הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי
October 25th, 2011
כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת במדויק את ביטוי הסמנים הביולוגיים על פני קטעי רקמה שלמים של סרטן אנושי על מנת להקצות ערך מספרי למידת ההטרוגניות בביטוי החלבון. זה מושג על ידי סריקה ראשונה של קטעים פלואורסצנטיים חיסוניים של רקמת סרטן באמצעות סורק פלואורסצנטי שקופיות שלם. אזורי העניין הבאים בתוך הגידול נבחרים להערכה.
לאחר מכן מכומת הביטוי של החלבון המעניין באזורי הגידול הפולשניים באמצעות מערכת ניתוח התמונה האוטומטית לניתוח מים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי למפות ביטוי סמנים ביולוגיים ברקמה סרטנית, שלעתים קרובות היא הטרוגנית מאוד על פני קטע הרקמה. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקות אלו על פני שיטות מסורתיות כגון אימונוהיסטוכימיה באמצעות ריאגנטים להדמיה צבעונית ומטרית הוא שהאימונופלואורסצנציה כמותית ורגישה יותר.
בשילוב שיטות אנליטיות אלה עם חתך שלם, סריקה אימונופלואורסצנטית מאפשרת מיפוי עדין של וריאציות עדינות בביטוי סמנים ביולוגיים על פני רקמות. בפעם הראשונה, מדגים את הנהלים הללו מארק גוסטפסון, מנהל תפעול ישיר במעבדת Histo RX. לאחר מיקרוטום, חתך של ביופסיה של רקמת סרטן וצביעה אימונו-פלואורסצנטית של הדגימה לביטוי הסמנים הביולוגיים המעניינים, טען עד חמש שקופיות של החלקים המוכתמים לתוך קלטת השקופיות של סורק השקופיות.
לאחר מכן שימוש בממשק במסוף טווח הסריקה. עבור כל שקופית, בחר אזור שיקיף את כל הרקמה בשקופית, ללא קשר לדפוס הצביעה או להיבטים אחרים הנראים לעין של הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קונסולת היקף הסריקה, ראשית, בחר אזור ברקמה להערכה אידיאלית בתוך אזור הגידול של הרקמה כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.
כעת באמצעות תכונת החשיפה האוטומטית של קונסולת היקף הסריקה, קבע את זמן החשיפה עבור כל ערוץ יחד עם מיקוד התמונה, השתמש ביהלום הכחול בתמונת קונסולת היקף הסריקה כדי לבחור אזור נוסף הרחק מהרקמה, אך עדיין בתוך אזור השקופית מתחת להחלקת הכיסוי כדי להגדיר את אזור הרקע שבו יירכשו תמונות תיקון השדה השטוח. עבור כל מסנן, הוסף נקודות מיקוד לאזור הרקמה המיוצג על ידי ריבועים צהובים כדי לייעל את לכידת התמונה. אם נראה שלתמונות יש רקע גבוה או חפצי תמונה אחרים, יש להזיז את אזור התמונה ולרכוש תמונות חדשות.
לאחר מכן הרקמה נסרקת ותמונות השקופיות הדיגיטליות שנרכשו מועלות אוטומטית למסד הנתונים של ספקטרום Aperio. לחץ פעמיים על התמונה הממוזערת של תוכנית הספקטרום כדי לבחור את השקופית לניתוח מרשימת השקופיות הדיגיטליות במסד הנתונים של הספקטרום. לאחר מכן באמצעות התמונה המבוארת h ו-D הנלווית, הוסף הערות לאזור העניין בתמונה הפלואורסצנטית.
ניתן לבחור אזורי עניין מרובים המתוחמים במעגלים בודדים על דגימה אחת. התמונות המבוארות נשמרות אוטומטית במסד הנתונים של הספקטרום. כעת בחר נתח משורת התפריטים בחלק העליון של המסך כאשר חלון הניתוח מופיע, בחר histo RX aqua analysis מהתפריט הנפתח.
