Name: הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למד מיפוי הטרוגניות ביטוי חלבון בגידולים באמצעות immunofluorescence כמותי. השיטה מאפשרת הערכה מספרית של שונות ביומרקרים ופיתוח טיפולים ממוקדים בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון המועצה הסקוטית (מספר גרנט HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), למחקר רפואי סקוטלנד ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), הסרטן מחקר בבריטניה Experimental Medicine מרכז הסרטן ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), וכן סרטן השד פריצת דרך ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

<ol><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li>
<li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li>
<li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide%2C+doxorubicin%2C+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer%3A+the+ICON3+randomised+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li>
<li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li>
<li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer%3A+a+gynecologic+oncology+group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li>
<li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer%3A+three-year+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li>
<li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li>
<li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li>
<li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%3A+a+cancer+researcher%27s+conceptual+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li>
<li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cells%22%5BJournal%5D)">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li>
<li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li>
<li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+changes+in+ER%2C+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li>
<li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li>
</ol>

JC, MG, CJ, ו CS עובדים של HistoRx, Inc

השיטה המתוארת להלן היתרי כימות הטרוגניות מולקולרית ברמת פורמלין-קבוע, פרפין, משובצים קטעים היסטולוגית של חומר הגידול. השיטה מאפשרת הערך יוקצו מידת ההטרוגניות בקטע הרקמה, כך זה עשוי אז להילקח בחשבון כמשתנה בפיתוח סמן ביולוגי וניתוח. אמנם באופן כללי עדיף כי הם סמנים רקמה הומוגנית מבחינת הביטוי, כך assay הוא פחות רגישים טעות הדגימה או משוא פנים, זה עלול בנסיבות מסוימות להיות שימושי לכמת ההטרוגניות כפרמטר. לדוגמה, כפי שמוצג בדוגמה המחשה של ER ו - HER2, סמנים נפוצים להראות הטרוגניות רבה ביטוי זה כרגע לא ידוע אם זה מהווה גורם מנבא עצמאי או חזוי לגבי התוצאה הקלינית או התגובה לטיפול, בהתאמה. כמו כן, כפי שמודגם, הטיפול עצמו עלול לשנות באופן דינמיאוכלוסיות המרכיבים של תאים, ולכן מדידה של העשרה היעד עשוי להיות שימושי המנחה החלטות הטיפול. עם זאת, הטכניקה היא מוגבלת על ידי אותם גורמים אשר מגבילים מנתח histopathological או סמנים ביולוגיים (כגון immunohistochemical) המסורתית. התוצאה היא תלויה בסוג, גודל, איכות של הרקמה להיות מנותח, ולכן קטע רקמה יחיד לא יכול להיות נציג של הגידול כולו. ואכן, המדד סימפסון עשוי להיות מוטה יתר על המידה על ידי גודל של הרקמה (מספר מסגרות בשבי עשרות AQUA נמדד). Immunogenicity של epitopes הנמדדים עשויים להיות כפופים טרום ניתוח גורמים בלתי נשלט אשר artifactually לשנות את הביטוי שלהם על פני קטע הרקמה (כגון זמן איסכמיה קר, או את האורך של קיבעון, ו חפץ קצה). זוהי בעיה במיוחד עבור-epitopes phospho, אשר ידוע לשמצה יציב 14, 15. לכן הטכניקה עשוי להיות מתאים יותרעל דגימות ביופסיה כריתה ולא קטן, שבוצעו על מספר מקטעים ולא רק אחד. בסופו של דבר, 3D שיטות הדמיה עשויות להציע הזדמנות טובה יותר לכמת בפרמטר זה. הטכניקה כפי שהוצגה עשוי להיות מוגבל על ידי גורמים ביולוגיים, כגון השתנות בביטוי של epitope מיסוך cytokeratin. זה עלול להיות מדאיג במיוחד בסוגי סרטן אלה, כולל סרטן השחלות וסרטן השד, אשר עוברים אפיתל ל-mesenchymal המעבר (EMT) או מועשרים שאינם אפיתל רכיבים או בתאי גזע 16, כמו לאחרונה הוכח להתרחש כימותרפיה טיפול בסרטן השחלות ב 17 במבחנה, ועל חולי סרטן השד בעקבות טיפול 18. מגבלה זו ניתן להתגבר באמצעות נוגדנים מיסוך חלופה (או קוקטיילים של נוגדנים), כגון cytokeratin פלוס vimentin, אשר שהוגברו ב EMT 16. בנוסף, מאז רכיבים אחרים של הרקמה (את המיקרופוןroenvironment), כגון fibroblasts או בתאי האנדותל בכלי הדם הם גם יותר ויותר ממוקדים על ידי טיפולים ביולוגיים, הטכניקה עשויה גם להיות מורחבת כדי להבקיע רכיבים אלה, באמצעות מסכות ספציפיות תאים של עניין, כגון PECAM / CD31 להכתים עבור לתאי אנדותל של כלי הדם . למרות העיבוד של מדד סימפסון שימש כמדד ההטרוגניות בפרוטוקול הנוכחי בשל פשטותה, אמצעים אחרים של ההטרוגניות יכול לשמש, כגון מדידות פשוטה של ​​נטייה מרכזית (ממוצע, חציון השונות, וכו &#39;). בנוסף, חישובי מדד סימפסון יכול להיות שונה כדי להתאים טוב יותר אוכלוסייה מבחן בפרט. השימוש Z-ציון טרנספורמציות מאפשר הניקוד יהיה רלוונטי יותר עבור מספר רב של סמנים מאז ההטרוגניות מבוסס על סטיית סביב הממוצע עבור ערכת נתונים. עם זאת, בטווח הכולל של מניה יכולה להיות מוגבלת בסוג זה של טרנספורמציה. עיצובים מסוימים עשויים להיות מתאימים יותרפשוט בן עשרות AQUA בפועל עבור כל דגימות של קבוצה סמן מסוים. בחירת מספר פחי הפסקות גם הגבלה בטווח של ערכים אשר עלולה לגרום ועלול להיות מותאם עיצובים ניסיוניים חלופיים. השתמשנו ER ו HER2 במחקר הנוכחי כמו סמנים מועמד, כיוון שהם משמשים כבר במרפאה, לעזור לענות על שאלות קליניות רלוונטי לגבי היעילות של טיפולים ממוקדים, ידועים להפגין ההטרוגניות שינוי ניכר והן הראשוני רחוק המחלה 19. עם זאת, סמן אופטימלי של ההטרוגניות נותר נחוש. אפשרויות אחרות עשויות לכלול סמנים cytogenetic של clonality, כגון אלו המשמשים בעבר במחקרים FISH שלבי הביניים 20. הגישה דורשת אימות נוסף, קבוצות גדולות קליניים המבואר טוב או ניסויים קליניים על מנת להמשיך ולבסס את הרלוונטיות של פרמטר זה בביולוגיה של הסרטן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ScanScope פלורידה </td><td> Aperio </td><td> ScanScope פלורידה </td><td> משמש מצויד כמו מהספק </td></tr><tr><td> ספקטרום </td><td> Aperio </td><td> ספקטרום </td><td> מספרים תצורה קטלוג ישתנו כיצד מוסדות מקומיים להקים מסד הנתונים שלהם ו-IT מבנה. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, בשיתוף עם AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> החבילה מאפשרת AQUAjustment AQUAnalysis להשתמש בתמונות המאוחסנות ספקטרום. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 בדילול 400 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי מחבת cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 בדילול 50 </td></tr><tr><td> נוגדן diluent </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision עזים ארנב HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> חלבון לחסום </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים אנטי עכבר Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI בינוני הרכבה </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza מרכז Immunostaining </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> משמש כאן מכתים הספסל העליון immunofluorescence </td></tr></tbody></table>

