Name: ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: חקור את תהליך ה-uncoating של HIV-1 במבחנה באמצעות בידוד ליבות ויראליות ומדידת קינטיקה. השיטה מאפשרת לחקור גורמים תאיים ומוטציות המשפיעים על יציבות הווירוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HIV-1 מחקרים uncoating במעבדה אייקן נתמכו על ידי NIH מענקים AI40364, AI50423 ו AI076121. חומרים מרכזיים, כולל חומרים כימיים המשמשים את ELISA p24, סופקו על ידי איידס NIH מחקר תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH.

1. הפקה של HIV-1 חלקיקים לפני שתמשיך, אתה חייב לקבל אישור ובצע את ההנחיות ממשרד biosafety של המוסד שלך לעבוד במתקן biosafety אישר ל-HIV זיהומיות. עליך להבטיח כי טיפול נאות אמצעי בטיחות הם אחריו במהלך העבודה במעבדה biosafety. הפקה של HIV-1 החלקיקים מתבצע בדרך כלל על ידי transfection חולף של תאים 293T עם DNA-HIV-1 proviral בעזרת סידן פוספט transfection השיטה 7, 8. כייל הנגיף גבוהה במניות גדל בתרבות של תאים T נגועים גם הם מתאימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T התרבות התאים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS) שיושלם עם אנטיביוטיקה [פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל)], בעמ '37 ° C, CO 5% 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מנות כמעט ומחוברות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA וזרעי 2x10 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, monolayers התא צריך להיות בערך 25% ומחוברות ומוכן transfection. במשך שש מנות של תאים להיות transfected, להביא 120 מיקרוגרם של ה-DNA proviral עד נפח של 2.7 מ"ל עם מים סטריליים. לתערובת זו להוסיף 0.3 מ"ל של 2.5 מ 'CaCl 2 ו - 3 מ"ל של 2XBBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. אפשר לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל של dropwise את התערובת וכתוצאה מכך למרכז של כל מנה מתערבל תוך כדי לערבב בעדינות. מניחים את הכלים הלילה (~ 16 שעות) בקבוצת באינקובטור ב 35 ° C ו 3% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תרבות בעדינות להוסיף 5 מ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום חדש. התרבות התאים החממה ב 37 &amp;מעלות: C ו 5% CO 2 עבור 24-48 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant תרבות המכילה חלקיקים נגיפיים, להעביר אותו צינור מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי. מערבבים את supernatants מן המנות כל צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5 דקות לתאי גלולה ופסולת. סינון באמצעות supernatant 0.45 נקבוביות בגודל מיקרומטר מסננים מזרק. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לצמצם את היווצרות תרסיס תוך כדי עבודה עם נגיף חי. זה כולל את השימוש של צינורות בצורת חרוט עם טבעות אטימה או מכסה דלי הרוטור במהלך השלב צנטריפוגה. אם זה לא אפשרי, כובעים את הבורג של צינורות צריך להיות עטוף parafilm. </li></ol> 2. ריכוז של HIV-1 virions ידי ultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את supernatant תרבות (30 מ"ל) ב צינור 38.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל (עבור רוטור SW32Ti Beckman או שווה ערך). בעדינות ביסוד supernatant וירוס עם פתרון המכיל 5 מ"ל סוכרוז 20% PBS באמצעות pipet 5 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 3 שעות32,000 סל"ד ב 4 ° C (175,000 XG ב r מקסימום) לחלקיקים גלולה וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור. הוסף 0.5 מ"ל של 1XSTE חיץ (10 mM טריס-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) אל הצינור מקום 4 ° C למשך שעה 1 כדי לשחרר את גלולה. שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל pipet בעדינות מעלה ומטה כמה פעמים לנתק את הכדור מהחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן, להעביר את גלולה התיר את צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל, לטפל כדי למנוע הקצפה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות כדי לאפשר גושים קטנים של הווירוס להתפזר. במהלך תקופה זו, להכין את שיפוע סוכרוז כפי שמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות pipet ההשעיה וירוס מעלה ומטה מספר פעמים צנטריפוגות ב 8000 סל"ד (6,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס microfuge בקירור דקות 1 כדי להסיר גושים שיורית. שמור על קור המדגם במהלך תהליך זה. </li></ol> 3. סוכרוז שיפועצנטריפוגה כדי לבודד ליבות HIV-1 ליבות מבודדים באמצעות "ספין-thru" שיטת 9 המהווה שינוי של השיטה המתוארת לעיל לטיהור של HIV-2 ליבות 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12 מ"ל שיפוע ליניארי 30% עד 70% סוכרוז במאגר 1XSTE בתוך צינור 14.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל עבור SW32.1Ti הרוטור. כדי להכין את שיפוע, להשתמש שיפוע 20 מ"ל לשעבר: מקום 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 70% בצד הקרוב (קרוב ליציאת לשקע) ו 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% בצד הרחוק. ודא כי בועות אוויר לא לכודים ערוץ המחבר את שני חדרים. השתמש Densi-Flow אוטומטי הדרגתי לשעבר המשאבה הדרגתי מלמטה למעלה של שפופרת המכילה 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 85% בתחתית. בעדינות במקום שיפוע ב 4 ° C עד מקורר (2-4 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל בעדינות שכבת צבע עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 15% STE המכיל 1% טריטון X-100. </li> בעדינות את שכבת עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 7.5% ב STE שימוש רחב לשעמם 1 pipet קצה מ"ל. היזהרו שלא לערבב את השכבות. