הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת במדויק את ביטוי הסמנים הביולוגיים על פני קטעי רקמה שלמים של סרטן אנושי על מנת להקצות ערך מספרי למידת ההטרוגניות בביטוי החלבון. זה מושג על ידי סריקה ראשונה של קטעים פלואורסצנטיים חיסוניים של רקמת סרטן באמצעות סורק פלואורסצנטי שקופיות שלם. אזורי העניין הבאים בתוך הגידול נבחרים להערכה.

לאחר מכן מכומת הביטוי של החלבון המעניין באזורי הגידול הפולשניים באמצעות מערכת ניתוח התמונה האוטומטית לניתוח מים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי למפות ביטוי סמנים ביולוגיים ברקמה סרטנית, שלעתים קרובות היא הטרוגנית מאוד על פני קטע הרקמה. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקות אלו על פני שיטות מסורתיות כגון אימונוהיסטוכימיה באמצעות ריאגנטים להדמיה צבעונית ומטרית הוא שהאימונופלואורסצנציה כמותית ורגישה יותר.

בשילוב שיטות אנליטיות אלה עם חתך שלם, סריקה אימונופלואורסצנטית מאפשרת מיפוי עדין של וריאציות עדינות בביטוי סמנים ביולוגיים על פני רקמות. בפעם הראשונה, מדגים את הנהלים הללו מארק גוסטפסון, מנהל תפעול ישיר במעבדת Histo RX. לאחר מיקרוטום, חתך של ביופסיה של רקמת סרטן וצביעה אימונו-פלואורסצנטית של הדגימה לביטוי הסמנים הביולוגיים המעניינים, טען עד חמש שקופיות של החלקים המוכתמים לתוך קלטת השקופיות של סורק השקופיות.

לאחר מכן שימוש בממשק במסוף טווח הסריקה. עבור כל שקופית, בחר אזור שיקיף את כל הרקמה בשקופית, ללא קשר לדפוס הצביעה או להיבטים אחרים הנראים לעין של הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קונסולת היקף הסריקה, ראשית, בחר אזור ברקמה להערכה אידיאלית בתוך אזור הגידול של הרקמה כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.

כעת באמצעות תכונת החשיפה האוטומטית של קונסולת היקף הסריקה, קבע את זמן החשיפה עבור כל ערוץ יחד עם מיקוד התמונה, השתמש ביהלום הכחול בתמונת קונסולת היקף הסריקה כדי לבחור אזור נוסף הרחק מהרקמה, אך עדיין בתוך אזור השקופית מתחת להחלקת הכיסוי כדי להגדיר את אזור הרקע שבו יירכשו תמונות תיקון השדה השטוח. עבור כל מסנן, הוסף נקודות מיקוד לאזור הרקמה המיוצג על ידי ריבועים צהובים כדי לייעל את לכידת התמונה. אם נראה שלתמונות יש רקע גבוה או חפצי תמונה אחרים, יש להזיז את אזור התמונה ולרכוש תמונות חדשות.

לאחר מכן הרקמה נסרקת ותמונות השקופיות הדיגיטליות שנרכשו מועלות אוטומטית למסד הנתונים של ספקטרום Aperio. לחץ פעמיים על התמונה הממוזערת של תוכנית הספקטרום כדי לבחור את השקופית לניתוח מרשימת השקופיות הדיגיטליות במסד הנתונים של הספקטרום. לאחר מכן באמצעות התמונה המבוארת h ו-D הנלווית, הוסף הערות לאזור העניין בתמונה הפלואורסצנטית.

ניתן לבחור אזורי עניין מרובים המתוחמים במעגלים בודדים על דגימה אחת. התמונות המבוארות נשמרות אוטומטית במסד הנתונים של הספקטרום. כעת בחר נתח משורת התפריטים בחלק העליון של המסך כאשר חלון הניתוח מופיע, בחר histo RX aqua analysis מהתפריט הנפתח.

כשהוא מוכן להתחיל, לחץ על כפתור הניתוח, חלון מסוף ממוזער יופיע בשורת המשימות של Windows המציג את התקדמות העברת התמונות ממסד הנתונים של הספקטרום למחשב המקומי. לאחר העברת הנתונים, ניתוח אקווה יופעל כדי ליצור ציון אקווה באמצעות אלגוריתם ניקוד אקווה לא מפוקח המבוסס על אשכול הנתונים של סף ראשון של דגימה, אות תמונת הפאן ציטוקרטין מעל אות תמונת הרקע. זה יאפשר שימוש בפיקסלים כדי להגדיר מסכת גידול שניתן להשתמש בה לאחר מכן לחישובים הבאים.

השתמש בפיקסלים בעלי ביטוי גבוה של ציטוקרטין כדי להגדיר גם את האזורים הציטופלזמיים או הלא גרעיניים של תאי הגידול. כפי שניתן לראות כאן, הפיקסלים עם אות גבוה בערוץ ה-DPI שנמצאים בתוך מסכת הגידול מזוהים כגרעיניים באופיים. אם לאחר הסקירה מזוהים שדות שלא התאימו לניקוד עקב חפצי דגימה או הדמיה, שדות אלה נמחקים מהניקוד וגם יפיקו תוצאה סופית של כישלון.

תוצאות ניקוד האקווה מיוצגות כטבלת ציונים המשויכת לכל אריח בגודל 512 על 512 פיקסלים באזור העניין בתוך דגימת חתך רקמה שלמה, שניתן לשמור ולהשתמש בה לניתוח סטטיסטי לאחר מכן. מיקרוגרפי צילום אלה המוכתמים ב-hemat toin ו-eoin מדגימים כיצד אזורים שונים של אותו סרטן שחלות יכולים להפגין מורפולוגיה משתנה. תצוגת העוצמה הגבוהה בפינה הימנית העליונה של איור B מדגישה תאים עם ניקוי ציטופלזמי ודפוס גידול מוצק בחלקו העליון של הגידול.

בחלק התחתון של הרקמה המוגדל בחלק הימני התחתון של איור C, לעומת זאת, יש ציטופלזמה אאוזינופילית הומוגנית יותר ודפוס גדילה פפילרי. כאן, מפות חום הטרוגניות של ביטוי ER בקטע רקמה של סרטן השחלות לפני ואחרי טיפול כימותרפי מוצגות בפאנלים העליונים והתחתונים בהתאמה. שימו לב לשינוי מביטוי ER משתנה על פני הקטע עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון להתפלגות אחידה של ביטוי ER גבוה המוצג באדום באיור התחתון.

הייצוג המספרי של שינוי זה מסומן משמאל על ידי הירידה במדד משפחת סימפסון. באיור זה, הטרוגניות, מפות חום של HER 2 בקטע רקמה של סרטן השחלות מוצגות שוב לפני ואחרי הטיפול כפי שניתן לראות בפאנלים העליונים והתחתונים בהתאמה. שימו לב שוב, השינוי ממשתנה HER שני ביטויים על פני הקטע עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון להתפלגות אחידה של ביטוי HER גבוה באיור התחתון.

שוב, נראה שמדד משפחת סימפסון יורד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות הנתונים שנוצרו על ידי הניתוח החישובי טובה רק כמו איכות הצביעה, וזה חייב להיות ברמה טכנית גבוהה.