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

ההטרוגניות מורפולוגיים בתוך הגידול הפרט היא מוכרת היטב על ידי histopathologists בפועל כירורגית. אמנם זה לוקח בדרך כלל צורה של אזורים של בידול מובהק לתוך תת היסטולוגית מוכר, או כיתה פתולוגיים שונים, לעתים קרובות ישנם הבדלים דקים יותר פנוטיפ אשר להתריס סיווג מדויק (איור 1). בסופו של דבר, מאז מורפולוגיה מוכתב על ידי פנוטיפ המולקולרית הבסיסית, אזורים עם הבדלים נראים צפויים להיות מלווה ההבדלים בביטוי של חלבונים אשר לתזמר פונקציה התנהגות הסלולר, ולכן המראה. המשמעות של ההטרוגניות (מולקולרית) נראים ובלתי נראים על הפרוגנוזה אינו ידוע, אך הראיות האחרונות עולה כי, לפחות ברמה הגנטית, קיימת הטרוגניות 1,2 הגידול הראשוני, וכמה אלה משנה שיבוטים להצמיח גרורתי ( וקטלני לכן) המחלה. יתר על כן, חלבונים מסוימיםכפי שנמדד על סמנים כי הם מטרות הטיפול (למשל עבור ER ו HER2 עבור טמוקסיפן ו trastuzumab (הרצפטין), בהתאמה). אם חלבונים אלו מראים ביטוי משתנה בתוך הגידול אז התגובות טיפולית יכול להיות גם משתנה. תוכניות בשימוש נרחב הבקיע היסטופתולוגיות עבור אימונוהיסטוכימיה או להתעלם, או מספרית homogenize כימות של ביטוי חלבונים. באופן דומה, טכניקות הרסניות, שבו דגימות הגידול הם הומוגני (כגון פרופיל ביטוי גנים), מידע כמותי ניתן הובהר, אך מידע מרחבי אבוד. מיפוי גנטי ההטרוגניות גישות בסרטן הלבלב יש לסמוך גם על דור של השעיה תא בודד 3, או 4 macrodissection. מחקר שנערך לאחרונה השתמשה נקודות קוונטיות כדי למפות ההטרוגניות מורפולוגיים מולקולרית ברקמת סרטן הערמונית 5, לספק הוכחה של עקרון זה מיפוי מורפולוגיה מולקולרית אינו ריאלי, אבל נפילה שלhort של לכימות ההטרוגניות. מאז אימונוהיסטוכימיה הוא, במקרה הטוב, רק חצי כמותית ובכפוף ההטיה התוך והבין הצופה, יותר רגישים ו - מתודולוגיות כמותיות נדרשים על מנת למפות במדויק ולכמת ההטרוגניות רקמות באתרם. פיתחנו מתודולוגיה ויושמו ניסויים סטטיסטיים על מנת לכמת את ההטרוגניות באופן שיטתי ביטוי חלבון בסעיפים רקמה שלמה של גידולים, בהתבסס על ניתוח כמותי אוטומטי (AQUA) מערכת 6. סעיפים רקמות מסומנים עם נוגדנים ספציפיים כנגד cytokeratins ויעדים של עניין, מצמידים את fluorophore שכותרתו נוגדנים משני. שקופיות הם צילמו באמצעות סורק כל שקופית פלואורסצנטי. תמונות מחולקים מאות עד אלפי אריחים, וכל אריח מוקצה אז ציון AQUA שהיא מדד של ריכוז חלבון בתוך הרכיב (גידולים) של רקמת האפיתל. Heatmaps נוצרות לייצג ביטוי רקמות של חלבונים ציון ההטרוגניות מוקצה, באמצעות מדד סטטיסטי של ההטרוגניות ששימשו במקור אקולוגיה, בהתבסס על מדד סימפסון המגוון הביולוגי 7. עד כה לא היו ניסיונות שיטתי למפות ולכמת את השתנות בד בבד עם ביטוי חלבון, בהכנות היסטולוגית. כאן, אנו ממחישים את השימוש הראשון בשיטה להחיל ER ו HER2 ביטוי סמן ביולוגי בסרטן השחלות. באמצעות שיטה זו סוללת את הדרך לניתוח ההטרוגניות כמשתנה בלתי תלוי מחקרים הביטוי סמן במחקרים translational, כדי להקים את המשמעות של ההטרוגניות על הפרוגנוזה וחיזוי התגובות לטיפול.

כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.

