Name: התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד הכנת פרוסות רקמה חיות לאימות תגובות נוירונים באיבר Vomeronasal בעכברים טרנסגניים המביעים G-CaMP2. שיטת דימות סידן זו מאפשרת ניתוח תבניות תגובה לפירומונים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני האיתות הכימי ביונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאנדריאה מוראן יחד עם חברי מתקן השירותים לבעלי חיים למעבדה (LASF) במכון סטואורס על תמיכתם המצוינת בגידול בעלי החיים ובשירותים הטכניים. עבודה זו נתמכת במימון ממכון סטואורס ומ-NIH (NIDCD 008003) עבור CRY. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון הלאומי לחירשות ולהפרעות תקשורת אחרות או של המכונים הלאומיים לבריאות. פטנט בארה"ב ממתין עבור עכברי tetO-G-CaMP2 עבור מכון סטואורס, CRY ו-LM.

<ol><li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirch%2C+MC+%22Pheromones%22">Pheromones</a>. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).</li>
<li>Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).</li>
<li>Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vomeronasal+organ+mediates+interspecies+defensive+behaviors+through+detection+of+protein+pheromone+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs.</a> Cell. 141, 692-703 (2010).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographically+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Ryba, N. J., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Neuron. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Pantages, E., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+candidate+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel family of candidate pheromone receptors in mammals.</a> Neuron. 28, 835-845 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+and+vomeronasal+receptor+genes+in+two+mouse+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies.</a> Genomics. 83, 802-811 (2004).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+and+isolated+families+within+the+mouse+superfamily+of+V1r+vomeronasal+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors.</a> Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).</li>
<li>He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+gender+and+individual+information+in+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ.</a> Science. 320, 535-538 (2008).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Chamero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+pheromones+that+promote+aggressive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour.</a> Nature. 450, 899-902 (2007).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+peptides+from+exocrine+glands+stimulate+mouse+vomeronasal+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons.</a> Nature. 437, 898-901 (2005).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

לא הוצהרו ניגודי עניינים.

מרבית הקולטנים הוומרונזאליים (VRs) נותרו כקולטנים יתומים מאז גילו על ידי Dulac ו-Axel 5. הליגנדים הפרומונליים עבור קולטנים כימוסנסוריים אלו ותפקידם בתיווך התנהגויות של בעלי חיים אינם מובנים היטב. עד כה, רק זוג אחד של ליגנד/קולטן, הפפטיד ESP1 והקולטן התואם לו, Vmn2r116 (V2Rp5), זוהה והוכח כמעביר מידע חברתי ספציפי 19,23. קולטן נוסף, V1rb2, הוכח כמגיב ל-2-heptanone, אשר ככל הנראה מרוכז בשתן של נקבות עכברים 24. עם זאת, המידע הספציפי המועבר על ידי ליגנד זה נותר לא ברור. השיטה שפיתחנו כאן מאפשר...

התגובות הדמיה העצבית ההכנות slice של איברים vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

