded+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li>
<li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution%3A+development%2C+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and Microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פ אוכלוסיות פקיפיקוס נמצאים בשיתוף הדוק עם מינים שונים חיפושית חיפושית ברחבי העולם הוא נמטודות מודל ביניים בין חיים חופשיים נמטודות טפיליות. כוחה של פ פקיפיקוס כאורגניזם מודל המתעוררים טמון בשילוב של מפות גנטיות הפיזי שלה כי לקדם מיפוי מיקומית של מוטציות גנטיות מבודד מסכי קדימה משוחדת (כלומר, לא רק עבור גנים מועמדים מאופיין בעבר C. elegans) 6,10. עם זאת, C. טכניקות elegans גנטית אינם ניתנים להעברה בקלות ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> המוצר: </th><th> קטלוג #: </th><th> הספק: </th></tr><tr><td> DMI3000 הזרקת מיקרוסקופ </td><td> DMI3000 </td><td> לייקה </td></tr><tr><td> Microinjector מניפולטור (נסיעה ישירה) </td><td> Narashige BC-3 בול משותף </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> מחט פולר </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ All-Digital Multi-לחץ מערכת </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> Tritech מחקר </td></tr><tr><td> GeneElute ™ היונקים הדנ&quot;א הגנומי Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> pJet שיבוט Jet ערכת </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET פלסמיד Miniprep ערכת </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> ה-DNA Clean &amp; מרוכז ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO מחקר </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi Topo ® ערכת שעתוק </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> אגר Difco ™ נובל </td><td> DF0142-15-2 </td><td> פישר Scientifi </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ (1.5-0.16 עד 0.19mm עבה; גודל: 50 x 45 מ&quot;מ) </td><td> 12-554-F </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> זכוכית נימים (נימה) </td><td> 615000 </td><td> AM מערכות </td></tr><tr><td> שמן פרפין (קשה) </td><td> O122-1 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr></tbody></table>

rnai מתווכת מציאה ין transgenesis ידי microinjection ב נמטודות necromenic pristionchus פקיפיקוס</em

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

למרות זאת הוא סביר יותר ויותר עבור אורגניזמים מודל המתעוררים להשיג רצף הגנום לחלוטין, נוסף מעמיק פונקציה גן ומנתח ביטוי על ידי התערבות RNA ו transgenesis יציב להישאר מוגבלת מינים רבים בשל האנטומיה בפרט ביולוגיה תאית מולקולרית של האורגניזם. כך, למשל, מחוץ Caenorhabditis קבוצת כתר הכולל Caenorhabditis elegans 3, המשודר ביציבות קווי מהונדס שאינם Caenorhabditis מינים לא דווחו מערכה זו מטעה (Nematoda), למעט Strongyloides stercoralis 4 ו Pristionchus פקיפיקוס 5. כדי להקל את תפקידו המתרחב של פ פקיפיקוס במחקר של התפתחות, אבולוציה, התנהגות 6-7, נתאר כאן את השיטות הקיימות להשתמש microinjection להכנת חיות טרנסגניות ואת הגן להפיל על ידי RNAi. כמו בלוטות המין של <em&gt; ג elegans ורוב נמטודות אחרים, בלוטות המין של פ פקיפיקוס הוא syncitial ומסוגלים שילוב DNA ו-RNA לתוך ביציות כאשר נמסר על ידי microinjection ישיר. שלא כמו ג elegans עם זאת, transgene ירושה יציבה ביטוי סומטי פ פקיפיקוס דורש תוספת של הדנ&quot;א הגנומי עצמי מעוכל עם endonucleases משלים את הקצוות של transgenes היעד סמנים coinjection 5. תוספת של הדנ&quot;א הגנומי הספק דומה הדרישה לביטוי transgene ב Strongyloides stercoralis 4 והן בתאי הנבט של C. elegans. עם זאת, לא ברור אם דרישה ספציפית של הדנ&quot;א הגנומי שלו של החיות הוא כי פ פקיפיקוס סומה הוא יעיל מאוד השתקת שאינם מורכבים רב להעתיק את הגנים או מערכים extrachromosomal ב P. פקיפיקוס דורשים רצף גנומי להרכבה kinetochore נאות במהלך מיטוזה. ההגירה הגחון של שני חמושים (didelphic) בלוטות המין של הרמפרודיטים מסבכת עוד יותר את היכולת להזריק הן בלוטות המין של תולעים הפרט 8. אנחנו גם מדגימים את השימוש microinjection כדי מציאה מוטציה דומיננטית (הרים, tu92) על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך בלוטות המין כדי להשיג ללא גלגול 1 הצאצאים F. שלא כמו ג elegans, אבל כמו נמטודות האחרים, פ &#39; פקיפיקוס PS312 אינו פתוח RNAi מערכתי באמצעות האכלה השריית ולכן dsRNA חייב להיות מנוהל על ידי microinjection לתוך בלוטות המין syncitial. במחקר הנוכחי, אנו מקווים לתאר את התהליך microinjection צורך להפוך האמרגן PPA-EGL-4:: כתב ה-GFP היתוך מציאה הרים דומיננטי PRL-1 (tu92) מוטציה בפרוטוקול מידע חזותי.