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות עם כיסוי ההשעיה 0.5 מ"ל וירוס משלב 2.4. צעד זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע כל הפרעה השיפוע ערבוב של שכבות סוכרוז מודגשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות בדלי SW32.1Ti מראש מקורר צנטריפוגות ב 32,000 סל"ד (187,000 XG ב r מקסימום) למשך הלילה (16-20 שעות) בשעה 4 ° C. כדי למנוע הפסקה של צנטריפוגות, אל תתחיל צנטריפוגה עד ואקום בצנטריפוגה מגיע 250 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שברים 1 מ"ל מלמעלה למטה של ​​שיפוע באמצעות fractionator אוטומטי Densi-Flow הדרגתי. מניחים את הצינורות על קרח מיד עם האוסף. מערבבים את התוכן של הצינורות על ידי כמה פעמים היפוך, ולסגת 50 μl של חלק עבור כל כימות של ELISA או assay להפוך פעילות transcriptase. </li></ol> 4. לוקליזציה של HIV-1 ליבותואחסון של ליבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע מבחני uncoating, חשוב כדי לקבוע אילו שברים שלמים המכילים HIV-1 ליבות. זה יכול להיקבע על ידי ELISA p24 או transcriptase הפוכה פעילות assay באמצעות 50 aliquots μl משלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתאוששות של CA הקשורים ליבות קשורה לעתים קרובות ליציבות של גרעינים. מדד הליבה הקשורים CA על ידי ELISA p24 9 באמצעות מדגם של כל חלק. לחלופין, למדוד את פעילות transcriptase הפוכה של כל חלק. באמצעות שתי השיטות השיא צריך להיות סביב חלק 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל ליבות. אם ליבות אינם לשמש uncoating assay מיד, aliquot ליבות אספו לתוך 0.2-0.3 aliquots מ"ל, פלאש הקפאת N2 נוזלי חנות ב -80 ° C. גרעינים קפואים בדרך זו מתאימים assay uncoating. התשואה של CA הליבה הקשורים הוא בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם למיליליטר של לכל p24 או כ -15% מכלל virion הקשוריםp24. </li></ol> 5. Assay קינטי של uncoating-HIV-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכום של HIV-1 ליבות הנדרש לכל תגובה uncoating הוא כ 50 ננוגרם. כדי לבצע את assay ב uncoating חוץ גופית, predilute aliquot של ליבות עם נפח שווה של חיץ 1XSTE קר כדי להפחית את הצמיגות של ההשעיה כדי למזער שגיאות pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA ב צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. אנחנו משלימים את המאגר STE עם BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למזער את ספיחה של CA על הקירות של הצינור. מערבבים על ידי פעמים את הצינור היפוך מספר. אל המערבולת דגימות. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות במרווחים מתוזמנים (15, 30, 60 ו 120 דקות). צינורות צריך להיות שקוע באמבט מים לפחות עד לרמה של המדגם פנימי על מנת להבטיח אפילו התחממות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לערבב בעדינות את תוכן הצינור מעת לעת (בדרך כלל 5 -10 דק ') על ידי מצליף את הצינורית. לשליטה דקה אפס, לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר לדגור על הקרח לכל אורך הניסוי (120 דקות). השליטה דקה אפס נותן את הערך uncoating הבסיס, משמש לקביעת עליית uncoating ליבות מודגרות ב 37 מעלות במרווחים בעיתוי שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הדגירה, לעצור את תהליך uncoating ידי הנחת צינורות קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 45,000 סל"ד (רוטור TLA-55: 125,000 XG ב r מקסימום) במשך 20 דקות 4 ° C. זו תהיה גלולה ליבות שלם CA חינם שוחרר כתוצאה uncoating ליבות יישאר supernatant. הרוטור צריך להיות precooled ב 4 ° C לפני העמסת דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant חדשים צינורות microfuge precooled רצוי בעזרת ג'ל טעינת טיפים המאוחסן בטמפרטורת החדר. שים לב גלולה לא יהיה גלוי לעין, כך לטפל w קיצונייםבשעה שהייתי pipetting את supernatant. Resuspend את כדורי ב 250 μl של diluent מדגם ELISA (0.5% טריטון X-100 ו - 5% התורם עגל בסרום PBS). כדי להבטיח פיזור יעיל של גלולה, מערבולת לאחר הוספת diluent מדגם ELISA. לכמת את התוכן CA של גלולה ו supernatant באמצעות ELISA p24 כפי שמתואר בסעיף הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היקף uncoating מתקבל על ידי חישוב החלק היחסי של CA נוכח supernatant. </li></ol> 6. Assay עבור CA על ידי ELISA p24 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבים ערכות ELISA מסחרי זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכמת CA. כל שימוש מסחרי או "בתוך הבית" ELISA וכוללים סטנדרטים p24 כדי לקבוע את הליניאריות של assay. דילולים של דגימות צריך להיות assayed כדי להבטיח דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתחנו ELISA תוצרת בית שבו אנו משתמשים באופן שגרתי כדי assay עבור CA. ההליך מותאם מדוח הקודם 11 ו מבוצע באמצעות גלאי ללכוד נוגדנים זמין מתרומת זרע NIHS מחקר מגיב תוכנית הפניה. </li></ol> 7. נציג תוצאות: דוגמה מכך מן ELISA לקביעת שברים המכיל ליבה מוצג באיור 1. לאחר איסוף שברים (1 מ"ל כל אחד), 50 μl של כל חלק מן המדגם היה להשתמש בו כדי להפוך דילולים סדרתי ונותחו על ידי ELISA. P24 הכולל מתקבל על ידי הוספת ערכים במשך שתים עשרה שברים היה 14.5 מיקרוגרם. כפי שמוצג שברים דמות 8-10 ליבות הכיל. הערך p24 עבור הליבה המכילים שברים היה 2.17 מיקרוגרם. האחוז של הליבה הקשורים p24 (14.97%) נקבע על ידי לקיחת היחס בין ערך p24 עבור שברים הליבה (2.17 מיקרוגרם) לערך p24 הכולל (14.5 מיקרוגרם). חלק 1 או 2 תמיד מכילים כמות גבוהה של p24, זה מייצג CA חינם אשר אינו משויך ליבות. זה ואחריו הפחתה הדרגתית של ערכי p24 עם חלק אחד לאחר מכן, ולאחר מכן עלייה חדה ולבסוף ירידה חדה p24הערכים. אם טיפול נאות הוא נלקח בעת טעינת שיפוע אז בשיא הליבה הקשורים CA נמצא סביב חלק 10. תוצאה אופיינית מתקבל על ידי assaying את הקינטיקה של uncoating של HIV-1 ליבות מוצג באיור 2. הגרף מראה גידול תלוי זמן ב uncoating של wild-type HIV-1 ליבות. אחוז uncoating ערך הושג על ידי חישוב שבריר של CA נוכח supernatant. בעזרת תרגול, assay הוא לשעתקו מאוד שימושי לקביעת יציבות ליבות ויראלי במבחנה. יש לציין כי שחזור של assay תלויה מאוד בטיפול נאות של הדגימות במהלך ההליך. מאז ליבות הם חום יציב, הדגימות יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך assay למעט בתקופת הדגירה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> איור 1 צפיפות שיווי משקל הדרגתי של צנטריפוגהHIV-1 ליבות. ההשעיה וירוס מרוכז היה מוחל על החלק העליון של מדרון 30-70% סוכרוז ליניארי ועליהן 1% Triton-X-100. לאחר צנטריפוגה ולינה XG 187,000 ו 4 ° C, 1 שברים מ"ל נאספו מלמעלה (שבר 1) לתחתית (שבר 12) ו - p24 היה לכמת ידי ELISA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2 כמובן זמן של uncoating HIV-1 במבחנה. מטוהרים HIV-1 ליבות היו בדילול וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחי הזמן המצוין. המדגם דקות אפס הודגר על הקרח לכל אורך הניסוי. לאחר דגירה, דגימות היו ultracentrifuged ב XG 125,000 למשך 20 דקות ב 4 ° C. Supernatant וכדוריות הופרדו ונותחו על ידי ELISA p24. היקף uncoating נקבע כמתואר בטקסט פרוטוקול. התגובה של כל uncoating בוצעה לשכפל, ברים שגיאה תוחלת בטווח של שני ערכים.

