במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

המטרה הכוללת של מאמר וידאו זה היא לתאר טכניקה להכפיף תאים דבקים לתנאי זרימה למינרית ולהעריך את התגובה למתחי גזירה נוזליים הניתנים לכימות היטב. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של מעגל הזרימה ללא תא הזרימה. המעגל כולל את דופק המאגר, הבולם, הצינורות הקשיחים, הצינורות הרכים, זיני עצירה לארבעה כיוונים ומתאמי פיתוי מחוברים, כמו גם מסנן אוויר.

השלב הבא הוא למלא את המעגל בשמונה השפע הרצוי, כגון מדיום תא בתנאים סטריליים, ולאחר מכן להפעיל את המשאבה כדי למלא את בולם הדופק ולנקות את צינורות האוויר. לאחר מכן הכנסת המגלשה היושבת בתא לתוך הצלחת התחתונה של תא הזרימה. השלב האחרון בהליך הוא הרכבה מלאה של מעגל הזרימה עם תא הזרימה בתור.

בסופו של דבר ניתן להשיג תוצאות המראות יישור של תאי אב אנדותל המסומנים פלואורסצנטית תחת חשיפה למתח גזירה נוזלי דרך החדר השקוף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחקור את ההתנהגות התפקודית של התאים. לעתים קרובות יש צורך לחקות את הפיזיולוגיה in vivo על ידי הכפפת התאים ללחץ גזירה נוזלי. תכננו תא זרימת צלחת מקביל ומעגל זרימה רציף, המאפשרים לנו לחקור את התאים בתנאי זרימה ולהתבונן בהם דרך החדר השקוף.

טכניקה זו יכולה לשמש כלי מחקר רב ערך לתחומי הרפואה וההנדסה. תא הזרימה שלנו מאפשר הדמיה לסירוגין או בזמן אמת של תאים בזרימה באמצעות מיקרוסקופ זקוף או הפוך. יתר על כן, העיצוב של ד"ר אץ' ניק מאפשר לחוקרים לדמות תאים על משטחים שקופים או רדיו-אפקים באמצעות עדשות מיקרוסקופ סטנדרטיות.

יתר על כן, זה יכול ככלי חשוב במחקר פרמקולוגיה לחקור את השפעת תרופות על תאים בתנאי זרימה. הדמיה של ההגדרה היא קריטית מכיוון שקשה לשלוט בכמה מהשלבים על ידי קריאת פרוטוקול בלבד. אתן הוראות שלב אחר שלב כיצד להגדיר את תא הזרימה ומעגל הזרימה הנפוץ במעבדה של Dr.Ock Next להרכבת מעגל הזרימה.

התחל בחיבור קטע של 36 אינץ' של צינורות קשיחים לקצה אחד של בולם דופק לקצה השני. חבר קטע של 18 אינץ' של צינורות רכים. הנח מתאם פיתוי זכר בגודל שמונה אינץ' בסוף קטע הצינורות הרכים בגודל 18 אינץ'.

חבר את הפיתוי הגברי למתאם פיתוי נקבה בגודל שמונה אינץ'. חבר את הפיתוי הנשי לקטע חדש בגודל 18 אינץ' של צינורות רכים. קדחו שלושה חורים במכסה זכוכית של 250 מיליליטר.

על מנת להתאים את הצינור, הכנס קטע של 1.5 אינץ' של צינורות רכים לחור אחד. כפתח אוורור. הכנס את הקצוות החופשיים של הצינור הקשה והרך דרך שני החורים האחרים במכסה לבקבוק הזכוכית של 250 מיליליטר, שישמש כמאגר.

ודא שהצינור הקשיח מגיע לתחתית המאגר. שמירה על סטריליות לאורך כל הגדרת המעגל היא קריטית להצלחת הליך זה. לכן, יש לעקר את כל החלקים וללבוש כפפות סטריליות לאורך כל הדרך.

בנוסף לחלקים המורכבים, יש לעקר חלקים אלה. תא זרימה שלם אחד, שלושה על שני מקטעים של צינורות רכים, זכר אחד ונקבה אחת, מתאם פיתוי אחד בגודל שמונה אינץ', ארבעה ברגים שטוחים בגודל חצי אינץ', 6 5 16 אינץ', שמונה 30 שניות. עקבות אינץ' לאינץ', ברגים שטוחים, זוג פינצטה אחת, מגלשת זכוכית אחת ושתי מגבות מעוקרות באדים.

חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הנח את תא הזרימה של מעגל הזרימה ארבעה על ארבעה כיוונים לעצור בזה אחר זה, עצור את הזין ואת כל החלקים המעוקרים על השדה הסטרילי הזה. תוך כדי לבישת כפפות סטריליות, חבר את שני העצירה לארבעה כיוונים.

הנח מכסים על יציאות הדגימה הפתוחות. נתק את מתאמי הפיתוי הזכריים והנקביים המחברים את שני מקטעי הצינורות הרכים של מעגל הזרימה והכנס את העצירה המחוברים. חבר את הצינור הרך המוחדר למאגר למזרק של 30 מיליליטר והסר את בוכנת המזרק.

מלאו את הבקבוק ב -125 מיליליטר מדיום EPC. חבר מחדש את הצינור הרך לזין העצירה. הנח מסנן מזרק סטרילי לתוך פתח האוורור.

כעת העבירו את מעגל הזרימה לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. Clamp הצינור הקשיח לתוך ראש משאבת הגליל הגמיש הראשי המיועד לשימוש עם סוג זה של צינורות פחם פאלמר. ודא שהצינור אינו חופף לפסי ההרכבה של משאבת הגליל.

סמן את הצינור היכן הוא יוצא מראש המשאבה משני הצדדים בעזרת עט סימון. לאחר שווידאתם שכל העצירה סגור לכיוון יציאות הדגימה ונפתחים לאורך מעגל הזרימה, הפעל את המשאבה. ודא את כיוון הזרימה.

ה-PERFUSE 8 צריך לעבור ממאגר הזכוכית דרך הצינור הקשיח לתוך בולם הדופק. להרכבת תא זרימה, השתמש בכפפות סטריליות כדי לחבר קטע צינורות רך אחד בגודל שני אינץ' למתאם פיתוי נקבה בגודל שמונה אינץ'. חבר עוד קטע צינורות רכים בגודל שני אינץ' למתאם פיתוי זכר בגודל שמונה אינץ'.

חבר את הצינורות הרכים בגודל שני אינץ' עם מתאם פיתוי נקבה ליציאת הזרימה ואת הצינור הרך בגודל שני אינץ' עם מתאם פיתוי זכר ליציאת היציאה. חבר עצירה לארבעה כיוונים לשני מתאמי הפיתוי הללו. חבר את חתיכת הצינורות הרכה הנותרת בגודל שני אינץ' למחבר יציאת הצד היוצא ממלכודת הבועות וחבר זין עצירה חד כיווני באמצעות פינצטה סטרילית.

הסר את השקופית שנזרעה בתא מכלי תרבית התאים והנח אותה לתוך השקע בצלחת התחתונה של תא הזרימה. ודא שהמגלשה ממוקמת כשהצד היושב בתא פונה כלפי מעלה באמצעות מזרק או פיפטה, הנח 10 מיליליטר של מדיום EPC חם מעל המגלשה היושבת בתא. אפשר למדיום לכסות את המגלשה בתא הזרימה, אך אל תשפוך את המדיום מעל טבעת ה-O בצלחת התחתונה.

הנח את הצלחת העליונה של תא הזרימה על הצלחת התחתונה, יישר את חורי הברגים. שמור את שתי הלוחות מקבילים כדי לא להכניס בועות אוויר ללוחות הברגים של החדר. ביחד. באמצעות מברג אוטומטי המופעל על ידי סוללה הפעילו את מלכודת בועות הזרימה על ידי פתיחת זין העצירה החד-כיווני המחובר ליציאת מלכודת הבועות בצד הזרימה.

השתמש במזרק של 10 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות את צינור הזרימה עם מדיום EPC ולאחר מכן סגור את זין העצירה הזה וכסה אותו. כעת הוצא את תעלת החדר על ידי פתיחת זין העצירה הארבע-כיווני של יציאת הזרימה ושטיפה עדינה של מדיום EPC דרך תא הזרימה. שוב באמצעות מכסה מזרק של 10 מיליליטר כל חיבורי הזין לארבעה כיוונים וסגר אותם.

העבירו את תא הזרימה לחממה הלחה עם מעגל הזרימה המורכב. השהה את משאבת מעגל הזרימה סגור את מעגל הזרימה. עצור בכיוון הזרימה כדי למנוע דליפה.

חבר את תא הזרימה למעגל הזרימה לאחר חיבור תא הזרימה למעגל הזרימה, פתח את זני העצירה לכיוון הזרימה. המשך את משאבת הזרימה וודא שה-PERFUSE 8 זורם בכיוון הנכון. התאם את קצב הזרימה ללחץ המוחלט הרצוי.

