ניתוח Morphometric סעיפים רשתית
19 בפברואר 2012
סרט זה מדגים שלושה סוגים של ניתוחים morphometric של הרשתית, אשר כוללים מדידת עובי השכבה הפנימית גרעינית, לכימות את מספר התאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ומדידה של גדלים של RGCs. הטכניקה יכולה להציע פלטפורמה פשוטה אך מדעי ניתוחים morphometric.
שלום, אני רג'ינה מהמעבדה למחלות ניווניות של מערכת העצבים במחלקה לאנטומיה, באוניברסיטת הונג קונג. היום אראה לכם כיצד לבצע ניתוח התקדמות של חתכי רשתית. בואו נתחיל. לפני ביצוע כל ניתוח, חתכי דגימות רשתית ארבעה מסוג MyFitness עוברים צביעת H&E.
לאחר מכן, נחלקו אזורי הרשתייה לארבעה אזורים: האזור ההיקפי העליון, האזור המרכזי העליון, האזור המרכזי התחתון והאזור ההיקפי התחתון. לאחר הגדרת האזורים, נרכשה תמונה של כל אזור בהגדלה של 10 פעמים 40 תחת מיקרוסקופ שדה בהיר של decor.
כעת אנו מוכנים לנתח את המידע המורפולוגי של הרשתית. במפגש זה נדגים כיצד למדוד את עובי הרשתית בשכבה הגרעינית הפנימית. פתחו את התוכנה בשם thorough investigator.
בחר את ה-40 types, ולאחר מכן בסרגל הכלים הראשי בחר ב-image open. תחת הלשונית file, בחר תמונה של אזור הרשתית הרצוי שברצונך לנתח. בחר את סוג קו המתאר (contour line) מהתפריט הנפתח בסרגל הכלים הראשי.
וודאו שההזזה האוטומטית מופעלת. ניתן להגדיל את התמונה על ידי לחיצה על כפתור ההגדלה (zoom in). ניתן להשתמש בכפתור ההקטנה (zoom out) כדי להקטין את גודל תצוגת התמונה.
ניתן להזיז הן את העקבה והן את הדגימה לארבעה כיוונים שונים על ידי לחיצה על כפתורי תנועת הסיבה. לחץ לחיצה ימנית בחלון העקבה ובחר בעקבה פשוטה של סדקים. שרטט את קו המתאר לאורך הגבול הפנימי של השכבה הפנימית.
במידה והתרחשה טעות, הפסיקו את הפעולה בחלון העקיבה ולחצו על כפתור ה-undo כדי למחוק את נקודת הרישום האחרונה. המשיכו בעקיבה עד לנקודה האחרונה של הקו. בסיום הרישום, הפסיקו את הפעולה בחלון העקיבה, בחרו בקו מתאר פתוח (open contour) והפעילו את התמונה על ידי לחיצה על zoom in.
לחץ על המקש השמאלי בחלון העקיבה. כדי להגדיל את התמונה, בחר סמן בסרגל הסמנים בנקודת החיבור.
לאחר הוספת כל הסמנים, בחר את סמל הסמן במיקום סרגל הסמנים. במרכזו של אחד הסמנים, בצע לחיצה ימנית בחלון העקיבה, בחר ב-quick measure angles תחת הלשונית, ולאחר מכן בחר באפשרות continuous. מדוד את הזווית על ידי לחיצה ראשונה במרכזו של סמן הסמוך לסמן שנבחר.
עבור קצה קטע הקו, הזז את הנקודה למרכז המוקד. סמן את הסדק. שוב, השחט את קו גומיית המתיחה עד לגבול החיצוני של שכבת ה-inia וכוון את הזווית עד להגעה ל-90 מעלות.
הגיעו לסדק השמאלי בנקודה הרצויה. מיקמו של תיבת הדיאלוג, המציגה את מדידת הזווית, יופיע מיד לאחר הלחיצה. לחצו על מקש ה-enter תוך השארת העכבר ללא תזוזה משמאל.
לחצו על חלון העקיבה כך שהקו יימתח מקצה אחד לקצה הנבחר החדש. הפרידו אותו בחלון העקיבה ובחרו בבקרת פתיחה (open control). עלינו לבצע ארבע מדידות של ה"אצבעות" בשכבה הגרעינית הפנימית בכל אזור, שם יסורטטו ארבעה קווים.
משכו קו בניצב מבסיס הבקרה בלילה אל הגבול החיצוני של השכבה הגרעינית הפנימית והפעילו את התמונה כך שתוכלו לראות את הגבול בבירור. אם קצה הקו אינו נמצא בגבול החיצוני של השכבה הגרעינית הפנימית, ניתן לחבר ביניהם או לקצר את הקו תחת מצב העריכה. בחרו במצב העריכה ובחרו את הקו.