<ol><li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li>
<li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV.+AIDS%22%5BJournal%5D)">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li>
<li>Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li>
<li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li>
<li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiken%2C+C+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).</li>
<li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li>
<li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li>
<li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li>
<li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+authentic%2C+mature+HIV-1+virions+and+cores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li>
<li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li>
<li>Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores%3A+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6%28gag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן כדי לטהר HIV-1 ליבות ללמוד uncoating במבחנה שימושי ללמוד את השלב הזה של מחזור HIV-1 החיים, בעיקר בשל חוסר זמינות של שיטה לנתח תוקף HIV-1 uncoating בתאי המטרה. אמנם שיטה זו משתמשת ultracentrifugation שיווי משקל לטהר ליבות, אחרים השתמשו pelleting ישיר לאחר תמוגה קצרה עם 1% טריטון X-100-12, 13 או pelleting באמצעות כרית סוכרוז ועליהן 0.1% טריטון X-100-14, 15. ההתאוששות של ליבות...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="190"> שם מגיב </td><td width="197"> חברה </td><td width="114"> מספר קטלוג </td><td width="161"> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt בייקר Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> הרכב: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl ו - 1.5 mM Na 2 HPO 4. התאם את ה-pH 6.95בטמפרטורת החדר. סנן לעקר &amp; חנות aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> נוגדן ציפוי: נוגדן חד שבטי כדי p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH האיידס מחקר תוכנית הפניה מגיב </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> הנוגדן העיקרי: HIV-איג (המטופל hyperimmune בסרום אדם) </td><td> NIH מחקר האיידס ו מגיב הפניה תוכנית </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> משני הנוגדנים: אנטי אנושי עיזים IgG, peroxidase מצומדות </td><td> לנקב </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP המצע </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 צלחות טוב </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti ו SW32.1 הרוטורים טי ו ultracentrifuge תואם </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 הרוטור ultracentrifuge השולחן </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מהירות גבוהה microfuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi צפיפות זרם שיפוע fractionator </td><td> Labconco קורפ </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> צבע לשעבר </td><td> הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה מדעי ושות בע&quot;מ </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