האיבר הוומרונזלי (VNO) מזהה אותות כימותרמיים הנושאים מידע על המעמד החברתי, המיני והרבייתי של פרטים מאותו מין 1,2. אותות תוך-מיניים אלו, הפרומונים, כמו גם אותות מטורפים מסוימים 3, מפעילים את הנוירונים החושיים הוומרונזליים (VSNs) ברמות גבוהות של ספציפיות ורגישות 4. לפחות שלוש משפחות נפרדות של קולטנים המצומדים לחלבון G, ‏V1R, V2R ו-FPR 5-14, מתבטאות בנוירוני ה-VNO כדי לתווך את הזיהוי של הרמזים הכימותרמיים. כדי להבין כיצד מידע על פרומונים מקודד על ידי ה-VNO, חיוני לנתח את פרופילי התגובה של VSNs בודדים לגירויים שונים ולזהות את הקולטנים הספציפיים המתווכים תגובות אלו.
הנוירואפיתל של ה-VNO סגור בתוך זוג עצמות וומר. למבנה הצינורי חסר הראייה של ה-VNO יש קצה פתוח אחד (תעלת הוומרונזל) המתחברת לחלל האף. תאי VSN שלוחים את הדנדריטים שלהם לחלק הלומן של ה-VNO, שם סימני הפרומונים באים במגע עם הרספטורים המבוטאים בבליטות הדנדריטיות. גופי התא של ה-VSN יוצרים שכבות פסאודו-סטרטפייד, כאשר V1R ו-V2R מבוטאים בשכבות האפיקליות והבזאליות בהתאמה 6-8. מספר טכניקות שימשו לניטור תגובות של VSN לגירויים תחושתיים 4,12,15-19. בין טכניקות אלו, הכנת פרוסות אקוטיות מציעה מספר יתרונות. ראשית, בהשוואה ל-VSN מנותקים 3,17, הכנות של פרוסות שומרות על הנוירונים במורפולוגיה המקורית שלהם והדנדריטים של התאים נשארים שלמים יחסית. שנית, גופי התא של ה-VSN נגישים בקלות בפרוסה קורונלית של ה-VNO, מה שמאפשר מחקרי אלקטרופיזיולוגיה וניסויי דימיון בהשוואה לאפיתל שלם ולהכנות whole-mount 12,20. שלישית, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות של שיבוט מולקולרי כדי לאפשר זיהוי רספטורים.
גירוי חושי מעורר זרימה חזקה של Ca2+ לתוך VSNs, המעידה על הפעלת רצפטורים 4,21. לפיכך, פיתחנו עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 בנוירונים החושיים הריחוניים, כולל ה-VSNs 15,22. הרגישות והטבע הגנטי של הגשוש מקלים מאוד על ניסויי דימות Ca2+. שיטה זו ביטלה את תהליך טעינת הצבע ששימש במחקרים קודמים 4,21. כמו כן, אנו משתמשים במערכת להגשת ליגנדים המאפשרת יישום של גירויים שונים על פרוסות VNO. השילוב של שתי הטכניקות מאפשר לנו לנטר מספר נוירונים בו-זמנית בתגובה למספר רב של גירויים. לבסוף, הקמנו צינור ניתוח חצי-אוטומטי לסיוע בעיבוד התמונות.

האיבר הוומרו-נזלי (VNO) מזהה אותות כימיים בתוך-מיניים המעבירים מידע חברתי ורבייתי. ביצענו ניסויי דימוי Ca2+ באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 ברקמת ה-VNO. גישה זו מאפשרת לנו לנתח את דפוסי התגובה המורכבים של נוירוני הוומרו-נזל למספר רב של גירויי פרומונים.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

