Name: סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: למדו שיטת סיבוב תרבית תאים תלת-ממדית לחקירת התמיינות תאי טרופובלסט אנושיים. מערכת RCCS מחקה תנאים פיזיולוגיים ומאפשרת ביטוי משופר של סמני התמיינות בהשוואה לתרביות דו-ממדיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני הלאומי לבריאות NIH מענק / NICHD # HD051998 (עד רמ&quot;א).

1. קולגן הכנה ביד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני EVTs טעינת לתרבות 3-D התא, צריך להכין את Cytodex-3 חרוזים microcarrier: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקלי את הכמות המתאימה של Cytodex-3 חרוזים הנדרש לצורך הניסוי. פרוטוקול זה מותאם עבור כלי 10ml RCCS, שבו 0.05g חרוזים נדרשים. עבור כלי RCCS 50 מ"ל, בקנה מידה בהתאם. בתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי autoclavable, לערבב 250 מ"ג Cytodex-3 חרוזים עם פוספט Dulbecco 12mL שנאגרו פתרון (DPBS). סכום זה מספיק עבור 5 כלי RCCS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא נפח הולם קיים צינור חרוטי, שכן תהליך החיטוי תגרום אידוי. Loosely כובע צינור החיטוי של 10 דקות ב 110 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור חרוטי בסיום המחזור החיטוי ולאפשר פתרון Cytodex-3 חרוז להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי צינור חרוטי מתקרר לטמפרטורת החדר, השתמש בטכניקה סטרילית להביא את הנפח הכולל ל 12.5mL באמצעות 1X העקוריםBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי ולאחסן את מוכנה Cytodex-3 חרוזים בטמפרטורת החדר. אפשר להכין חרוזים להתנפח להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. ההכנה של מעל Cytodex-3 חרוזים יספק במשך חמש ספינות 10ml RCCS. ראינו כי אחסון ממושך Cytodex-3 חרוזים בטמפרטורת החדר תגרום הביצועים יפגעו, כמו קולגן יערער לאחר כחודש אחד. Cytodex-3 חרוזים טווח בגודל 133-215 מיקרומטר. </li></ol> 2. מדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של RCCS אופטימיזציה GTSF-2 המדיה (מותאם מ 22), אשר מורכב של 40% ממ אלפא, בתוספת תוספי מזון ו -60% L-15 של התקשורת ליבוביץ (מותאם מ - 22). ראשית, להכין 400mL בנפח כולל של ממ אלפא בתוספת: סודיום ביקרבונט 21.2mM 0.06% Peptone 0.7mM פרוקטוז 1.4mM גלקטוז 5.6mM גלוקוז 1% HEPES 1% L-גלוטמין 0.5% ITS 10% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון מלאי של ITS, מתמוססים 5 מ"ל סטרילי acidified H 2 O שהוכן על ידי תוספת של חומצה אצטית קרחונית (כ 0.05mL). מערבולת לפזר, פעל עם מים סטריליים 45mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספיק לשקול את L-15 אבקה של ליבוביץ עבור 600ml של המדיום על ידי המסת ברקמות תרבות כיתה H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את הנפח הכולל של המדיום תרבות התא 1 ליטר עם בינוני L-15 של ליבוביץ. מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C בחושך. הוסף 1% פניצילין, סטרפטומיצין בנפרד aliquot כל אחד בינוני בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבים בתקשורת ניסוחים אחרים מאשר GTSF-2 התקשורת נבדקו בהצלחה RCCS. מעבדות הפרט להחליט עבור עצמם מה המדיום הוא אופטימלי עבור הניסוי מתבצע. </li></ol> 3. תאים דגירה ביד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את EVTs ל ~ 80% confluency, trypsinize ולספור באמצעות מקובל בתרבות פרקטיקות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות 1x10 6 EVTs ב 4mL של חםעורך אמצעי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות מוכן Cytodex-3 חרוזים. באמצעות שימוש בטכניקות סטריליות, להסיר 2.5mL חרוזים מוכן באמצעות קצה רחב, 10 מ"ל פיפטה סרולוגיות ולהעביר צינור בשימוש חרוטי 15 מ"ל. שים לב כי