כשהוא מוכן להתחיל, לחץ על כפתור הניתוח, חלון מסוף ממוזער יופיע בשורת המשימות של Windows המציג את התקדמות העברת התמונות ממסד הנתונים של הספקטרום למחשב המקומי. לאחר העברת הנתונים, ניתוח אקווה יופעל כדי ליצור ציון אקווה באמצעות אלגוריתם ניקוד אקווה לא מפוקח המבוסס על אשכול הנתונים של סף ראשון של דגימה, אות תמונת הפאן ציטוקרטין מעל אות תמונת הרקע. זה יאפשר שימוש בפיקסלים כדי להגדיר מסכת גידול שניתן להשתמש בה לאחר מכן לחישובים הבאים.
השתמש בפיקסלים בעלי ביטוי גבוה של ציטוקרטין כדי להגדיר גם את האזורים הציטופלזמיים או הלא גרעיניים של תאי הגידול. כפי שניתן לראות כאן, הפיקסלים עם אות גבוה בערוץ ה-DPI שנמצאים בתוך מסכת הגידול מזוהים כגרעיניים באופיים. אם לאחר הסקירה מזוהים שדות שלא התאימו לניקוד עקב חפצי דגימה או הדמיה, שדות אלה נמחקים מהניקוד וגם יפיקו תוצאה סופית של כישלון.
תוצאות ניקוד האקווה מיוצגות כטבלת ציונים המשויכת לכל אריח בגודל 512 על 512 פיקסלים באזור העניין בתוך דגימת חתך רקמה שלמה, שניתן לשמור ולהשתמש בה לניתוח סטטיסטי לאחר מכן. מיקרוגרפי צילום אלה המוכתמים ב-hemat toin ו-eoin מדגימים כיצד אזורים שונים של אותו סרטן שחלות יכולים להפגין מורפולוגיה משתנה. תצוגת העוצמה הגבוהה בפינה הימנית העליונה של איור B מדגישה תאים עם ניקוי ציטופלזמי ודפוס גידול מוצק בחלקו העליון של הגידול.
בחלק התחתון של הרקמה המוגדל בחלק הימני התחתון של איור C, לעומת זאת, יש ציטופלזמה אאוזינופילית הומוגנית יותר ודפוס גדילה פפילרי. כאן, מפות חום הטרוגניות של ביטוי ER בקטע רקמה של סרטן השחלות לפני ואחרי טיפול כימותרפי מוצגות בפאנלים העליונים והתחתונים בהתאמה. שימו לב לשינוי מביטוי ER משתנה על פני הקטע עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון להתפלגות אחידה של ביטוי ER גבוה המוצג באדום באיור התחתון.
הייצוג המספרי של שינוי זה מסומן משמאל על ידי הירידה במדד משפחת סימפסון. באיור זה, הטרוגניות, מפות חום של HER 2 בקטע רקמה של סרטן השחלות מוצגות שוב לפני ואחרי הטיפול כפי שניתן לראות בפאנלים העליונים והתחתונים בהתאמה. שימו לב שוב, השינוי ממשתנה HER שני ביטויים על פני הקטע עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון להתפלגות אחידה של ביטוי HER גבוה באיור התחתון.
שוב, נראה שמדד משפחת סימפסון יורד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות הנתונים שנוצרו על ידי הניתוח החישובי טובה רק כמו איכות הצביעה, וזה חייב להיות ברמה טכנית גבוהה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לכימות הטרוגניות מולקולרית בפלחים היסטולוגיים של גידולים תוך שימוש באימונופלואורסנציה כמותית וניתוח תמונה. הגישה שואפת לשפר את פיתוח הביומארקרים הקליניים על ידי מתן מדד סטטיסטי של הטרוגניות בביטוי חלבון.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- נוירו-מדע
- אונקולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- כימות ביטוי של ביומרקרים הוא קריטי במחקר סרטני.
- שיטות מסורתיות כמו אימונוהיסטוכימיה סובלות ממגבלות ברגישות ובכימות.
- אימונופלואורסנציה מציעה גישה כמותית יותר להערכת ביטוי חלבון.
- הבנת הטרוגניות בגידולים יכולה ליידע אסטרטגיות טיפוליות.
מטרת המחקר
- לכמת באופן מדויק ביטוי של ביומרקרים בכל פלח רקמה.
- להקצות ערכים מספריים למידת ההטרוגניות בביטוי חלבון.
- לשפר את המיפוי של ביטוי ביומרקרים ברקמות סרטניות הטרוגניות.
