ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד פעילות פרוטאוזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP Deron. ראשית, יש לשבט את האוליגונוקלאוטידים המותאמים עבור Deron ו-Deron frameshift. הכניסו את הווקטור P-E-G-F-P-C והמשיכו בפרוטוקולים עבור מערכת ה-gateway ב-Vitrogen, ולאחר מכן ייצרו וירוסים עבור כל מבנה באמצעות תאי HEK 2 93 FT. לאחר קביעת הטיטר, התעיפו את התאים באמצעות הווירוס והחילו סלקציה אנטיביוטית, ולאחר מכן הרחיבו את תאי ה-GFP DRON או GFP Dron frameshift היציבים המבטאים את החלבון שהתקבלו.

טכניקה זו מקלה על ביצוע ניסויים העוקבים אחר תגובות תאים לטיפולים נתונים באמצעות מדידות של אות פלואורסצנציה. לדוגמה, ניתן להעריך בקלות את פעילות הפרוטאוזום באמצעות פלואורסצנציית epi או ציטומטריה של זרימה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות לומינוגניות או פלואורוגניות המשתמשות בחומצות גרעיניות של תאים שלמים, הוא שפעילות הפרוטאוזום נמדדת בתאים חיים. עבור הטרנספקציה, לדללו 36 µL של ריאגנט lipo 2000 ב-1.5 mL של DMEM; בנפנקת פלקון (falcon tube) של 15 mL נוספת, לדללו את מבני ה-DNA ב-1.5 mL של DMEM.

לאחר חמש דקות, ערבבו את השניים והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כעת החליפו את המצע מתרבית סמיכה (confluent) של תאי HEK 2 93 FT בבקבוק T 75 בשבעה מיליליטרים של DMEM. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-DNA lipo לבקבוק וערבבו על ידי נעירה קדימה ואחורה.

דגרו את הבקבוק למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% CO2. למחרת, החליפו את המצע ב-10 milliliters DMEM. לאחר 48 שעות, אספו את העלייה. סננו את העלייה המכילה את הווירוס דרך מסנן PVDF בעזרת נקבים בגודל 0.45 micrometer.

כדי לרכז את הווירוס, הוסיפו נפח אחד של תמיסת PEG לארבעה נפחים של על-משקע (supernatant) והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב תקופתי על ידי היפוך. אספו את הווירוס באמצעות צנטריפוגה; לאחר שאיבת ה-SNA של המשקע הלבן, צנטריפגו שוב כדי להסיר כל שארית של תמיסת PEG. השעו מחדש את המשקע הסופי ב-PBS באמצעות פיפטה, ולאחר מכן ערבבו במיקסר (vortex) בעוצמה למשך 20 עד 30 שניות.

שמרו מנות של 100 µL מהנגיף בטמפרטורה של 80°C-. זרעו תאי U2 OS בלוחות של שישה בארות והדגירו למשך לילה. לצורך טרנספקציה, החליפו את מצע התרבית ב-1 mL של DMEM המכיל 8 µg/mL של Polybrain. השאירו באור אחת כביקורת חיובית ובחנו סדרה של ריכוזי נגיף בשאר הבארות.

דגרו למשך לילה ביום למחרת. החליפו את המצע בשני מיליליטר של DMEM ודגרו למשך 24 שעות. התחילו את הברירה עם 10 micrograms per milliliter של blasticidin, והמשיכו להחליף את המצע המכיל את האנטיביוטיקה בכל יום שני.

כעבור שש עד שבעה ימים בערך, יש לוודא את מות התאים שאינם טרנסדוקים. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS לצורך צביעתם. כסו את התאים ב-crystal violet והדגירו למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, שאבו את הצבע, שטפו את הבארים פעמיים במים מזוקקים כפולים והניחו לפיתה להתייבש באוויר.

לבסוף, ספרו את המושבות כדי לחשב את יחידות הטרנספקציה של הווירוס למיליליטר. זרעו פיברובלסטים דיפלואידיים אנושיים על פלטות בעלות שישה בארות עם שמונה מיקרוגרם למיליליטר Polybrene כמגביר טרנסדוקציה.

השתמשו בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של שניים בנפח כולל של 1 mL. החליפו את המצע. ביום למחרת, כאשר התרבית מגיעה ל-70% עד 80% התמזגות (confluence).

התחילו את הברירה הכרונית בריכוז של 10 micrograms per milliliter. לאורך הימים, עקבו אחר מוות התאים המלא המעיד על השלמת הברירה. הרחיבו את התאים שעברו טרנסדוקציה יציבה כדי להפיק שורת תאים יציבה המבטאת חלבוני היתוך של GFP DERON או GFP Deron Frameshift. התחילו בזריעת תאים הנושאים GFP DRON או GFP DRON frameshift, ביום למחרת, שלוש שעות לפני הפעולה.

טפל בתאי ביקורת באמצעות מעכב פרוטאוזום. שטוף פעמיים ב-PBS וגייס את התאים באמצעות 0.5 milliliters של trypsin. כדי להפסיק את פעולת ה-trypsin.

השתמשו ב-4.5 milliliters של מצע גידול והעבירו את התאים ל-15 milliliter Falcon. קצרו את התאים באמצעות סנטריפוגציה. לאחר שטיפה אחת עם PBS, השביעו את המשקע ב-400 microliter של fax buffer. העבירו את התאים למבחנות fax והניחו על קרח.

כעת מדדו את הדגימות באמצעות ציטומטריה זרימה. חלבון היתוך GFP Deron נושא רצף המכוון לפרוטאוזום לצורך פירוק מיידי. לעומת זאת, המוטציה של הזזה במסגרת הקריאה GFP Deron FS אינה מפורקת על ידי פרוטאוזומים.

לפיכך, כאשר הועברו תאי פיברובלסטים אנושיים צעירים עם GFP Deron, המצפים לפעילות פרוטאוזומלית גבוהה, הם הראו אות פלואורסצנציה נמוך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיפלאורסצנטית. אותם תאים שהועברו עם GFP Deron Frameshift הראו 39.7% של תאים חיוביים. טיפול בתאים עם מעכבי פרוטאוזום ll ו-L הביא לעלייה באותים למקסימום של כ-63% הן בתאי GFP dron והן בתאי GFP Dron frameshift.

מדידות דומות בפיברובלסטים עוריים, שבודדו מתורמים צעירים, בגיל średni ובגיל מבוגר, מגשרות על עלייה ברורה באות GFP בין אנשים צעירים לתורמים בגיל ביניים, מה שמעיד על ירידה בפעילות הפרוטאוזום בדגימות שהושגו מתורמים מבוגרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ייצור חלקיקים לנטיוויראליים, ביצוע טרנספקציה לתאים וקביעת פעילות הפרוטאוזום בתאים חיים.