האיבר הוומרונזלי (vomeronasal organ - VNO) מזהה אותות כימוסנסוריים הנושאים מידע על המצב החברתי, המיני והרבייתי של פרטים בתוך...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להכין פרוסות רקמה חיות לצורך הדמיה של תגובות לפרומונים בנוירונים של איבר ה-MRO באף. זאת מושג תחילה על ידי הכנת פרוסות רקמה חיות של איבר ה-MRO באף או של VNO מעכברים המבטאים את אינדיקטור הסידן הגנטי GCaMP two. השלב הבא הוא הקמת מערכת הפרפוזיה עלבמת המיקרוסקופ לשם תחזוקת הפרוסה, יישום הגירוי והדמיה.התגובה. לאחר מכן מבוצע ניסוי של דימוי בשקיעת זמן (time-lapse) עם גירויי פרומון שונים, ולאחריו ניתוח נתונים של תוצאות הדימוי. בסופו של דבר, מתקבלים דפוסי התגובה של נוירוני VNO לגירויי פרומון שונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טעינת calcium D או דימות בתאים מבודדים, הוא היכולת לשמר את המורפולוגיה השלמה של התאים, לשמור טוב יותר על בריאות הפרוסות ולהשיג אות חזק יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לכמה מהשאלות המרכזיות במחקרי מערכת הריח של התולעת, כגון זיהוי הליגנדים והקולטנים שלהם ואפיון התגובות של נוירוני ריח בודדים בתולעת. ניתן ליישם שיטה זו גם במערכות אחרות, כגון מערכות ריח, סרום או פסוריאזיס במוח.באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו עלולים להתקשות בשל הקושי בהשגת דגימות פסוריאזיס איכותיות ובהגדרת מערכת הדיפוזיה. לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו את התמיסות הנדרשות, כולל העכבר, תמיסת רינגר של נוזל חוט השדרה המדומה (artificial cerebral spinal fluid ringer solution), אגרוז 4% בנקודת התכה נמוכה וגירויי פרומון, בהתאם למאמר המצורף. לאחר מכן, הניחו שני מבחנות של אגרוז בנקודת התכה נמוכה על בלוק חימום.הגדירו את הטמפרטורה לגבוהה מ-60 °C כדי להמיס את ה-aros. ברגע שהג'ל נהיה נוזלי, העבירו את המבחנות לבלוק חימום של 37 °C. להכנת פרוסות VNO.לאחר עריפת ראשו של עכבר GCaMP two שהורדם, גזרו את עצמות הלסת התחתונה בעזרת מספריים כדי להסירה. לאחר מכן, קלפו את רקמת החיך העליון המפוספסת כדי לחשוף את חלל האף. לאחר מכן, הפרידו בין עצמות הלסת על ידי החדרת להב ניתוח בין שתי השיניים החותכות הקדמיות.הסר בזהירות את עצם הלסת כדי לחשוף את ה-VNO. בשלב זה, הרם את ה-VNO כולו מחלל האף על ידי אחזקה בעצם הזנב. העבר את ה-VNO לתמיסת A CSF קרה ומחומצנת של עכבר.יש להפריד מיד תחת מיקרוסקופ הדיסקציה את שני ה-vno על ידי החלקקה עדינה של קצות הפינצטה לאורך דופן עצם המחיצה. קלפו את עצם ה-vulner העוטפת את רקמת ה-VNO. לאחר מכן, הרימו בעדינות את כל רקמת ה-VI NO מתוך חלל העצם.יש לנקוט זהירות רבה בשלב זה כדי למנוע פגיעה ב-neuro epithelium. לאחר מכן, יש להסיר לחלוטין את שברי העצם הקטנים שנותרו על פני הרקמה. לפני הטמנת השברים שנותרו.הרקמה עלולה להיתפס בלהב החיתוך, דבר שעלול למשוך את הרקמה מחוץ לבלוק ה-aros. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להחזיק את הקצה האחורי של רקמת ה-VNO וטבול אותה בעדינות ב-aros המומס. קרר במהירות את המבחנה על קרח.כדי להקשות את ה-aros, תהליך ההטמעה והקירור צריך להימשך פחות משתי דקות. לאחר מכן, יש לקצץ את בלוק ה-aros המכיל את ה-VNO ולהדביקו למחזיק הרקמה. לאחר מכן, הכנס את מחזיק הרקמה לתוך הגליל המתכתי ומלא את החלל שנותר ב-aros נוסף בעל נקודת התכה נמוכה.