הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת במדויק את ביטוי הביומארקרים בחתכים של רקמות סרטן אנושיות שלמות, וזאת כדי להקצות ערך מספרי למידת ההטרוגניות בביטוי החלבון. מטרה זו מושגת תחילה על ידי סריקה של חתכי רקמת סרטן המסומנים באימונו-פלואורסצנציה באמצעות סורק פלואורסצנציית שלבים שלמים. לאחר מכן, נבחרים אזורי עניין בתוך הגידול לצורך הערכה.

לאחר מכן, ביטוי החלבון הנחקר באזורי הגידול הפולשניים נמדד כמותית באמצעות מערכת ניתוח התמונות האוטומטית aqua analysis. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו למיפוי ביטוי של סמנים ביולוגיים ברקמות סרטניות, שלעיתים קרובות הן הטרוגניות מאוד לאורך נתח הרקמה. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקות אלו על פני שיטות מסורתיות, כגון אימונוהיסטוכימיה המשתמשת בריאגנטים לצביעה ולויזואליזציה מטרית, הוא שהאימונופלואורסצנציה היא כמותית ורגישה יותר.

שילוב של שיטות אנליטיות אלו עם סריקת אימונופלורסצנציה של נתח שלם מאפשר מיפוי מדויק של שינויים קלים בביטוי של סמנים ביולוגיים ברחבי רקמות. בפעם הראשונה, הדרכים הללו מוצגות על ידי Mark Gustafson, מנהל תפעול במעבדת Histo RX. לאחר חיתוך של ביופסיית רקמת סרטן באמצעות מיקרוטום וצביעה אימונופלורסצנטית של הדגימה לביטוי של הסמנים הביולוגיים הרלוונטיים, טענו עד חמש שקופיות של הנתחים הצבועים לתוך מחזיק השקופיות של סורק השקופיות.

לאחר מכן, באמצעות הממשק בקונסולת ה-scan scope, בחרו עבור כל שקופית אזור שיקיף את כל הרקמה על השקופית, ללא תלות בתבנית הצביעה או בהיבטים נצפים אחרים של הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קונסולת ה-scan scope, בחרו תחילה אזור רקמה להערכה, באופן אידיאלי בתוך אזור הגידול ברקמה, כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.

כעת, באמצעות תכונת החשיפה האוטומטית של קונסולת סורק המיקרוסקופ, קבעו את זמן החשיפה עבור כל ערוץ יחד עם מיקוד התמונה; השתמשו במעוין הכחול בתמונת קונסולת סורק המיקרוסקופ כדי לבחור אזור נוסף הרחוק מהרקמה, אך עדיין בתוך אזור השקופית תחת זכוכית הכיסוי, כדי להגדיר את אזור הרקע שבו ייגזרו תמונות תיקון השדה השטוח (flat field correction). עבור כל מסנן, הוסיפו נקודות מיקוד לאזור הרקמה המיוצג על ידי ריבועים צהובים כדי למקסם את לכידת התמונה. אם נראה כי התמונות כוללות רקע גבוה או ארטיפקטים אחרים, יש להזיז את אזור התמונה ולגזור תמונות חדשות.

לאחר מכן סורקים את הרקמה ואת תמונות הפלחים הדיגיטליות שהושגו מעלים באופן אוטומטי למסד הנתונים של Aperio spectrum. יש ללחוץ פעמיים על תמונת התצוגה המקדימה בתוכנת spectrum כדי לבחור את הפלח לאנליזה מרשימת הפלחים הדיגיטליים במסד הנתונים של spectrum. לאחר מכן, בעזרת התמונה המלווה עם סימוני h ו-D, יש לסמן את אזור העניין (ROI) בתמונת הפלואורסצנציה.

ניתן לבחור מספר אזורי עניין (regions of interest) המגודרים באמצעות מעגלים בודדים על מדגם אחד. התמונות המannotated נשמרות באופן אוטומטי במסד נתוני הספקטרום. כעת בחרו Analyze מסרגל התפריטים בחלק העליות של המסך; כאשר חלון הניתוח יופיע, בחרו histo RX aqua analysis מהתפריט הנפתח.

כאשר תהיו מוכנים להתחיל, לחצו על כפתור הניתוח (analyze). חלון קונסולה מצומצם יופיע בשורת המשימות של Windows ויציג את התקדמות העברת התמונות ממאגר הנתונים של Spectrum למחשב המקומי. לאחר העברת הנתונים, תופעל תוכנת aqua analysis כדי להפיק aqua score באמצעות אלגוריתם aqua scoring לא מפוקח, המבוסס על קיבץ נתונים (clustering) של סף לדוגמה ראשון – אות תמונת ה-pan cytokeratin מעל אות תמונת הרקע. פעולה זו תאפשר שימוש בפיקסלים להגדרת מסכת גידול (tumor mask) שניתן יהיה להשתמש בה לחישובים הבאים.

השתמשו בפיקסלים בעלי ביטוי גבוה של pan cytokeratin כדי להגדיר גם את האזורים הציטופלזמיים או הבלתי-גרעיניים של תאי הגידול. כפי שניתן לראות כאן, פיקסלים עם אות גבוה בערוץ ה-DPI שנמצאים בתוך מסכת הגידול מזוהים כבעלי אופי גרעיני. אם במהלך הבדיקה מזוהים שדות שלא היו מתאימים לדירוג עקב ארטיפקטים של הדגימה או של הדימוי, שדות אלו יוסרו מהדירוג ויובילו לתוצאה סופית של כישלון.

תוצאות הדירוג של aqua מוצגות כטבלת ציונים המשויכים לכל אריח פיקסלים של 512 על 512 באזור העניין בתוך דגימת חתך רקמה שלמה, אותה ניתן לשמור ולהשתמש בה לניתוח סטטיסטי עוקב. מיקרוגרפיה פוטוגרפית זו, הצבועה בהמטוקסילין ואאוזין, מדגימה כיצד אזורים שונים של אותו סרטן שחלה יכולים להפגין מורפולוגיה משתנה. תצוגת ההגדלה הגבוהה בצד ימין למעלה של איור B מדגישה תאים עם התבהרות ציטופלזמית ודפוס צמיחה סולידי בחלקו העליון של הגידול.

עם זאת, לחלק התחתון של הרקמה המוגדלת בחלק הימני התחתון של איור C יש ציטופלזמה אאוזינופית הומוגנית יותר ודפוס צמיחה פפילרי. כאן, מפות חום של הטרוגניות בביטוי ER בחתך רקמה של סרטן שחלה לפני ואחרי טיפול כימותרפית מוצגות בפנלים העליון והתחתון, בהתאמה. שימו לב לשינוי מביטוי ER משתנה לאורך החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להתפלגות אחידה של ביטוי ER גבוה המוצגת בצבע אדום באיור התחתון.

הייצוג המספרי של שינוי זה מסומן משמאל על ידי הירידה במדד סימפסון (Simpsons index). באיור זה מוצגות שוב מפות חום של ההטרוגניות של HER two בחתך רקמה של סרטן השחלה לפני ואחרי טיפול, כפי שניתן לראות בפנלים העליון והתחתון בהתאמה. שימו לב שוב לשינוי מביטוי משתנה של HER two לאורך החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להתפלגות אחידה של ביטוי גבוה של HER two באיור התחתון.

שוב ניתן לראות כי מדד סימפסון (Simpsons index) פוחת. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי איכות הנתונים המופקים מהניתוח החישובי תלויה אך ורק באיכות הצביעה, וזו חייבת להיות ברמה טכנית גבוהה.