Name: פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד בידוד וניתוח תאי שריר לב עכברים בוגרים ברמת תא יחיד באמצעות PCR כמותי ומערכי DNA. שיטה זו מאפשרת חקירת הבדלי ביטוי גנים בין תאים בודדים בלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להכיר סיוע טכני של ג Zambataro במהלך הסרטה של ​​פרוטוקול זה. אנו בתודה להכיר את התמיכה של קרן גלן למחקר רפואי (SM), הקרן Hillblom, ואת מכוני הבריאות הלאומיים של מרכז פרס הלם נתן (P30AG025708) ו PO1AG025901. JMF נתמכה על ידי T32AG000266 הוענק למכון באק לחקר הזדקנות.

<ol><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li>
<li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
<li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li>
<li>Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).</li>
<li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Radiopaedia%22%5BJournal%5D)">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li>
<li>Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling%3A+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li>
<li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li>
<li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+nurture%2C+or+chance%3A+stochastic+gene+expression+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li>
<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; גישה חופשית וייצור של זה של מאמר זה היא בחסות חברת Sigma-Aldrich.</p

שיטה זו יש את האפשרות ליצור cardiomyocytes במשך מספר פונקציונלי, כמו גם ביטוי במחקרים הגן. בדיקה של תאים בודדים הוא אזור המתפתחת בניתוח ביטוי גנים. היתרון של בחינת רמות תעתיק ברמה של תא יחיד הוא שהיא מאפשרת בדיקה של האוכלוסייה תא טהור, דבר שאינו אפשרי מן ההכנות הרקמה כולה. בנוסף, ניתוח תא בודד מאפשרת בחינה של הסטיות האקראיות של רמות ה-mRNA בתאים בודדים להגדיר אוכלוסיות תאים אשר נחשבו בעבר להיות 8,9 הומוגנית. בנוסף לזיהוי גנים אשר סטוכסטיים פוטנציאל בביטוי הגנים שלהם 10,11,12, השיטה מאפשרת גם זיהוי של אוכלוסיות תאים נדירות שהוגדר על ידי ביטוי הגנים שלהם בפרופילים. אמנם שיטה זו מספקת מספר שימושים פוטנציאליים מרגש בניתוח ביטוי גנים, יש סוםדואר אזהרות ושיקולים השימוש של תאים בודדים. המגבלה העיקרית לניתוח תא יחיד, הוא אוסף של תאים מספיק בניסוי כדי להשיג מובהקות סטטיסטית לגבי מדד של עניין, על השונות למשל. במקרים בהם את המספרים של תאים מבודדים מן הרקמה של עניין היא לא מגבלה, ניתן לבחון מאות תאים לכל קבוצה, תוך שימוש בגישות כגון רצף של הדור הבא, או מערכים nanofluidic. עם זאת, במקרים מסוימים, ייתכן שיש קושי בהשגת מספיק תאים מרקמות של עניין. זה יכול להיגרם בין השאר על ידי נהלים זמן ייחודי אינטנסיבית לאיסוף לסוג תא המטרה. עם זאת, תכנון קפדני הכנה לפני שתמשיך עם אוסף תא בודד עדיין עשויה לאפשר ניתוח קפדני תא בודד עם שגיאה טכנית מוגבלת. כאשר בוחנים את תוצאות אותו יש לקחת בחשבון, כי אף על הליך זה עבור תאים בידוד נעשה שימוש studie רביםs (כולל מיקרוסקופיה, electrophysiology וכו &#39;), את הבידוד עצמו עלול השפעה ביטוי גנים. כמו כל שיטה אשר מתפעל דגימות ביולוגיות, התוצאות של הממצאים שלך צריך להיות תוקף בקפידה כדי להבטיח את הביטוי תא בודד הוא נציג של הרקמה עצמה הטיה לא טכנית. שיטות כמו הכלאה באתרו עשוי להיות שימושי כדי לאמת את התוצאות הללו ברקמות ללא פגע. לבסוף, חשוב להבטיח כי הנתונים המופקים נבדקים בקפידה על בקרת איכות. הנתונים שמוצג באיור 8 ממחישה כי מבחני qPCR עשוי להיות חזקים מאוד ספציפיות, כגון assay # 13 (A13) או רמה גבוהה של השתנות אשר יכול להוביל השונות טכניים כגון assay # 34 (A34).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 monobasic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> דקסטרוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> פרוטאז, סוג XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, סוג I </td><td> וורטינגטון </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> השעיה 1x מאגר ה-DNA (10 mM טריס, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital נתרן </td><td> הנרי שיין וטרינר. אספקת * </td><td> צור קשר עם הספק עבור ההזמנה </td><td> * חייב להיות שנרכשו דרך וטרינר או מעבדה בבעלי חיים מקצועיים </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x מערבבים Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> עילי III RT פלטינום תקי Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA פריימר Mix </td><td> IDT </td><td> מנהג </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease מים חינם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop ספקטרופוטומטר </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer 7500 ערכת ה-DNA </td><td> Agilent </td><td> 7500 ערכת </td><td></td></tr><tr><td> אחת סימון צבע ערכת </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus שריר 12x135k מערך </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A סורק </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex הגברה השלם Whole Transcriptome Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