במהלך ניסוי הזרימה, ניתן להסיר את תא הזרימה מהמעגל כדי לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור או פלורסנט. לשם כך, נתק את תא הזרימה ממעגל הזרימה בזין העצירה כדי לעצור את חיבורי הזין. כדי לאסוף שמונה דגימות לניתוח.

ראשית, השהה את המשאבה, סגור את זין העצירה הממוקם הכי קרוב לבולם הדופק. הסר את מכסה המגן שלו, והנח אותו הפוך כדי לוודא שהוא לא מזוהם. הכנס מזרק קטן לשקע הדגימה.

סגור את זין העצירה לכיוון תא הזרימה, תוך שמירה על יציאת הדגימה והמעגל בכיוון הדופק דamppener פתוח. משוך את כמות הדגימה הרצויה מהמעגל, סגור את תא העצירה לכיוון יציאת הדגימה לפני הסרת המזרק. אחסן את הדגימה השמונה השופעת בבקבוקון מסומן והקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס.

סכם את יציאת הדגימה וודא שכל פקקי העצירה פתוחים לפני תחילת הזרימה. בשיטה זו, ניתן לזרוע תאי אב אנדותל שמקורם בדם אנושי על שקופיות טיטניום תוך 15 דקות ולהיצמד לכוחות גזירה פיזיולוגיים. כפי שמוצג באיור זה, EPCs התפשטו בהשפעת זרימה מכ-210 מיקרון רבוע מיד לאחר הזריעה לכ-657 מיקרון רבוע לאחר שלוש שעות וכ-1,152 מיקרון רבוע לאחר 48 שעות של מתח גזירה נוזלי של 15 סעודות לסנטימטר מרובע.

תמונת מיקרוסקופ אור זו ממחישה את האוריינטציה האקראית של EPCs אנושיים. לאחר תקופת ישיבה סטטית של שש שעות לאחר שלוש שעות של זרימה ב-100 סעודות לסנטימטר מרובע, התאים התפשטו אך נשארו בכיוון אקראי. לאחר 48 שעות של מתח גזירה נוזלי ב-100 סעודות לסנטימטר מרובע, EPCs מיושרים ומכוונים לכיוון הזרימה.

כאן EPCs, סומנו עם CTO וגרעיני תאים צבועים בהרקס כדי למות לאחר הזרימה. לשם השוואה, תמונה זו מציגה EPCs חזיריים על שקופיות טיטניום ביישור עם כיוון הזרימה. לאחר 48 שעות של זרימה ו-15 סעודות לסנטימטר רבוע של חשיפה למתח גזירה, גבולות התאים נצבעו בצבע אנטי PCAM וגרעינים בצביעה של חומצת גרעין ציטוקסין.

שיטה זו מאפשרת גם להשיג דגימות של שמונה PERFUSE בנקודות זמן קבועות מראש לניתוח ו/או כימות של מטבוליטים של תאים מופרשים. מוצגת כאן דוגמה לייצור ניטריט במהלך ניסוי זרימה של 48 שעות עם EPCs חזיריים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על סטריליות לאורך כל הדרך.

בנוסף, חשוב לנקוט בצעדים הדרושים על מנת להפחית את מספר בועות האוויר בתא הזרימה לפני תחילת הזרימה הרציפה מכיוון שהן עלולות לקרוע את התאים. אנו ממליצים גם לבדוק כל חיבור בודד בתא הזרימה ובמעגל לפני השפע כדי למנוע דליפה של PERFUSE 8 במהלך ניסוי. תא זה מתוכנן עם טבעות O מובנות המאפשרות התנגדות מוחלטת של הלוחות העליונים והתחתונים ומספקות אטימה חסינת דליפות ללא צורך במשאבות ואקום.

תכונה זו גם מבטיחה גובה תא קבוע בין ניסויים ומבטלת את הצורך באטמי גומי או התאמות. תא הזרימה שלנו משתמש בשקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות. לכן, מספר רב של תאים זמינים לניסויים נוספים.

לדוגמה, ניתן להעריך RNA ו-DNA מתאים לאחר זרימה עבור סינתזת חלבון או ביטוי גנים. תכנון המעגל שלנו מאפשר איסוף של שמונה דגימות לניתוח וכימות של מטבוליטים של תאים כגון ניטריט, מטבוליט חמצוני ראשוני של תחמוצת החנקן, המופרש על ידי תאים תחת לחץ גזירה נוזלי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב את תא הזרימה ומעגל הזרימה הסטרילי שלנו כדי להכפיף את תאי ההיצמדות ללחץ גזירה נוזלי.