ייתכן שיש איבוד קטן של חרוזים כמו שהם מייחסים פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר-3 Cytodex חרוזים להתיישב על החלק התחתון של הצינור. אחרי שקיעה, השתמש pipettor כדי להסיר את השכבה העליונה של DPBS מבלי להפריע Cytodex-3 חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את 1x10 6 EVTs מוכן בתקשורת עם Cytodex-3 חרוזים מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת תאים חרוז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מדי פעם מערבבים בעדינות. דגירה של 30 דקות נוסף ב 37 ° C ו 5% CO 2. מדי פעם מערבבים בעדינות. </li></ol> 4. טעינת RWV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון זרימה למינרית, להסיר RCCS 10 מ"ל מן האריזה ולמקם אותו בצלחת סטרילית 6-היטב, התרבות ליציבות. עיין באיור 1 עבור תרשים שכותרתו של RCCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פקק גדול מהנמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את הנפח הכולל של התערובת התא חרוז דוגרים על 10 מ"ל עם התקשורת חיממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תא / תערובת חרוז לתוך RCCS דרך נמל גדול. RCCS צריכה להיות מוטה ב -45 מעלות זווית (עד נמל גדול) בעת טעינת לסייע סילוק בועות אוויר פוטנציאליים. למנוע הצטברות של לחץ חיובי על ידי מילוי הכלי לאט ובהתמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפקק בנמל גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את הבוכנות מן 3-mL מזרקים במקום מזרקים ריקים על היציאות קטן. הוסף 1-3mL של התקשורת מזרק אחד. לאט לאט לפתוח את שני שסתומים. החלפת בוכנות מזרק על מזרקים בעדינות. הוסף מדיה מזרק אחד עד שכל הבועות יוסרו מן החדר הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את RCCS ו לטפוח בעדינות את הצד תוך סיבובו מולך כדי לבדוק בועות. אם יש בועות כל, אתה חייב להוציא אותם לתא, כמו בועות אוויר יפריע היווצרות oו אגרגטים התא להציג כוחות גזירה. הסר בועות על ידי החלפה של RCCS עד הבועות נמצאים תחת נמל קטן. ואז בעדינות על המזרק בצד הנגדי לכוח בועות ליציאת ומחוץ לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור מיציאה אחת בצד. דחף בעדינות על הבוכנה במזרק אחרים להציג כמות קטנה של לחץ חיובי לתוך כלי השיט, אשר מונע בועות מ טביעה. סגור שסתום השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את RCCS על הרוטור. התחל את הסיבוב על 19rpm ב 37 ° C-CO 2 באינקובטור. </li></ol> 5. שינוי מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת בכל יום אחר במשך שלושת הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הרוטור ולהסיר את RCCS. משוך את הבוכנות עד ליצור כמה יניקה, להסיר את כל מזרקים מנמל קטן והמקום RCCS בזווית כך החרוזים להתיישב מול הנמל הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי החרוזים התיישבו כל, לפתוח את אחד השסתומים קטניםלאפשר התקשורת לזרום מתוך RCCS לתוך מיכל פסולת. הסרה של 2 / 3 של התקשורת בדרך זו. הקפידו לא להפריע חרוזים לא לבטל כל אגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את שסתום קטן ולפתוח את נמל גדול. הוסף מדיה בחזרה RCCS דרך נמל גדול. החלף את הפקק בנמל גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.6-4.