אמנם מחקרים רבים בחנו את ביטוי הגן משתנה מן homogenates של רקמת לב, זה מונע לומד את הסטיות האקראיות הטמון בין תאים בתוך רקמה. בידוד של אוכלוסיות cardiomyocyte טהור דרך זלוף collagenase של לבבות עכבר מקלה על הדור של microarrays תא בודד עבור כל ביטוי גנים transcriptome, או qPCR של מטרות ספציפיות באמצעות מערכים nanofluidic. אנו מתארים כאן הליך לבחון את אחד הגנים התא ביטוי פרופילים של cardiomyocytes מבודד בלב. פרדיגמה זו מאפשרת הערכה של מדדים של עניין אשר אינם תלויים מתכוון (עבור השונות למשל בין תאים בתוך הרקמה), אשר אינה אפשרית בעת שימוש רגיל workflows רקמות שלמות לצורך הערכה של ביטוי גנים (איור 1). השגנו הגברה חזקה של transcriptome מיקרוגרם אחד של תא מניב cDNA גדילי כפול המאפשרת את השימוש microarrays על individual תאים. בהליך אנו מתארים את השימוש במערכים NimbleGen אשר נבחרו על מנת להקל את השימוש ואת היכולת להתאים אישית את העיצוב שלהם. לחלופין, transcriptase הפוכה - הגברה היעד תגובה ספציפית (RT-STA), מאפשר qPCR של מאות יעדים על ידי nanofluidic PCR. השימוש באחת הגישות הללו, אפשר לבחון את השתנות ביטוי בין תאים, כמו גם בחינת פרופילי הביטוי של סוגי תאים נדירים מתוך נייר. בסך הכל, תא בודד הגן גישה מאפשרת ביטוי עבור הדור של נתונים שעלולים לזהות פרופילים ביטוי ייחודית כי הם בממוצע בדרך כלל כאשר בוחנים את הביטוי של מיליוני תאים homogenates אופייני שנוצר מרקמות כולו.

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

בעוד שמחקרים רבים בחנו שינויים בביטוי גנים מדגימוגנים של רקמת לב, גישה זו מונעת את חקר השונות הסטוכסטית הטבעית...