ב uncoating במבחנה של hiv-1 ליבות

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

הגנום של רטרווירוסים הוא עטוף capsid מוקף במעטפת השומנים. עבור lentiviruses, כגון HIV-1, הקליפה חרוטי capsid מורכב החלבון CA מסודרים כמו סריג של משושה. Capsid סגור על ידי 7 pentamers בסוף רחב 5 בקצה הצר של חרוט 1, 2. עטוף במעטפת זו capsid הוא מורכב ribonucleoprotein ויראלי, ויחד הם מהווים את הליבה. בעקבות איחוי של קרום ויראלי עם קרום התא היעד, HIV-1 הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה. Capsid אז מפרק שחרור CA חינם בצורה מסיסה 3 בתהליך המכונה uncoating. המיקום והעיתוי תאיים של uncoating-HIV-1 הם הבינו היטב. חומצה אמינית בודדת החלפות ב-CA אשר משנים את יציבות capsid גם לפגוע ביכולת של HIV-1 להדביק תאים 4. זה מצביע על יציבות capsid הוא קריטי עבור הידבקות ב-HIV-1. </p&gt; HIV-1 uncoating כבר קשה ללמוד בשל היעדר זמינות של מבחני רגיש ואמין עבור תהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה כמותית ללימוד uncoating במבחנה באמצעות ליבות מבודד HIV-1 חלקיקים זיהומיות. גישה כוללת הבידוד של ליבות על ידי שקיעה של virions מרוכזת באמצעות שכבה של חומר הניקוי לתוך מפל סוכרוז ליניארי, בקור. כדי לכמת uncoating, גרעינים המבודד מודגרת ב 37 מעלות במרווחים מתוזמנים שונים pelleted לאחר מכן על ידי ultracentrifugation. היקף uncoating מנותח על ידי לכימות שבריר של CA ב supernatant. גישה זו כבר מועסק על מנת לנתח את ההשפעות של מוטציות ויראליות על יציבות HIV-1 capsid 4, 5, 6. זה צריך להיות שימושית גם עבור לומד את התפקיד של גורמים הסלולר uncoating-HIV-1.