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו אגרגטים הגידול בגודל, אתה צריך להגדיל את מהירות הסיבוב כדי לשמור אותם ההשעיה בכל עת, באופן אידיאלי דפוס הדם קטן במהירות האופטימלית. בדרך כלל, להגדיל את המהירות בין 0.3-0.7 סל"ד לאחר כל האכלה פעם אגרגטים מתחילים לגדול בעליל. </li></ol> 6. איסוף מופצות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את RCCS של הרוטור. הסר את כל מזרקים מנמל קטן והמקום RCCS בזווית כך חרוזים עשויים להתיישב מול הנמל הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי החרוזים התיישבו כל, לפתוח את אחד השסתומים קטן ולאפשר התקשורת לזרום החוצהשל RCCS לתוך מיכל פסולת. הסר את 1 / 3 של התקשורת בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את שסתום קטן ולפתוח את נמל גדול. בעדינות מערבולת כלי לפזר את אגרגטים בחזרה פתרון. תערובת נוזלית רוקן לתוך שפופרת 50 מ"ל סטרילי חרוטי. אפשר המצרפים שנאספו להתיישב צינור חרוטי לפני השימוש supernatant ביסודיות לשטוף את כלי התרבות על מנת למקסם את ההתאוששות של אגרגטים. אגרגטים עשוי לשמש מבחני במורד מיד, כגון cytometry זרימה, מבחני הפלישה, immunofluorescence ואחרים. </li></ol> 7. נציג תוצאות דוגמה evt דמויי תאים (SGHPL-4 תא קו trophoblast) גדל ב RCCS על Cytodex-3 חרוזים מוצג באיור 2. השורה evt דמוי תא מציג תחזיות הארכת הרחק באשכול הראשי הצמדת אשכולות השכנות. רבים החרוזים מכוסים לחלוטין עם תאים ומתפשטים. הוסר לאחר מן RCCS ו PLAטד על מטריצה ​​תאית, evt כמו 3-D בתאי צמח באגרסיביות לפלוש ו / או להעביר (איור 3). RT-PCR נתונים מאשר ביטוי מוגבר של MMPs לראות 3-D אגרגטים בניגוד לתרבות המסורתית monolayers התא (איור 4). מעניין, לא גנים הקשורים הפלישה הם שהוגברו גם RCCS (לוח 1) עשויים לסייע המגדירה בתחומים כגון אינטראקציות עם מערכת החיסון פולשים לתאים trophoblasts. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תיאור קריקטורה של מערכת סיבוב Cell תרבות (RCCS). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. בניגוד שלב מיקרוסקופ המצרפי של נציג לאחר צמיחה של 5 ימים RCCS. החצים מצביעים על התאים הפולשים * מציין את Cytodex-3 חרוזים microcarrier. <imgalt src='"/' files></imgalt> באיור 3. אגרגטים RCCS מבוגרים היו משובצים ג'לים הפיברין. הפלישה באמצעות הג'ל הפיברין נצפתה מוקדם ככל הטבעה (א) שלאחר הפיברין 24 שעות (ב ') נמשכו עד 48 שעות. החצים מצביעים על התאים הפולשים * מציין את Cytodex-3 חרוזים microcarrier (עיבוד, באישור, מתוך המשחק. 7). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Zymogram ג'לטין השוואתי של monolayer ו RCCS מופצות SGHPL-4 evt דמויי תאים. צורות Pro-ופעיל של MMP-2 ו - MMP-9 היו מופרשים על ידי התאים RCCS trophoblast גדל (עיבוד, באישור, מתוך המשחק. 7). <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. סיכום תוצאות מ microarray SGHPL-4 התאים הגדלים RCCS (עיבוד, באישור, מתוך המשחק. 7). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li monlayer><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מציין גנים שהיו מתחת לגבול של גילוי monolayers. </li></ol>

<ol><li>Knofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).</li>
<li>Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+at+the+maternal-fetal+interface%3A+relevance+to+human+pregnancy+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.</a> Reproduction. 140, 803-803 (2010).</li>
<li>Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Gabor+Than+Award+lecture%3A+Transformation+of+the+spiral+arteries+in+human+pregnancy%3A+key+events+in+the+remodelling+timeline%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline.</a> Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).</li>
<li>Whitley, G. S., Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast-mediated+spiral+artery+remodelling%3A+a+role+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis.</a> J. Anat. 215, 21-21 (2009).</li>
<li>Apps, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32, 33-33 (2011).</li>
