ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את הציפורן באלגנטיות ים חיה שקופה באמצעות עין צבע ליפופילית פלואורסצנטית אדומה. זה מושג על ידי הכנת אוכלוסייה של נמטודות לצביעה. לאחר מכן מתווספת עין צבע מדוללת לאוכלוסייה והם מורשים לדגור.

ואז בעלי החיים מתאוששים מתמיסת הצביעה. הדמיה פלואורסצנטית של הקוטיקולה המוכתמת בדאי מראה פרטים על פני השטח, כולל מבני הרבייה של העין של איילי ואן ומאפיינים מורפולוגיים חיצוניים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות להדמיית קוטיקולה באורגניזם שקוף זה כמו הדמיה ישירה, פלואורסצנטיות, ביטוי טרנסגנים, צביעת נוגדנים, מיקרוסקופ אלקטרונים ואגלוטינין נבט חיטה מסומן הוא שטכניקה זו קלה לביצוע מהירה וזולה יחסית, ומניבה רזולוציה יפה של מבנים קוטיקולריים בבעלי חיים חיים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים רבים המשתמשים במערכת מודל אלגנטיות הים והקוטיקולה שלה, כגון הפרשת תאים וארגון הקוטיקולה, התפתחות תאי אפידרמיס, מסלולי גנים כרוניים הטרו, חסינות מולדת, התפתחות תכונות מורפולוגיות ואבולוציה של נמטודות. מי שידגים את ההליך יהיה רובי שולץ, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. בעת עבודה עם D Eye, זכור שהוא רגיש לאור.

יש להגן תמיד על העין מפני אור על ידי עטיפתה בנייר כסף. ללבוש גם כפפות וחלוק מעבדה מכיוון ש-DMF רעיל ו-DAI היא מכונית. ציאניד דאי הוא חזק מאוד.

דילול עבודה בחוזק סטנדרטי הוא 30 מיקרוגרם למיליליטר של DII ב-M תשע, ואוכלוסייה בודדת דורשת רק 400 מיקרוליטר של דילול עבודה. התחל עם צלחת 60 מילימטר המאוכלסת בנמטודות לא מזוהמות. שוטפים את בעלי החיים מהצלחת ב -1.5 מיליליטר של 0.5% טריטון X 100.

במאגר M 9, סובבו בעדינות את הנוזל בתנועות סיבוביות כדי לשחרר את כל הזחלים ובעלי החיים הבוגרים, ולאחר מכן העבירו את הכביסה לצינור של 1.5 מיליליטר. סובב מיד את החיות ב-2000 RRP M למשך 30 שניות כדי לאסוף בעלי חיים בתחתית הצינור. השליכו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לבעלי החיים.

היזהר, לא חמדן. שטפו בעלי חיים עם מיליליטר אחד של M תשע. סובב והסר את הסופרנטנט.

חזור על הכביסה. סובב שוב והסר את הסופרנטנט. הבא ב -400 מיקרוליטר של 30 מיקרוגרם למיליליטר של דאי ב- M תשע לצינור.

מערבל את הצינור לזמן קצר כדי להשעות מחדש את החיות. לאחר מכן נער את הצינור ב-20 מעלות צלזיוס במצב אופקי למשך שלוש עד 16 שעות ב-350 סל"ד בסביבה מוגנת באור. העיתוי של הצעדים האחרונים הוא חשוב.

ראשית, יש לשטוף את הטריטון X לפני שהוא מסיר את השומנים שהדאי קושר. שנית, יש לצבוע את בעלי החיים בתמיסת עיניים צבעונית מספיק זמן כדי לאפשר לציפורן להיות מוכתמת באופן אחיד. מעט מאוחר יותר, יש לאפשר לבעלי החיים להתאושש על מזון מספיק זמן כדי להסיר עין לא קשורה.

בתום הצביעה, סובבו את בעלי החיים והסירו את תמיסת הצבע. שוטפים את החיות עם מיליליטר אחד של M תשע. כדי להסיר צבע לא קשור, סובב את החיות והסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש את החיות ב-400 מיקרוליטר של מאגר M nine ושפכו אותם על חלק נטול חיידקים של מיקרו-צלחת NGM. זרעים עם OP 50 E Coli מאפשרים לבעלי חיים להתאושש בחושך למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר מיממה מכיוון שהפלואורסצנטיות של הצבע דועכת במהלך זמן ההחלמה. על בעלי החיים לזחול הרחק מנוזל הצבע אל המזון.