הטרוגניות מורפולוגית בתוך גידול בודד מוכרת היטב להיסטופתולוגים בפרקטיקה כירורגית. בעוד שדבר זה לובש לעיתים קרובות את הצורה של...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת במדויק את ביטוי הסממנים הביולוגיים לאורך חתכים שלמים של רקמת סרטן אנושית, וזאת כדי להקצות ערך מספרי לדרגת ההטרוגניות בביטוי החלבון. דבר זה מושג תחילה על ידי סריקת חתכים של רקמת סרטן המסומנים באימונו-פלואורסצנציה באמצעות סורק פלואורסצנציה לשקופיות שלמות. לאחר מכן, נבחרים אזורי עניין בתוך הגידול לצורך הערכה.לאחר מכן, הביטוי של החלבון הנבדק באזורי הגידול הפולשניים מכומת באמצעות מערכת ניתוח תמונות אוטומטית מסוג aqua analysis. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו למיפוי ביטוי של סמנים ביולוגיים ברקמת סרטן, שלעיתים קרובות היא מאוד הטרוגנית לאורך חיתוך הרקמה. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקות אלו על פני שיטות מסורתיות, כגון אימונוהיסטוכימיה המשתמשת ברכיבי ויזואליזציה צבעוניים ומטריים, הוא שפלוורסצנציה עקיפה היא כמותית ורגישה יותר.שילוב של שיטות אנליטיות אלו עם סריקת אימונופלואורסצנציה של נתח שלם מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של שינויים עדינים בביטוי של סמנים ביולוגיים ברחבי רקמות. לראשונה, הליכים אלו מודגמים על ידי Mark Gustafson, מנהל תפעול ישיר במעבדת Histo RX. לאחר חיתוך של ביופסיה מרקמת סרטן באמצעות מיקרוטום וצביעה אימונופלואורסצנטית של הדגימה לביטוי של הסמנים הביולוגיים הרלוונטיים, טענו עד חמש שקפיות של הנתחים הצבועים למגש השקפיות של סורק השקפיות.לאחר מכן, השתמשו בממשק בקונסולת סורק המיקרוסקופ (scan scope console). עבור כל שקופית, בחרו אזור המקיף את כל הרקמה על השקופית, ללא קשר לתבנית הצביעה או להיבטים ניתנים לצפייה אחרים של הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קונסולת סורק המיקרוסקופ, בחרו תחילה אזור רקמה להערכה, באופן אידיאלי בתוך אזור הגידול ברקמה, כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.כעת, באמצעות תכונת החשיפה האוטומטית של קונסולת מיקרוסקופ הסריקה, קבעו את זמן החשיפה עבור כל ערוץ יחד עם מיקוד התמונה. השתמשו במעוין הכחול בתמונת קונסולת מיקרוסקופ הסריקה כדי לבחור אזור נוסף הרחוק מהרקמה, אך עדיין בתוך אזור השريחה שמתחת לזכוכית המכסה, כדי להגדיר את אזור הרקע שבו ייגזרו תמונות תיקון השטח השטוח (flat field correction). עבור כל מסנן, הוסיפו נקודות מיקוד לאזור הרקמה, המיוצגות על ידי ריבועים צהובים, כדי למטב את לכידת התמונה. אם נראה כי לתמונות יש רקע גבוה או ארטיפקטים אחרים, יש להזיז את אזור התמונה ולגזור תמונות חדשות.לאחר מכן סורקים את הרקמה ואת תמונות הסליידים הדיגיטליים שהושגו מעלים באופן אוטומטי למסד הנתונים של Aperio spectrum. יש ללחוץ פעמיים על תמונת התמניאל בתוכנת spectrum כדי לבחור את הסלייד לניתוח מרשימת הסליידים הדיגיטליים במסד הנתונים של spectrum. לאחר מכן, באמצעות התמונה המלווה עם סימון h ו-D, סמנו את אזור העניין (ROI) בתמונה הפלואורסצנטית.