לחצו על חלון המעקב ובחרו בנקודת חיפוש בבקרת החשמל, הוסיפו נקודה בגבול החיצוני כאשר עריכת הנקודה צריכה להיות לאורך אותו קו. מחקו את הנקודה המקורית. כך ניתן יהיה להשיג יישור עם מעלית חדשה.
הקטינו את גודל התמונה על ידי לחיצה על כפתור ההרחקה (zoom out). בטלו את מצב העריכה ושרטטו את קטע הקו האחרון. לאחר שרטוט קווי הסדר, בחרו במצב העריכה.
לחצו לחיצה ימנית על חלון השרטוט ומיקמו את ארבעת קטעי הקו בהתאם. כעת ניתן לקבל את ארבע המדידות על ידי לחיצה על כפתור המדידה CONT. בחרו את ארבע המדידות הללו והעבירו אותן לתוכנה ייעודית באמצעות לחיצה על העתק.
כדי לשמור, יש ללחוץ על "save as" תחת הלשונית "file". ניתן לשמור את נתוני המעקב כקובץ נתונים. בחלק זה, נכמת את מספר תאי ה-red tail gagan על ידי בחירה ב-"image open".
תחת לשונית הקובץ, בחרו תמונה של אזור הרשתית הרצוי שברצונכם לנתח. ראשית, עלינו לזהות אילו תאים הם חיים ואילו תאים הם מתים. תאים בעלי צורה עגולה בקירוב, שבהם הגרעין נראה בבירור ובצורה עדינה, נחשבים לתאי גנגליון חיים ברשתית.
תאים קטנים ומעוכים אלו נחשבים לאותו תא. בחרו את סוג קו המתאר מהתפריט הנפתח בסרגל הכלים הראשי. שרטטו קו לאורך הגבול של שכבת הסיב השמאלית באמצעות האפשרות של קו מתאר פתוח.
בכל קצה, הוסף סמן אחד בקצה הקו והשני במיקום הסמוך לצוות. בחר את סמל הסמן בסרגל הסמנים. מקם את הסמן במרכז הסמנים.
בסרגל הכלים, בחרו באפשרות למדידה מהירה של זוויות (quick measure angles) תחת הלשונית. לחצו לחיצה כפולה עם המקש הימני בחלון העקיבה, בחרו באפשרות של קו רציף (continuous), ופשוט גררו את קווי הגומי כדי למדוד זווית של 19 degree. לחצו על מקש ה-enter מיד לאחר שהתיבה נסגרת.
אך זכרו שהעכבר עדיין נמצא באותו זמן שנותר. שברו את חלון העקבה כך שניתן יהיה להאריך קו חדש במיוחד מהקצה. בצעו שבירה בחלון העקבה ובחרו בבקרת פתוחה.
שרטטו קו חדש נוסף בדיוק באותה דרך כמו בקצה השני. יצרנו שני גבולות שבתוכם נספר מספר תאי ה-ratin gagan. בחרו סוג אחד של סמן והצמידו סמן אחד לכל חמישה תאים.
בחר גבול אחד כקו החרגה, כך שתא הנוגע בו לא ייחשב כנוכח. בחר סוג סמן אחר עבור התאים המתים. מספר המרווחים של כל סוג סמן יוצג לצד סמל הסמן בהתאם.
בסרגל המסמנים (marker two bar), בחרו במצב עריכה וסמנו את קו הבסיס של המתאר (contour baseline). שברו אותו בחלון העקיבה והגדירו מחדש את סוף הקו. ניתן לקבל את שם קו הבסיס של המתאר על ידי לחיצה על כפתור מדידת המתאר (contour measurement).
ניתן לבטא את מספר התאים למילימטר של השם. כעת נשמור זאת תחת הלשונית קובץ. ניתן לשמור את נתוני העקיבה והסמנים כקובץ נתונים.
חלק זה ידגים כיצד למדוד את צד התא של תא גנגליון רטינלי. תחת הלשונית file, בחרו תמונה של אזור רטינלי רצוי שברצונכם לנתח. בחרו תא גנגליון חי בהתאם לקריטריונים שתוארו בחלק הקודם.
בתוך תא החי, בחרו את סוג קו המתאר (contour line) מהתפריט הראשי. שרטטו קו מתאר לאורך היקף התא, ובסיום השרטוט בחלונית המעקב, בחרו ב-end close contour. שטח התא יוצג תחת סעיף השטח (area) בתיבת הדו-שיח למדידות בקרה.