<li>Bilban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+invasion%3A+assessment+of+cellular+models+using+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures.</a> Placenta. 31, 989-989 (2010).</li>
<li>LaMarca, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+growth+of+extravillous+cytotrophoblasts+promotes+differentiation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion.</a> Placenta. 26, 709-709 (2005).</li>
<li>Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-8+%28CXCL8%29+stimulates+trophoblast+cell+migration+and+invasion+by+increasing+levels+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%292+and+MMP9+and+integrins+alpha5+and+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1.</a> Reproduction. 139, 789-789 (2010).</li>
<li>Husslein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+regulation+and+functional+characterization+of+matrix+metalloproteinase-3+of+human+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast.</a> Placenta. 30, 284-284 (2009).</li>
<li>Barrila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+3D+cell+culture+models%3A+using+the+rotating+wall+vessel+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).</li>
<li>Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+tissues+in+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Growing tissues in microgravity.</a> Nat. Med. 4, 901-901 (1998).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).</li>
<li>Bentrup, H. önerzu, K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).</li>
<li>Myers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+phenotypic+gap+between+transformed+neuronal+cell+lines+in+culture+and+untransformed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).</li>
<li>Straub, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+infectivity+assay+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).</li>
<li>Nickerson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol. J. 6, 103-103 (2009).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbooks%22">Handbooks</a>. , Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks">http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks</a> (2005).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

הטכניקה המוצגת כאן תרבות מספק החוקרים עם evt דמויי תאים פולשני מאוד. זה עתה הכיר בכך הפסד של בידול מתרחשת monolayers בשל עיכוב של תגובות כימיות הסלולר אותות מולקולריים בשלושה ממדים (משטחים התא apical, הבסיסיים, לרוחב) 10,13. טכניקה זו משקפת מאפיינים ציין ברחם על הפולשים לתאים evt. כפי הנוהל המקובל מחקה רקמה monolayer תרבות קינטיקה הזמן, אבל מספק תאים עם ביטוי דיפרנציאלי, מבחני השוואה יכולים להיות מועסקים. צבירי תאים ניתן לקצור לשימוש בניסויים בכל עת. הם עשויים ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Cytodex microcarrier חרוזים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> סיבוב תרבית תאים מערכת (RCCS) </td><td> Synthecon </td><td> RCCS-D </td><td> כולל בסיס הרוטור, אספקת החשמל, 4 יחידות RCCS הפנויה </td></tr><tr><td> RCCS יחידות פנויה </td><td> Synthecon </td><td> צור Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer-Lock קצה המזרק </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל רחב טיפ סרולוגיות פיפטה </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> ממ אלפא </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 של ליבוביץ בינוני, אבקת </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, רעלן פנימי חינם </td><td> דיג </td><td> MT-25-055-CM </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> פרוקטוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> גלקטוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> אינסולין transferrin-Sodium סלניום (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים trophoblast האדם כמודל