ניתן לבחור מספר אזורי עניין המוגדרים באמצעות עיגולים בודדים על מדגם אחד. התמונות עם ההערות נשמרות באופן אוטומטי למסד נתוני הספקטרום. כעת בחרו Analyze מסרגל התפריטים בחלק העליון של המסך; כאשר חלון הניתוח מופיע, בחרו histo RX aqua analysis מהתפריט הנפתח.כאשר תהיו מוכנים להתחיל, לחצו על כפתור הניתוח (analyze). חלון קונסול מכווץ יופיע בשורת המשימות של Windows ויציג את התקדמות העברת התמונות ממאגר הנתונים של Spectrum למחשב המקומי. לאחר העברת הנתונים, תופעל תוכנת aqua analysis כדי להפיק aqua score באמצעות אלגוריתם דירוג aqua לא מפוקח, המבוסס על קיבוץ נתונים של סף דגימה ראשוני – אות תמונת ה-pan cytokeratin שמעל אות תמונת הרקע. דבר זה יאפשר שימוש בפיקסלים להגדרת מסיכת גידול (tumor mask), שבה ניתן יהיה להשתמש לחישובים המשכיים.השתמשו בפיקסלים עם ביטוי גבוה של pan cytokeratin כדי להגדיר גם את האזורים הציטופלזמיים או הבלתי-גרעיניים של תאי הגידול. כפי שניתן לראות כאן, הפיקסלים עם אות גבוה בערוץ ה-DPI שנמצאים בתוך מסכת הגידול מזוהים כבעלי טבע גרעיני. אם במהלך הבדיקה מזוהים שדות שלא היו מתאימים לדירוג עקב ארטיפקטים של הדגימה או של הדמיון, שדות אלו יוחרגו מהדירוג ויביאו לתוצאה סופית של כישלון (fail).תוצאות הדירוג של ה-aqua מוצגות כטבלה של ציונים המשויכים לכל אריח פיקסלים של 512 על 512 באזור העניין בתוך דגימת חתך רקמה שלמה, אותה ניתן לשמור ולהשתמש בה לצורך ניתוח סטטיסטי עוקב. מיקרוגרפיית תמונות אלו, הצבועות בהמטוקסילין ואאוזין, מדגימות כיצד אזורים שונים של אותו סרטן שחלה יכולים להפגין מורפולוגיה משתנה. התצפית בהגדלה גבוהה בצד ימין למעלה של איור B מדגישה תאים עם התבהרות ציטופלזמית ותבנית גדילה סולידית בחלקו העליון של הגידול.עם זאת, לחלק התחתון של הרקמה המוגדלת בחלק הימני התחתון של איור C, יש ציטופלזמה אאוזינופילית הומוגנית יותר ותבנית צמיחה פפילרית. כאן, מפות חום של ההטרוגניות בביטוי ER בחתך רקמה של סרטן השחלה לפני ואחרי טיפול כימותרפית מוצגות בפאנלים העליון והתחתון בהתאמה. שימו לב לשינוי מביטוי ER משתנה ברחבי החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להפצה אחידה של ביטוי ER גבוה המסומנת באדום באיור התחתון.הייצוג המספרי של שינוי זה מסומן משמאל על ידי הירידה במדד סימפסון (Simpsons index). באיור זה מוצגות שוב מפות חום של הטרוגניות של HER two בחתך רקמה של סרטן שחלה, לפני ואחרי טיפול, כפי שניתן לראות בפאנלים העליון והתחתון בהתאמה. שימו לב שוב לשינוי מביטוי HER two משתנה לאורך החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להתפלגות אחידה של ביטוי HER two גבוה באיור התחתון.שוב ניתן לראות כי מדד סימפסון (Simpsons index) יורד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שאיכות הנתונים המופקים מהניתוח המחשוב תלויה אך ורק באיכות הצביעה, אשר חייבת להיות ברמה טכנית גבוהה.