שיטות ששימשו
- סריקת פלחים של רקמה עם תווית אימונופלואורסנטית באמצעות סורק שקופיות שלמות.
- בחירת אזורי עניין בתוך הגידול להערכה.
- כימות ביטוי חלבון באמצעות מערכת ניתוח תמונה אוטומטית aqua analysis.
- יצירת מפות חום של הטרוגניות להדגמת שינויים בביטוי ביומרקרים.
תוצאות מרכזיות
- הדגמת היכולת למפות שינויים בביטוי ביומרקרים ברקמת סרטן.
- הצגת שינויים בדפוסי ביטוי לפני ואחרי טיפול כימותרפי.
- מתן הערכה כמותית של הטרוגניות באמצעות מדד סימפסון.
- הדגשת היתרונות של אימונופלואורסנציה על פני שיטות מסורתיות.
מסקנות
- השיטה מגבירה את ההבנה של הטרוגניות של ביומרקרים בגידולים.
- היא מציעה גישה רגישה וכמותית יותר ליישומים קליניים.
- טכניקה זו יכולה לסייע בפיתוח טיפולים ממוקדים המבוססים על ביטוי ביומרקרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying spatial heterogeneity of protein expression in tumors addresses a critical gap in biomarker-driven drug development, where traditional bulk or semi-quantitative methods mask subpopulation-level variability that can influence therapeutic response and resistance. By providing a numerical, spatially resolved measure of biomarker distribution, this method enables more precise patient stratification and supports mechanistic de-risking in target validation and assay development pipelines. Its application to ER and HER2 in ovarian cancer demonstrates direct relevance to endocrine and targeted therapy response prediction, informing go/no-go decisions in preclinical and early clinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping biomarker expression heterogeneity as an independent variable in target validation studies.
- Operational Value: Supports functional target validation by revealing whether observed biomarker levels reflect uniform target engagement or are confounded by intratumoral variability.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying targets with homogeneous expression patterns more likely to yield consistent drug responses across tumor regions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, spatially resolved protein expression maps that serve as quantitative benchmarks for developing and standardizing immunofluorescence-based assays.
- Reproducibility: Uses automated tiling and AQUA scoring to minimize observer bias and ensure consistent quantification across tissue sections and experimental batches.
- Screening Scalability: Produces tile-level data compatible with high-content analysis workflows, enabling scalable evaluation of compound effects on biomarker distribution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase heterogeneity measurements to preclinical validation by providing a disease-relevant system for assessing biomarker stability before and after therapeutic intervention.
- Mechanistic De-risking: Quantifies changes in ER and HER2 expression heterogeneity pre- and post-chemotherapy, offering a predictive biomarker for therapy-induced phenotypic shifts.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying whether therapeutic effects are uniform or selective, reducing late-stage failure due to unanticipated resistant subclones.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation, particularly for biomarker-driven therapies where spatial expression patterns influence drug efficacy and resistance mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of protein expression heterogeneity as a variable in mechanistic studies of tumor biology and signaling pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (AQUA scores per tile) that facilitate reproducible compound screening in heterogeneous tumor models.
- Analytics: Generates heterogeneity heat maps and Simpson’s index-derived scores, providing statistical metrics to compare conditions and track expression changes over time or treatment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by demonstrating how biomarker expression shifts post-treatment, informing pharmacodynamic monitoring strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across cancer types and biomarkers, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in biomarker relevance by reducing mechanistic ambiguity arising from unmeasured intratumoral heterogeneity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantification through automated image analysis and validated staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of biomarkers with uniform expression, reducing investment in targets likely to fail due to heterogeneous target availability.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by highlighting biomarkers where heterogeneity correlates with poor prognosis or variable treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, whole-slide scanning, and AQUA-based image analysis.
- Dependent on high-quality, multiplex immunofluorescence staining and a whole-slide fluorescence scanner with spectral unmixing capabilities.
- Necessitates standardized protocols for region-of-interest selection and background correction to ensure cross-lab comparability.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., xenografts, organoids) requires validation of epithelial masking and signal segmentation parameters.
- Practical limitations include dependency on antibody specificity and signal-to-noise ratio, which can affect quantification accuracy in low-abundance targets.