סרטון זה הדגים שלוש שיטות פשוטות שבהן ניתן לנתח באופן אובייקטיבי את הרשתית. אנו מקווים שסרטון זה יהיה מועיל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים שלושה סוגים של ניתוחים מורפומטריים של הרשתית, הכוללים מדידה של עובי השכבה הגרעינית הפנימית, כימות של מספר תאי הגנגליון של הרשתית (RGCs), ומדידת הגדלים של ה-RGCs. הטכניקה מספקת פלטפורמה מדעית לניתוחים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מורפומטריה של הרשתית
- כימות תאים
רקע
- בריאות הרשתית היא קריטית לראייה.
- ניתוחים מורפומטריים מסייעים בהבנת מחלות של הרשתית.
- תאי העצבים של הרשתית (RGCs) חיוניים להעברת מידע חזותי.
- מדידה של RGCs יכולה לספק תובנות לגבי מצבים נוירודגנרטיביים.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות מורפומטריות לניתוח רשתית.
- לכימות תאי גנגליונים ברשתית והערכת גודלם.
- למדידת העובי של השכבה הגרעינית הפנימית.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת דגימות רשתית.
- צביעת המטוקסילן ואוזין (H&E).
- חלוקת הרשתית לאזורים מוגדרים לצורך ניתוח.
- רכישת תמונות בהגדלות שונות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של עובי השכבה הגרעינית הפנימית.
- כימות של תאי העצבים של הרשתית (retinal ganglion cells).
- הערכת גודלי תאי RGC באזורים שונים של הרשתית.
- הדגמה של גישה שיטתית למורפומטריה של הרשתית.
מסקנות
- הטכניקות המוצגות יעילות לניתוח רשתית העין.
- שיטות אלה יכולות לסייע בהבנת פתולוגיות של הרשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מסגרת זו לצורך מחקר נוסף.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח מורפומטרי אובייקטיבי של חתכי רשתית מאפשר כימות מדויק של אובדן נוירונלי ושינויים מבניים, ובכך תומך בתיקוף מטרות (target validation) במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. באמצעות הפחתת השונות במדידות והגברת הרגישות לשינויים מינימליים, גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בהערכת יעילות טיפולית. היא מספקת פלטפורמה ניתנת להעברה (translatable) להערכת פתולוגיות של הרשתית לאורך שלבי גילוי תרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות צפיפות תאי העצב הרשתית ושינויים בגודל הסומה במודלים של מחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה הניתנת לשחזור של עובי השכבה הגרעינית הפנימית ומורפומטריה של שכבות התאים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים מורפומטריים מוחלטים וניתנים להעתקה לצורך השוואה בין מחקרים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה עבור תהליכי עבודה המשכיים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של רכישת תמונות ועקיבה מבוססי אזורים.
- פלט כמותי: יצירת מדידות אורך וגודל מוחלטות הניתנות לייצוא ישיר לקבצים אנליטיים, מה שמשפר את עקביות הנתונים.
- סקלאביליות: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות הפחתת השונות בין תצפיתים והגברת הרגישות בזיהוי שינויים מינימליים ברשתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תואם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור אובדן תאי RGC ושינויים בעובי השכבות לתוצאות טיפוליות במודלים של גלאוקומה ואקסיטוטוקסיות.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות נקודות קצה מורפומטריות אובייקטיביות וחזרתיות באזורי רשתית שונים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בהערכה חזויה על ידי בידוד שינויים מבניים באופן בלתי תלוי במבחנים תפקודיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך מספקת נתונים מבניים המשלימים הערכות תפקודיות במודלים של מחלות רשתית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות מספר התאים, גודלם ועובי השכבות באזורי רשתית מוגדרים.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה הניסויית והשחזור שלה באמצעות ניתוח סטנדרטי של חתכים צבועים ב-H&E ועקיבה מודרכת על ידי תוכנה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (ספירת תאים, גודל הסומה, עובי השכבה), המאפשרות השוואה סטטיסטית בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות נקודות קצה מבניות הרלוונטיות למחלה במודלים של אקסיטוטוקסיות מושרית NMDA, איסכמיה-רפרפוזיה וגלאוקומה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת לשימוש חוזר למורפומטריה של הרשתית במגוון מודלים של מחלות והתערבויות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית בניוון עצבי של הרשתית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות מורפומטריות בין מפעילים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של סמנים מבניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על שינויים מבניים מדידים ברשתית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה, מיקרוסקופיה ותפעול תוכנה למורפומטריה (Stereo Investigator).
- דרישות הציוד כוללות מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield), מערכת שרטוט ממוחשבת ותוכנה לניתוח תמונות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת היצמדות לפרוטוקול להגדרת אזורים, טכניקת שרטוט ושחזור מדידות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים כוללים התאמת הגדלה, דגימת אזורים וקריטריונים לזיהוי תאים.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות באיכות חיתוכי הרקמה ובעקביות הצביעה לצורך הגדרה מדויקת של הגבולות.