מטרות מצגת זו הן ראשית להדגים את בידודם של קרדיומיוציטים חיים מעכבר בוגר, ולאחר מכן להדגים שתי שיטות לניתוח ביטוי גנים בתא בודד. לאחר הוצאת הלב מעכבר, הלב עובר פרפוזיה עם תמיסת עיכול של קולגנאז כדי לקבל תאים בודדים. לצורך ביצוע quantitative PCR של תאים בודדים, התאים המזוקקים מוערכים ישירות באמצעות בדיקות QPCR.ניתן להשתמש בתאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) המבודדים גם לצורך אנליזת מיקרו-מערך (microarray). אנליזת מיקרו-מערך של תאים בודדים כוללת מיצוי mRNA, הגברה של כל התמלום (whole transcriptome amplification) באמצעות ספריית plex, לאחר מכן הגברה מוגבלת, ולבסוף, סימון והכשרה (hybridization) לשבב מיקרו-מערך. השלב הסופי של שני ההליכים הוא הבטחת נתונים באיכות גבוהה.פרוצדורות אלו מדגימות כי ניתן לבצע ניתוח ביטוי גנים חסון מתאי קרדיומיוציטים בוגרים שבודדו באופן אינדיבידואלי. היתרון של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון פרופילי ביטוי גנים של הומוגנאט רקמה שלמה, הוא שביטוי גנים בתא בודד מאפשר לקבל מידע על הביטוי בתוך תא בודד, כמו גם על השונות בביטוי בין תאים. התחל עם מערכת בידוד מוכנה, הכוללת את התמיסות והבופרים הדרושים; הרדם באופן סופי עכבר באמצעות הזרקה IP של 0.25 milliliters של תמיסת sodium pentobarbital, וודא כי העכבר אינו בהכרה ואינו מגיב לגירויי כאב.אין להשתמש בפחמן דו-חמצני או בניתוק צווארי להדמיות העכבר לפני שהנשימה תיעצר. בצע חתך זהיר. פתח את חלל בית החזה לאורך השוליים התוראקליים דרך הסרעפת.לאחר מכן גזרו כלפי מעלה בכיוון עליון והסיטו את כלוב הצלעות הקדמי. שאבו בעדינות את הלב לתוך פיפטה פלסטית חתומה מראש והוציאו את הלב מבית החזה. העבירו את הלב לתוך תמיסת עיכול קרה מאוד בקרח.שטפו ב-Buffer A כדי להסיר את הדם לאחר 15 עד 45 שניות, בצעו שטיפה קצרה שנייה ב-Buffer A, ולאחר מכן העבירו את הלב לצלוחית פטרי עם Buffer A והניחו אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בדקו בזהירות את האורטה וענפיה. קצצו את האורטה עד לאזור שמתחת לענף האחרון.הכנס את קצה הקנולה אל תוך האביון (aorta) מעל העורקים הכליליים וקשור אותה במקומה באמצעות תפר 4-0 או 6-0. התחל את הפרפוזיה באמצעות תמיסת עיכול A. זרימת המוצא תהפוך מאדום לשקוף ככל שהדם נשטף מהלב. פרק הזמן החולף בין הקטילת בעל החיים לחיבור הלב למערכת הפרפוזיה הוא קריטי.באופן אידיאלי, יש לשמור על זמן של פחות מחמש עד עשר דקות. כמו כן, יש לשמור על טמפרטורת הנוזל הזורם במערכת הפרפוזיה ב-37 °C. אם הנוזל יהיה חם מדי או קר מדי, הדבר יהרוס את הרקמה.לאחר שטיפת הדם מהלב, עברו לשימוש בבופר עיכול b. בצעו פרפוזיה ללב למשך שתי עד שלוש דקות, עד שהלב מתחיל לאבד את צורתו ונראה מעוגל יותר. השריר הלבבי (myocardium) אמור להיראות בהיר יותר ככל שהפרפוזיה מתקדמת; כעת חתכו את החדרים וקטעו אותם לחתיכות קטנות יותר.העבירו את רקמת הפרונטריקל למבחנה קונית של 50 milliliter המכילה 15 milliliter של בופר איסוף חם. ערבבו בעדינות את הרקמה בתוך הבופר באמצעות פיפט פלסטיק כדי ליצור תערובת של תאי קרדיומיוציטים בודדים. לאחר דקה אחת, העבירו את התערובת למבחנה חדשה והמתינו לשקיעה עד להיווצרות משקע.שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ואת ה-resus. השעו את התאים המשקעים בחמישה מיליליטר של בופר שטיפה לנטרול. התאים מוכנים כעת לבחירה לצורך אנליזה של תא בודד.דללו את התאים בתוך צלחת פטרי קטנה כך שניתן יהיה לבחור אותם באופן פרטני. תחת מיקרוסקופ, בחרו תאים בודדים ובריאים באמצעות פ pipette דקה (pulled pipette) המחוברת למנעול אוויר (airlock). בעת בחירת התאים, הקפידו להימנע מזיהום ולמזער את נפח הלכידה לפחות מ-2 µL.הניחו את התאים הבודדים בתחתית של מבחנות PCR נפרדות והקפיאו אותם מיד על קרח יבש. לאחר מכן, אחסנו את התאים בטמפרטורה של 80- °C. כדי להתחיל, השביו את כל זוגות הפריימרים עבור הגנים הרלוונטיים בריכוז של 100 µM וב-1X DNA suspension buffer, ערבבו ודללו את זוגות הפריימרים לריכוז של 20 µM. לבסוף, דללו את כל זוגות הפריימרים לתמיסה אחת בריכוז סופי של 200 nM.