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

תחום המחקר trophoblast אדם מסייע בהבנת סביבה מורכבת הוקמה במהלך placentation. בשל אופיו של מחקרים אלה, האדם ניסויים vivo הוא בלתי אפשרי. שילוב של תרבויות העיקרי, תרבויות explant ואת שורות תאים trophoblast 1 תמיכה הבנתנו הפלישה של קיר הרחם 2 שיפוץ של עורקי הרחם ספירלה 3,4 על ידי תאים trophoblast extravillous (EVTs), אשר נדרש להקמת מוצלח של ההריון. למרות עושר של ידע שלוקטו מודלים כאלה, מקובל כי בתרבות במבחנה מודלים התא באמצעות evt כמו שורות תאים להציג שינו תכונות הסלולר בהשוואה 5,6 ב עמיתיהם vivo שלהם. תאים בתרבית תאים של מערכת מסתובבת תרבות (RCCS) ולהציג מאפיינים מורפולוגיים, פנוטיפי, ופונקציונלי של evt כמו שורות תאים אשר באופן הדוק יותר לחקות הבחנה ב uטרו EVTs, עם ביטוי מוגבר של גנים המתווך הפלישה (למשל metalloproteinases מטריצה ​​(MMPs)) והבחנה trophoblast 7,8,9. ג&#39;ורג&#39; הקדוש תא החולים שליה קו-4 (SGHPL-4) (תרם בעין יפה על ידי ד&quot;ר גיא ויטלי וד&quot;ר יהודית קרטרייט) הוא קו evt דמוי תא ששימש לבדיקות ב RCCS. העיצוב של כלי השיט תרבות RCCS מבוסס על העיקרון כי איברים ורקמות לתפקד בסביבה (3-D) תלת מימדי. בשל תנאי התרבות דינמי הספינה, כולל תנאי גזירה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, התאים גדלו בשלושה ממדים בצורת אגרגטים מבוסס על זיקות הסלולר טבעי להתמיין לרקמות כמו אסיפות organotypic 10,11,12. תחזוקה של מסלול נוזל מספק נמוכה גזירה, מערבולת נמוכה בסביבה דומה לתנאים מצאו in vivo. שקיעה של תאים בתרבית הוא השיב על ידי התאמת סיבובמהירות RCCS כדי להבטיח נפילה חופשית מתמדת של תאים. גז חילופי מתרחשת דרך קרום חדיר הידרופובי הממוקם בצד האחורי של bioreactor. כמו ההורים שלהם רקמות in vivo, RCCS מבוגר תאים מסוגלים להגיב כימית והדרגות מולקולרית בשלושה ממדים (כלומר על משטחים apical, הבסיסיים, שלהם לרוחב) כי הם תרבותי על פני השטח של חרוזים microcarrier נקבובי. כאשר גדל כמו דו מימדי monolayers על משטחים בלתי חדיר כמו פלסטיק, תאים נשללת של תקשורת חשוב זה על פני השטח הבסיסי שלהם. כתוצאה מכך, המגבלות שהוטלו על ידי מרחבית בסביבה מאוד להשפיע על האופן שבו תאים תחושת אותות לפענח מתוך microenvironment שמסביב, ובכך רומז תפקיד חשוב עבור המילייה 3-D 13. השתמשנו RCCS מהנדס משמעות ביולוגית 3-D מודלים שונים של רקמות אפיתל האנושי 7,14,15,16. ואכן, דוחות קודמים רבים demonstrated כי תאים בתרבית RCCS יכול להניח פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה לא היה אפשרי עם דגמים אחרים 10,17-21. לסיכום, תרבות RCCS מייצגת קל, לשחזור, תפוקה גבוהה פלטפורמה המספקת כמויות גדולות של תאים מובחנים זה ניתנים מגוון רחב של מניפולציות ניסיוני. בפרוטוקול הבא, באמצעות EVTs כדוגמה, אנו בבירור לתאר את הצעדים הנדרשים כדי בתלת ממד תאים תרבות חסיד ב RCCS.

מסורתית, שני ממדי התרבות טכניקות תא לעיתים לגרום מאפיינים שינו לגבי סמנים בידול, ציטוקינים וגורמי גדילה. תלת ממדי התרבות תאים במערכת מסתובבת תרבית תאים (RCCS) reestablishes הביטוי של רבים מהגורמים הללו כפי שמוצג כאן עם קו trophoblast extravillous התא.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

תחום המחקר של הטרופובלסט האנושי מסייע בהבנת הסביבה המורכבת הנוצרת במהלך השילייה. בשל אופיים של אלו...