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם<em&gt; במבחנה</em&gt;.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

הגנום של הרטרו-וירוסים עטוף בקפסיד המוקף במעטפת ליפידית. עבור לנטי-וירוסים, כגון HIV-1, מעטפת הקפסיד הקונית היא...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע ציפוי ENC של HIV one in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור חלקיקי HIV one. לאחר מכן, הווריאנטים מרוכזים באמצעות Ultracentrifugation. השלב הבא הוא בידוד cause באמצעות אלטרה-צנטריפוגציה במדרג סוכרוז.לבסוף, מבוצעת בדיקה קינטית של פתיחת מעטפת (uncoating) של HIV-1. התוצאות הסופיות מראות פתיחת מעטפת של HIV-1 התלויה בזמן, באמצעות כימות של תוכן ה-ca בתוך המשקע ובעלון על ידי ELISA. עניין זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ה-HIV-1, כגון תפקידם של גורמים תאיים בתהליך פתיחת המעטפת והשפעתם של מוטציות על יציבות לכידת הנגיף לפני פרולין.עליך לקבל אישור ולפעול לפי ההנחיות של משרד הביו-בטיחות במוסדך כדי לעבוד במתקן ביו-בטיחות עבור HIV-1 זיהומי. יש לנקוט בטיפול ובזהירות נאותים בעת עבודה במעבדת ביו-בטיחות. בהדגמה זו, חלקיקי HIV-1 מיוצרים על ידי טרנספקציה זמנית של תאי 293T עם DNA פרו-ויראלי של HIV-1.בשימוש בשיטת טרנספקציה של סידן-פוספט, ביום שלפני הטרנספקציה, השג תאי 2 9 3 T שגודלו קודם לכן ונתק אותם מהצלחות באמצעות 0.5% trips in EDTA; זרע שש צלחות תרבית של 100 מילימטר לייצור של וריאנטים. למחרת, שכבת התאים צריכה להיות בערך 25% confluent ומוכנה לטרנספקציה עבור שש צלחות של תאים. לצורך הטרנספקציה, השתמש ב-120 מיקרוגרם של DNA פרו-ויראלי כדי להכין תערובת המכילה

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

פרוטוקול זה מתאר את NAME, בדיקה המאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות המסוגלות לעכב במבחנה את פעילויות המלווה של חלבון נוקלאוקפסיד HIV-1.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

אנו מדגימים כאן מבחן קשירת ממברנה במבחנה שבו אינטראקציות בין HIV-1 Gag וממברנות שומנים מנותחות ויזואלית באמצעות Gag מתויג YFP המסונתז במערכת תרגום במבחנה מבוססת נבט חיטה ו-GUVs שהוכנו בטכניקת אלקטרופורמציה.

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

דוח זה מתאר מבחן חוץ גופי למדידת פעילות האינטגרציה הקשורה לנגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתמציות הציטופלזמיות של תאים נגועים באופן חריף. השילוב של DNA HIV-1 הקשור ל-PIC ב-DNA מטרה הטרולוגי מכומת על ידי שימוש באסטרטגיית תגובת שרשרת פולימראז מקוננת בזמן אמת.

מדידה במבחנה פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

שיטה זו מספקת פרוטוקול נגיש וגמיש להכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM).

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

חקור את תהליך ה-uncoating של HIV-1 במבחנה באמצעות בידוד ליבות ויראליות ומדידת קינטיקה. השיטה מאפשרת לחקור גורמים תאיים ומוטציות המשפיעים על יציבות הווירוס.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

גלה סרטונים נוספים