לאחר הכנת תמיסות הפריימרים, הרכיבו את תערובת המאסטר (master mix), הוציאו מיד את התאים הקפואים מהמקפיא וסובבו אותם בצנטריפוגה בעוצמה מרבית למשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו תשעה µL של תערובת המאסטר לכל מבחנה והמשיכו ב-PCR. הוציאו את המבחנות ממכשיר ה-PCR והוסיפו ארבעה µL של exos it לכל תגובה.לאחר מכן,בצעו כל תגובה למשך 15 דקות ב-37 °C, ולאחריהן 15 דקות ב-80 °C. סיימו על ידי החזקתן ב-4 °C. לאחר מכן, דללו את הדגימות ביחס של 1:5 עם תמיסת בופר לסספנסיות DNA.הדגימות מוכנות כעת לניתוח qPCR כמותי. נשתמש כעת בחומר זה ובמערכת ה-fluid IMS BIOMARK באמצעות מערכי ביטוי גנים של 48 נקודות או 96 נקודות. ניתן להשתמש בפורמטים מסורתיים יותר של QPCR, כגון 96 בארות ו-384 בארות.עם זאת, פורמט הבארים מגביל את מספר הבדיקות שניתן לבצע מתא בודד. תהליך זה משתמש בערכה WTA two של Sigma, המסוגלת להגביר cDNA דו-גדילי הן מכדוריות של תאים והן מתאים בודדים. הערכה מפרקת תחילה את ממברנת התאים הבודדים ולאחר מכן מגבירה את המסרים בשני סבבים.לאחר ביצוע שלב הכנת הספריה, הוסיפו חמישית מדגימת הספריה ל-70 µL של WTA two amplification master mix והגבירו את הדגימות למשך 25 מחזורים בהתאם לפרמטרים של הערכה. לאחר מכן, טהרו את הדגימות באמצעות ערכת kayak quick PCR purification ועבדו אותן ב-Cain's kayak cube. בסיום, רכזו את הדגימות המטוהרות ל-5 µL באמצעות ואקום מהיר (speed vacuum) והשתמשו בערכת WTA two כדי להעביר את הדגימות דרך 17 מחזורי הגברה נוספים, תוך שימוש באותם פרמטרים של ההגברה הקודמת.טהרו את הדגימות כפי שבוצע בעבר ובדקו את איכותן באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop וערכת bioanalyzer DNA 7, 500 של Agilent. כעת, סמנו שני מיקרוגרם של cDNA דו-גדילי מכל דגימה של תא שעבר הגברה באמצעות ערכת סמימה בצבע אחד של NimbleGen;בצעו היברידיזציה של חמישה מיקרוגרם מדגימה המסומנת ב-CY3 למערך ביטוי גנים של NimbleGen. לאחר שטיפת ההיברידיזציה, ייבשו את הפיתח כדי שניתן יהיה לדמיין אותו. השתמשו בסורק GenePicks 4, 200 של Molecular Devices עם הגדרות המכויילות ל-100 POW ו-300 עד 350 PMT.נתחו את שבבי הגנים, ולאחר מכן צרו קובצי זיווג עבור כל מערך באמצעות תוכנת nimble scan של nimble gen, והמשיכו בניתוח הנתונים. פרפוזיה מוצלחת של הלב הניבה אחוז גבוה של תאי לב בריאים ששמרו על המורפולוגיה המלבנית האופיינית להם. אילו הפרפוזיה לא הייתה עובדת היטב, תאים רבים היו מתים.התאים הועשרו באמצעות שיטת WTA 2 ואיכות התוצרים הסופיים נבדקה. הדגימה הראתה הגברה חזקה הן בקריאת הספקטרומטר של ה-nano drop והן בקריאת האלקטרופורוגרמה משבב ה-bioanalyzer. לסיכום, גנים רבים התבטאו בצורה חזקה בתאי השריר של הלב (cardiomyocytes).עם זאת, לא כל הבדיקות אמינות במידה שווה, כפי שניתן לראות במפת חום זו של טמפרטורות ההמסה בשיא (peak melt temperatures) מתוך תת-קבוצה של נתוני nano fluid at QPCR. כל שורה במפה זו מייצגת דגימת תא בודד ב-43 בדיקות QPCR נפרדות. חלק מהבדיקות הן בעלות שונות גבוהה וככל הנראה פחות אמינות מאלו שהראו ספציפיות גבוהה יותר ב-PCR.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש להשיג תאים באיכות גבוהה בשלב הראשוני. דבר זה יבטיח את איכות פרופיל ביטוי הגנים בשלבים הבאים. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן להשלים את פרוצדורת בידוד התאים הבודדים בפחות משעתיים וחצי, ואת פרופיל ביטוי הגנים של תאים אלו ניתן להשלים בפחות מיומיים.

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

למד בידוד וניתוח תאי שריר לב עכברים בוגרים ברמת תא יחיד באמצעות PCR כמותי ומערכי DNA. שיטה זו מאפשרת חקירת הבדלי ביטוי גנים בין תאים בודדים בלב.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

גלה סרטונים נוספים