נוהל זה עושה שימוש במערכת תרבית תאים תלת-ממדית כדי לחקות קינטיקה של תאים in vivo. התחילו בהדגרה של תאים עם חרוזיים מצופים ב-collagen ENC. לאחר מכן, העבירו את התאים והחרוזיים למערכת תרבית תאים מסתובבת והנחיתו פגיש תאי תלת-ממדיים בסביבה בעלת כ forces גזירה נמוךה וטורבולנציה נמוכה.לבסוף, קצור את התאים לשימוש ביישומים המשכיים להשוואת ביטוי גנים ודיפרנציאציה תאית של תאים שגודלו בשכבה אחת (monolayer) טיפוסית. תרביות התלת-ממד שהתקבלו מדגימות קינטיקה והתנהגות תאית הדומות מאוד למצב In vivo.השתמשנו ב-RCCS כדי להנדס מודלים תלת-ממדיים בעלי משמעות ביולוגית של רקמות אפיתליאליות אנושיות שונות. ד"ר ג'סיקה וורנר, סטודנטית לשלב השני לשעבר במעבדתו של שותפי למחקר, ד"ר סידני מוריס, תדגים כעת הליך זה באמצעות תאי EVT. בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter, עקרו באוטוקלאב 250 milligrams של מיקרו-נשאי חרוזי cyto dex three ב-12 milliliters של DPBS. אפשרו לחרוזים שהוכנו להתנפח ולהתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, תחת תנאים סטריליים, הגדילו את הנפח הכולל ל-12.5 milliliters. השתמשו ב-DPBS כדי לאסוף תרבית של תאי extra villus trophoblast שהגיעה ל-80% confluent. באמצעות עיכול בטריפסין, ערבבו בעדינות את חרוזי ה-cyto dex three שהוכנו, ובעזרת פיפט סרולוגי של 10 milliliters עם טיפ רחב, העבירו 2.5 milliliters למבחנה קונית של 15 milliliters.לאחר שהחרוזיקים מסוג cyto dex three שקעו לתחתית המבחנה, שאבו את השכבה העליונה של DPBS מבלי להפריע לחרוזיקי ה-cyto Dex three. ערבבו את תאי ה-EVT עם חרוזיקי ה-cyto Dex three.הדגרירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם ערבוב תקופתי, ולאחר מכן למשך 30 דקות באינקובטור לתרביות תאים עם ערבוב מדי פעם. העבירו RCCS בנפח של 10 מיליליטר לתוך פלטת תרבית סטרילית בעלת שישה בארות והסירו את הפקק הגדול. כעת הוסיפו מדיום GTSF two מחומם כדי להביא את הנפח הכולל של תערובת חרוזי התאים ל-10 מיליליטר, וטענו לתוך ה-RCCS דרך הפתח הגדול.החליפו את פקק הפתח הגדול וסגרו את הפתחים הקטנים. בשלב הבא, רוקנו מזרקים של 3 mL אל שני הפתחים הקטנים. הוסיפו מצע לכל מזרק.פתחו לאט את שני השסתומים והחזירו את בוכנות המזרקים. הוסיפו בעדינות מצע גידול ממזרק אחד עד שכל בועות האוויר יסוכלו מהתא הפנימי. הרימו את ה-RCCS והקישו בעדינות על הדופן תוך כדי סיבוב כדי לבדוק אם קיימות בועות.הסר בועות שנותרו על ידי סיבוב ה-RCCS עד שהבועות נמצאות תחת הפתח הקטן. לאחר מכן, לחץ בעדינות על המזרק שבצד הנגדי כדי לדחוק את הבועות אל תוך הפתח ומחוץ לתא. המשך לסגור פתח אחד, לחץ בעדינות על בוכנת המזרק השנייה כדי להחדיר כמות קטנה של לחץ חיובי לכלי, וסגור את השסתום השני תוך כדי הפעלת הלחץ.