ברגע ששומן הנמסה נמוכה (low melting agarose) מתגבש על קרח, יש לעבור מיד לחיתוך: ספקו נוזל CSF של עכבר המחומצן וקר אקסטרה-סלולרי לתא החיתוך של סורק הרקמות, וחתכו פרוסות בעובי של 180 עד 200 micron כל אחת. לאחר מכן, אספו והעבירו את הפרוסות לתא האינקובציה. הפרוסות נשארות חיות למשך שש עד שמונה שעות בתוך ה-CSF של העכבר המחומצן בטמפרטורת החדר.בפרוצדורה זו, ראשית יש להניח פרוסה של VNO במרכז תא הפרפוזיה ולקבע את הפרוסה באמצעות מעגן פרוסות. חוטי המעגן צריכים ללחוץ רק על חלק ה-aros בעל נקודת ההמסכה הנמוכה של הפרוסה, ולא על רקמת ה-VNO. לאחר מכן, יש להזרים CSF של עכבר מחומצן אל תא הפרפוזיה דרך פתח הכניסה בקצב של כ-100 µL לשנייה.הנוזל מנוקז באמצעות מחט שאיבה דרך פתח היציאה כדי לספק זרימה רציפה של CSF טרי מעכבר A. לאחר מכן, מלאו מזרק של 30 milliliters בתמיסת ringer וחברו אותו למשאבת המזרקים. הגדירו את מהירות המשאבה ל-300 עד 600 microliters לדקה.כדי לספק זרימה רציפה של תמיסת רינגר על פני הפרוסה, חברו את מוצא תמיסות הרינגר ללולאת הזרקה של A-H-P-L-C. לבקרת לולאת ההזרקה יש שני נתיבי זרימה. במצב טעינה (load), טענו את דגימת שתן העכבר לתוך לולאת הדגימה באמצעות מזרק דיוק של Hamilton.עודף דגימה יוצא מלולאת הדגימה דרך יציאת הפסולת. תמיסת רינגר המוזרקת על ידי משאבת המזרקים עוקפת את לולאת הדגימה ועוברת ישירות ליציאה, המחוברת לקצה הפרפוזיה במיקום ההזרקה. תמיסתו של המשאבה זורמת דרך לולאת הדגימה ודוחפת את גירויי הפרומון לעבר היציאה.לפני ניסוי הדימוג, יש להסיר בועות אוויר כדי להבטיח זרימה חלקה של נוזל הפרפוזיה. לאחר מכן, כוון את קצה הפרפוזיה תחת עדשה של 5x או 10x, כך שהקצה יהיה במרחק של כ-1 millimeter מפרוסת ה-vien O.כדי למדוד את זמן השיהוי של הדגימה ואת משך הזמן, טענו צבע פלואורסצנטי בריכוז 0.1%rho domine six G dye לתוך לולאת הדגימה. לאחר מכן, העבירו את השסתום למצב הזרקה. חמש שניות לאחר תחילת רכישת התמונה, גלו את אות הפלואורסצנציה בין 10 ל-30 שניות.העקומה החלקה של האות הפלואורסצנטי מעידה גם על כך שנוצרת מעט מאוד טורבולנציה תחת העדשה הטבולה וכי פרפוזיה מספקת של CSF של עכבר מחומצן מגיעה לפרוסה במעבדה שלנו. עבור דימוי time-lapse לזיהוי אותות GAMP two, נעשה שימוש במיקרוסקופ Zeiss Axio scope FS two עם עדשה טבולה במים של 10 x או 20 x. נעשה שימוש במסנן band pass סטנדרטי של GFP בטווח של 450 עד 490 ננומטרים.תמונות הפלואורסצנציה האפי-פלואורסצנטית נרכשות באמצעות מצלמת CCD עם סבב של אחד על אחד או שניים על שניים, בהתאם לרמות הביטוי של GCaMP two. ראשית, הגדירו את מהירות הרכישה לפריים אחד לשנייה. כווננו את עוצמת האור כדי למזער את הדהייה (bleaching) של אותות ה-GCaMP two ונזק פוטו-כימי לתאים.לאחר מכן, העבירו את השסתום למצב הזרקה בנקודת זמן ספציפית, כך שיתקבלו השהיות זמן עקביות בכל הניסויים בתוך סט ניסויי נתון. כעת, בצעו הרצת בדיקה באמצעות תמיסת ringer כגירוי, וכוונו מחדש את מערך הפרפוזיה אם נוצרו ארטיפקטים של תנועה במהלך הזרקת הדגימה. לאחר מכן, בצעו הרצת ביקורת חיובית עם שתן של עכבר המדולל ביחס של 1:100 בתמיסה, כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות שונות.שטפו את מזרק ההמילטון (Hamilton) בתמיסת רינגר לפחות שלוש פעמים לאחר טעינת גירוי אחד. באופן דומה, שטפו את לולאת הדגימה בתמיסת רינגר לפחות שלוש פעמים בין גירויים שונים לפני ההחלה. לפני הגירוי הבא, המתינו בין ארבע ל-10 דקות להתאוששות של הנוירונים החושיים הנחירים ב-MRO, כדי לבצע רישום תמונות (image registration) של כל התמונות שנרכשו מפרוסה אחת.