סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

הליך זה משתמש במערכת תרבית תאים תלת מימדית כדי לחקות קינטיקה של תאים in vivo. התחל בדגירת תאים עם חרוזים מצופים קולגן ENC. לאחר מכן טען את התאים והחרוזים למערכת תרבית תאים מסתובבת והפיץ אגרגטים של תאים תלת מימדיים בסביבת גזירה נמוכה ומערבולות נמוכות.

לבסוף, קצרו את התאים לשימוש ביישומים במורד הזרם בהשוואה לביטוי גנים והתמיינות תאית של תאים הגדלים בשכבה חד-שכבתית טיפוסית. התרביות התלת-ממדיות המתקבלות מדגימות קינטיקה והתנהגות של תאים הדומים מאוד לסצנה זו. in vivo.

השתמשנו ב-RCCS כדי להנדס מודלים תלת-ממדיים בעלי משמעות ביולוגית של רקמות אפיתל אנושיות שונות. ד"ר ג'סיקה וורנר, סטודנטית לשעבר לתואר שני במעבדה של ד"ר סידני מוריס, תדגים כעת את ההליך הזה עם תאי EVT בחיטוי צינור חרוטי של 50 מיליליטר 250 מיליגרם של נשאים מיקרו cyto dex שלושה חרוזים ב-12 מיליליטר. DPBS מאפשרים לחרוזים המוכנים להתנפח ולהתקרר לטמפרטורת החדר.

ואז בתנאים סטריליים, הביאו את הנפח הכולל ל -12.5 מיליליטר. באמצעות DPBS קוצרים כעת תרבית משולבת של 80% של תאי טרופובלסטים נוספים. בעזרת עיכול טריפסין מערבבים בעדינות את שלושת החרוזים המוכנים של ציטו דקס ובעזרת קצה רחב פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר מעבירים 2.5 מיליליטר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר ה-cyto dex שלושה חרוזים התיישבו בתחתית הצינור. פיפטה מהשכבה העליונה של DPBS מבלי להפריע לשלושת החרוזים של cyto Dex. מערבבים את תאי ה-EVT עם שלושת החרוזים cyto Dex.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם ערבוב תקופתי, ולאחר מכן 30 דקות בחממת תרבית תאים עם ערבוב מדי פעם. הנח RCCS של 10 מיליליטר לצלחת תרבית סטרילית של שש בארות והסר את הפקק הגדול. כעת הוסף שתי מדיות GTSF מחוממות כדי להביא את הנפח הכולל של תערובת חרוזי התא ל-10 מיליליטר ולטעון לתוך ה-RCCS דרך היציאה הגדולה.

החלף את פקק היציאה הגדול וסגור יציאות קטנות. העמדה הבאה, רוקן שלושה מזרקים של מיליליטר על שתי היציאות הקטנות. הוסף מדיה לכל מזרק.

פתח לאט את שני השסתומים והחלף את בוכנות המזרק. הוסף בעדינות מדיה ממזרק אחד עד שכל בועות האוויר יוצאות מהתא הפנימי. הרם את ה-RCCS והקש בעדינות על הצד תוך כדי סיבובו כדי לבדוק אם יש בועות.

הסר את הבועות הנותרות על-ידי סיבוב ה- RCCS עד שהבועות נמצאות מתחת ליציאה הקטנה. לאחר מכן דחף בעדינות כלפי מטה את המזרק בצד הנגדי כדי לאלץ את הבועות להיכנס לפתח ולצאת מהתא. המשך לסגור יציאה צדדית אחת, דחוף בעדינות כלפי מטה את בוכנת המזרק השנייה כדי להכניס כמות קטנה של לחץ חיובי לתוך הכלי ולסגור את השסתום השני תוך הפעלת לחץ.

לבסוף טען את ה-RCCS על הרוטור. התחל את הסיבוב ב-19 סל"ד בחממת תרבית תאים לתנאי תרבית אופטימליים. מלאו את מלאי התקשורת כל יומיים בשלושת הימים הראשונים ומדי יום לאחר מכן.

ראשית כבה את הרוטור והסר את ה- RCCS. משוך את הבוכנות כלפי מעלה כדי ליצור יניקה מסוימת. הסר את המזרקים מכל יציאה קטנה והנח את ה-RCCS בזווית ואפשר לחרוזים להתיישב מול היציאה הגדולה.

כעת, פתח את אחד השסתומים הקטנים כדי לשחרר שני שליש מהמדיה מה-RCCS למיכל פסולת מבלי להפריע לחרוזים. סגור את השסתום הקטן ולאחר מכן פתח את היציאה הגדולה. הוסף מדיה ל-RCCS והחלף את הפקק, הוצא את כל בועות האוויר כפי שהוצג קודם לכן, ומקם את התרבית על המסובב בחממה.

ברגע שהאגרגטים מתחילים לגדול, הגדילו באופן ניכר את מהירות הסיבוב כדי להבטיח שהתאים יישארו בתרחיף. לקצור את התאים. שחרר את ה-RCCS מהרוטור.

השליכו את המזרקים מכל יציאה קטנה, והניחו את ה-RCCS בזווית כדי לכוון את החרוזים אל מול היציאה הגדולה. לאחר שכל החרוזים התייצבו, פתח את אחד השסתומים הקטנים ונקז שליש מהמדיה למיכל פסולת. סגור את השסתום הקטן ופתח את היציאה הגדולה.

סובב בעדינות את הכלי כדי לפזר את האגרגטים בחזרה לתמיסה ולהעביר את התאים לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר שאפשרתם לאגרגטים שנאספו להתיישב בצינור החרוטי, השתמשו בסופרנטנט כדי לשטוף היטב את כלי התרבות שוב כדי למקסם את התאוששות האגרגטים. באמצעות קצה פיפטה רחב קידוח מייד ציטוט אגרגטים לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם.

קו התאים S-G-H-P-L הוא דוגמה אחת לטרופובלסטים נוספים דמויי תאים. באגרגט טיפוסי שגדל ב-RCCS ב-cyto X שלוש, חרוזים רבים מכוסים לחלוטין בתאים מתפשטים. שימו לב להקרנות המשתרעות הרחק מהצביר הראשי ומתחברות לצבירים שכנים.

לאחר שהוסר מה-RCCS ומצופה על מטריצה חוץ-תאית, תאים שגדלו בתלת מימד פולשים באגרסיביות או נודדים. ואכן, נתוני R-T-P-C-R מאשרים את הביטוי המוגבר של MMPs הנראים באגרגטים תלת מימדיים בניגוד לחד-שכבות מסורתיות של תרביות תאים. מעניין שגנים שאינם קשורים לפלישה מווסתים גם הם ב-RCCS.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד להשתמש ב-RCCS עם תאים ראשוניים של קו התאים שלך או אפילו תאי גזע כדי להשיג תרביות תאים תלת מימדיות המחקות יותר קינטיקה של תאים in vivo.