לבסוף, העמיסו את ה-RCCS על הרוטור. התחילו את הסיבוב במהירות של 19 RPM בתוך אינקובטור לתרביות תאים כדי להבטיח תנאי תרבית אופטימליים. חדשו את המצע בכל יום שני במהלך שלושת הימים הראשונים, ולאחר מכן מדי יום.ראשית, כבה את הרוטור והסר את ה-RCCS. משוך את הבוכנות כלפי מעלה כדי ליצור ואקום. הסר את המזרקים מכל פתח קטן, הנח את ה-RCCS בזווית ואפשר לחרוצים לשקוע בכיוון הנגדי לפתח הגדול.כעת, פתחו את אחד השסתומים הקטנים כדי לרוקן שני שלישים מהמדיום מה-RCCS אל תוך מיכל פסולת, מבלי להסיע את החרוזים. סגרו את השסתום הקטן, ולאחר מכן פתחו את הפתח הגדול. הוסיפו מדיום ל-RCCS והחזירו את הפקק, הוציאו את כל בועות האוויר כפי שהודגם קודם לכן, והניחו את התרבית על הרוטטור בתוך האינקובטור.ברגע שהאגרגטים מתחילים לגדול, הגבירו באופן נראה את מהירות הסיבוב כדי להבטיח שהתאים יישארו בסוספנזיה. כדי לקצור את התאים, שחררו את ה-RCCS מהרוטור.השליכו את המזרקים מכל פתח קטן, והניחו את ה-RCCS בזווית כדי להכווין את החרו지를 לצד הנגדי לפתח הגדול. לאחר שכל החרו지를 שקעו, פתחו את אחד השסתומים הקטנים ונקזו שליש מהמדיום למכל פסולת. סגרו את השסתום הקטן ופתחו את הפתח הגדול.סובב בעדינות את הכלי כדי לפזר את הצברים חזרה לתוך התמיסה והעבר את התאים למבחנה קונית סטרילית בנפח 50 מיליליטר. לאחר שהצברים שנאספו ישקעו במבחנה הקונית, השתמש בנוזל העל כדי לשטוף שוב את כלי התרבית ביסודיות, במטרה למקסם את התשגור של הצברים. השתמש בקצה פיפטה בעל פיה רחבה (wide bore) כדי לחלק מיד את הצברים למנות עבור בדיקות תפקודיות בהמשך.קו התאים S-G-H-P-L four trophoblast הוא דוגמה אחת לתאים דמויי טרופובלסטים חוץ-וילסיים. באגרגט טיפוסי שגודל ב-RCCS על cyto X three, חרוזיים רבים מכוסים לחלוטין בתאים מתרבים. שימו לב לבליטות הנמתחות מהצביר המרכזי ונצמדות לצבירים שכנים.לאחר ההוצאה מה-RCCS וההזרקה על מטריצה חוץ-תאית, תאים הגדלים בתלת-ממד בעלי מאפיינים דמויי EVT פולשים או נודדים באופן אגרסיבי. למעשה, נתוני R-T-P-C-R מאשרים את העלייה בביטוי של MMPs הנצפית באגרגטים בתלת-ממד לעומת תרביות תאים מסורתיות בשכבה אחת (monolayers). באופן מעניין, גנים שאינם קשורים לפלישה מראים גם הם ביטוי מוגבר ב-RCCS.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה כיצד להשתמש ב-RCCS עם שורת התאים שלכם, תאים ראשוניים או אפילו תאי גזע, כדי להשיג תרביות תאים תלת-ממדיות המדמות בצורה קרובה יותר את הקינטיקה התאית in vivo.

rotating-cell-culture-systems-for-human-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

למדו שיטת סיבוב תרבית תאים תלת-ממדית לחקירת התמיינות תאי טרופובלסט אנושיים. מערכת RCCS מחקה תנאים פיזיולוגיים ומאפשרת ביטוי משופר של סמני התמיינות בהשוואה לתרביות דו-ממדיות.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

גלה סרטונים נוספים