סקריפט VBA שנכתב בהתאמה אישית ב-Avision משמש לאוטומציה של תהליך זה. במקרה זה, כל פריימי התמונה בתוך אותו ניסוי נרשמים ביחס לפריימ רפרנס משותף שנבחר באמצעות elastic, כדי לבצע חיסור תמונות לצורך זיהוי התאים המגיבים. מאקרו שנכתבו בהתאמה אישית ב-ImageJ גרסה 1.42 משמשים לאוטומציה של תהליך זה.תמונת היטל מינימלי (minimal projection image) נוצרת עבור כל ערימה של תמונות (stack), והתאים המגיבים עולים לאחר הפחתת ההיטל המינימלי מערימות התמונות הגולמיות. לאחר מכן, זהה את אזור העניין (region of interest) מערימות התמונות לאחר ההפחתה והשג את קואורדינטות ה-ROI באמצעות תוסף ה-multi mesure של Image J. לאחר מכן, עבד את כל הערימות עבור ניסוי אחד ושמור את כל קואורדינטות ה-ROI ברשימת ROI ראשית (ROI master list). לאחר מכן, השתמש ברשימת ה-ROI הראשית כדי למדוד את תגובות התאים מערימות התמונות הגולמיות באמצעות מאקרו שנכתב באופן מותאם ותוסף ה-multi mesure של Image J. לבסוף, שרטט את עקומות התגובה ומפת חום ב-matlab.מוצגת כאן דוגמה לניסוי דימוי של ה-VNO באמצעות דגימות שתן שנאספו מארבעה עכברים בודדים. כ-80 תאים מראים תגובה לפחות לאחד מגירויי השתן, וערכי ה-delta F חלקי F של התגובה שלהם מוצגים במפת החום. להלן עקומות התגובה של תאים אחד, שני ושלוש, המראות את מהלך ההפעלה על ידי גירויי השתן; תא אחד מראה תגובה לשני דגימות השתן של הנקבות, אך לא לדגימות של הזכרים.בעוד שתא שני מראה דפוסי הפעלה הפוכים ומגיב לשני הדגימות הזכריות, רק תא שלושה מופעל הן על ידי דגימות זכריות והן על ידי דגימות נקביות בודדות. לאחר המריחה, ניתן להכין את הפרוסה בתוך 30 דקות, וניתן לשמור על נוירוני הפסנתר חיים במשך שש עד שמונה שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי.בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לזכור להשתמש בריאגנטים בדרגת תרבית רקמה ולהימנע ממגע של ריאגנטים לקיבוע רקמה עם דגימות הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הכנת פרוסות רקמה חיה של פסוריאזיס לצילום תגובות תרמיות בנוירונים של וינה בשימוש בעכברים המבטאים G Camp.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה...

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

סרטון הפרוטוקול מתאר הקמת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירוני החישה של איבר הוומרונסאל (VNO) בעכברים. פרוסת VNO קורונלית עם נוירונים חושיים המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוקמת במערך הקלטה. תא עצב מסומן מתוקן עם פיפטת הקלטה בתצורה של תא שלם לרישום אלקטרופיזיולוגי בתגובה לגירויים כימיים.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

כאן, אנו מתארים גישה פיזיולוגית המאפשרת זיהוי וניתוח מעמיק של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים בפרוסות רקמה קורונלית חריפות של האיבר הוומרונזאלי של העכבר באמצעות רישומי מהדק טלאי של תא שלם.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

למד הכנת פרוסות רקמה חיות לאימות תגובות נוירונים באיבר Vomeronasal בעכברים טרנסגניים המביעים G-CaMP2. שיטת דימות סידן זו מאפשרת ניתוח תבניות תגובה לפירומונים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני האיתות הכימי ביונקים.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

גלה סרטונים נוספים