heterogeneity-mapping-protein-expression-tumors-using-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה מולטיספקטרלית פלואורסצנטית באתרה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T חודרים ברקמת הגידול. קריוסקציה של רקמת קרצינומה של תאי הכליה מטופלת בנוגדנים כדי לתייג תאי T CD8+ המבטאים קולטנים מעכבים ספציפיים ומציגים פנוטיפ עמיד לאימונותרפיה. החלק המסומן מוצג באמצעות מיקרוסקופ מולטיספקטרלי כדי לזהות את תת-האוכלוסיות השונות של תאי CD8+ T.

הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובת משתתפים לניתוח תת-אוכלוסיות תאי T עמידים לאימונותרפיה

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

הטרוגניות חלוקת תאים HER2 חיובי יכול להיות שנצפו בקבוצת משנה של סרטן השד ומייצר דילמות קליניים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול אמין וחסכוני להגדיר, לכמת, ולהשוות בין HER2 אינטרה-גידול הטרוגניות גנטית בסדרה גדולה של סרטן השד heterogeneously מעובד.

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

פרוטוקול מפורט עבור לוח שש-marker immunofluorescence מולטיפלקס אופטימיזציה שבוצעו, באמצעות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות עבור תוצאות עקביות יותר זמן הליך קצר יותר. גישה זו ניתן להתאים ישירות על ידי כל מעבדה לחקר חיסונית-אונקולוגיה.

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

במאמר זה מתואר פרוטוקול להגברת אות טירמיד ידנית (TSA) מולטיפלקס אימונופלואורסנציה (mIF) בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מקטעים משובצי פרפין קבועים פורמלין (FFPE) לצביעה של שניים עד שישה אנטיגנים לכל שקופית, בהתאם לסורק השקופיות הזמין במעבדה.

מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד מתבצע אפיון תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אימונוהיסטוכימיה מרובה.

ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה לזיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון בקטעי רקמה משובצים פרפין קבועים בפורמלין.

קרטוגרפיה מולקולרית דו-מודאלית: שילוב זיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון

למד מיפוי הטרוגניות ביטוי חלבון בגידולים באמצעות immunofluorescence כמותי. השיטה מאפשרת הערכה מספרית של שונות ביומרקרים ופיתוח טיפולים ממוקדים בסרטן.

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

גלה סרטונים נוספים