קל יותר לצלם את בעלי החיים האלה מכיוון שיש להם פחות פלואורסצנטיות ברקע מעין צבע חופשית. התחל בהכנת כרית חקלאית על שקופית כדי להבטיח עובי אחיד של כרית החקלאות המשמשת. שני מרווחים.

מרווח נוצר על ידי שכבות של שתי חתיכות סרט מעבדה על מגלשת זכוכית. ניתן להשתמש במרווחים ללא הגבלת זמן. לאחר מכן, מסדרים מגלשת זכוכית נקייה לאורכה בין שתי מגלשות מרווח, פיפטה כ -150 מיקרוליטר אגר מותך.

אל מרכז מגלשת הזכוכית הנקייה. כסו במהירות את ה-AER המותך עם מגלשה נוספת הממוקמת בניצב מעל ה-AER ושני המרווחים ליצירת כרית אגר. החלק בזהירות את מגלשת הכיסוי, תוך שמירה על הרפידה מרוכזת בחלק העליון של מגלשת ההרכבה.

כעת פיפטה חמישה מיקרוליטרים של חומר הרדמה נמטודה על הרפידה הרכיבו שמונה עד 12 בעלי חיים בחומר ההרדמה וכסו בעדינות עם כיסוי מיקרוסקופ. התבונן בבעלי החיים באמצעות מיקרוסקופ מורכב או קונפוקלי המצויד במטרה של פי 40 לפחות ומסנן טריסי או מסנן תואם אחר. עירור הפלואורסצנטי המקסימלי של עין הצבע הוא 549 ננומטר ומקסימום הפליטה שלו הוא 565 ננומטר.

עבור הדמיה קשורה היא החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה. אנו מראים כיצד להרכיב בעלי חיים להדמיה, אך עליך להיות מאומן כראוי על המתחם או הטווח הקונפוקלי שבו תשתמש. מצאנו ששימוש במטרה עם הגדלה של פי 60 לפחות הוא הטוב ביותר כדי לפתור את הפרטים המוארים בשיטת הצביעה.

כל אחת מהתמונות בחלק זה צולמה באמצעות אובייקט פי 63 באלגנטיות חותם עוברי של פוסטר. פני השטח של הקוטיקולה מכילים מדי שנה תלמים היקפיים ובשלבים מסוימים רכסים אורכיים הנקראים איילי. כל אחת מהתמונות בחלק זה צולמה עם מטרה של פי 63 באלגנטיות C פוסט-עוברית.

פני השטח של הקוטיקולה מכילים חד-שנתיים המופרדים על ידי תלמים היקפיים ובשלבים מסוימים רכסים אורכיים הנקראים אלי. לכל שלב התפתחותי יש מבני קוטיקולה עם קומפוזיציות ודפוסים מובחנים, רכסים או תלמים של אלי ואלי פלואורסצנטי. תלוי בהרכב פני השטח.

לאורך כל שלבי הזחל והבוגרים בשיטת עמידת צבע זו, הם נשארים גלויים עד יום לאחר ההחלמה. כתמים פלואורסצנטיים ברקע נצפים לפעמים אך לא באופן שגרתי. זוהי הקוטיקולה של בעלי חיים מוטנטיים בוגרים המציגים פגמים בינוניים בארגון הציפורן.

רכסי איילי הם לא רציפים וסופר-מספריים. רכסי איילי מאוחים ומסועפים או מפוצלים, סמן טרנסגני נפוץ. אלל דומיננטי של גליל שש גורם לפיתול של הציפורן, שניתן לראות באיילי ויכול לגרום לעיצוב לא סדיר של הטבעות.

דאי גם מכתים מבני ציפורן חיצוניים אחרים כולל הרמפרודיטה בוגרת, פות והרמת זנב זכר בוגר ופאן דאי יכול גם להדגיש פגמים עדינים במורפולוגיה חיצונית כמו זנב מזלג זה, צביעה לא מספקת. לדוגמה, צביעה של שעתיים מובילה לצביעה ציפורנית חלקה, אם כי נוירונים חשופים לסביבה עלולים להכתים לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע שעות, לא כולל הדמיה אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכתים אלגנטיות ים בעין למות לצורך התבוננות בציפורן ובמבנים מורפולוגיים חיצוניים אחרים.