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic<em&gt; Pristionchus פקיפיקוס</em&gt; ללימודי הביולוגיה האבולוציונית, התפתחותיים, התנהגותיים.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

אף על פי שעלות השגת רצפים גנומיים מלאים עבור אורגניזמי מודל מתהווים הופכת לנגישה יותר ויותר, נדרשים מחקרים מעמיקים יותר על תפקוד וביטוי גנים...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע טרנספורמציה מוצלחת של DNA זר ולבצע השתקה (knock down) של תפקוד גנים בנמטודות מסוג Priyanka Pacificus. עבור טרנסגנזה, התחילו בהכנת ה-DNA הגנומי המתאים עם קצוות דביקים (cohesive ends) תואמים.עבור השתקת RNA (RNA interference), סנתזו את הגן הרצוי באמצעות ערכה לשעתוק RNA דו-גדילי. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה של ה-DNA או ה-RNA הדו-גדילי לתוך ה-goads של PRIs DIANCA pacificus. סננו את אוכלוסיית ה-F1 לאיתור הפנוטיפ של הסמן הנבחר עבור טרנסגנזה, ובחרו את הפנוטיפ של השתקה (knockdown) עבור השתקת RNA בטרנסגנזה.המשיכו לעקוב אחר התוצאות של תולעים טרנסגניות מדור F2 כדי לקבל תוצאות המראות ביטויים גנתיים ספציפיים באמצעות רפורטר GFP במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני Ray Hong מאוניברסיטת California State ב-Northridge, והדגמה זו תסקור את השלבים למניפולציה גנטית בנמטודות ספציפיות. באורגניזם מודל מתפתח, ביצוע RNAi וטרנסגנזיס יכולים לספק תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית ובהתנהגות על ידי אפיון תפקודי גנים וביטויים.בני אדם שאינם מכירים שיטה זו יפיקו תועלת מצפייה באופן הנחת התולעת על משטח ההזרקה וביצוע ההזרקה במישור המוקד הנכון שבו ה-gonads נראים. בניגוד ל-gans, ה-goads ספציפיים ל-SCA, שכן ה-goads חוצים זה את זה בצד הגבי ונדרכים בהדרגה ככל שהנמטודה מתפתחת משלב J four מ

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

למד שיטות להכנסת DNA זר ו-RNAi בנמטודות Pristionchus pacificus באמצעות מיקרו-הזרקה. טכניקות אלו מאפשרות לחקור תפקודי גנים בביולוגיה התפתחותית והתנהגותית.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס

גלה סרטונים נוספים