מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להפעיל מניפולציה על מולקולות DNA קצרות באורך של 100 ננומטרים באמצעות כוחות אופטיים קבועים ומכוילים היטב. פעולה זו מושגת על ידי קיבוע של קצה אחד של ה-DNA לזכוכית כיסוי (cover slip) והקצה השני למיקרו-ספירה של פוליסטירן. לאחר מכן, מיושרים ומכוילים הפינצטים האופטיים.

לאחר מכן, ה-DNA נמתח הרחק מהפני השטח באמצעות שילוב של כוחות מדרג (gradient forces) וכוחות פיזור (scattering forces) הפועלים על המיקרוספירה. לבסוף, ה-DNA מוארך על ידי לכידת החרוז באזור הליניארי של הפוטנציאל. הפרוטוקול שימש למחקר של תכונות מכניות של DNA וקינטיקה של קישור בין DNA לחלבון, והיה מועיל עוד יותר בהבהרת חשיבותן של תנאי השפה על גמישותן של מבני DNA קצרים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקלו בקשיים, כיוון שהיישור והכיול של המלקחיים האופטיים בעלי הכוח הקבוע הם קשים ומורכבים. המלקחיים האופטיים כוללים קרן מלייזר של 1064 nanometer המפוצלת לשתי קרניים בעלות קיטוב אורתוגונלי. אחת משמשת למניפולציה של הביומולקולה והשנייה משמשת למטרות כיול.

עוצמתו של קרן המניפולציה נשלטת על ידי מפני אותי אקוסטי-אופטי (AO optic deflector) או מפני אופטי (OD). לאחר מכן, הקרניים מועברים שוב דרך מפצל קרניים מקטב נוסף. הקרניים ממוקדות באופן הדוק על תא הדגימה באמצעות עדשת מיקרוסקופ מסוג plan APO 60 x 1.4 בטבילת שמן. מערך פינצטה זה משולב עם מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) שנבנה במעבדה, המספק תאורה מנורת הלוגן הממוקדת על תא הדגימה באמצעות קונדנסור.

תמונת השדה המואר (bright field) מופרדת מאור הלייזר על ידי מראה דיכרואית ולאחר מכן מוקרנת על שתי מצלמות CCD. מצלמת CCD אחת משמשת כאמצעי העיקרי לרכישת נתונים והיא מופעלת על ידי תוכנה כדי להבטיח קצבי דגימה מדויקים. מצלמת ה-CCD השנייה משמשת להדמיה של מיקרו-ספירה אחת קבועה המשמשת כנקודת ייחוס, שמיקומה משמש כמערכת בקרה למשוב כדי לפצות על סחיפה (drift) במיקרוסקופ.

הדגימה ממוקמת באופן גס ביחס לעדשה ההודפית באמצעות במה מסוג XY, ולאחר מכן ניתן למקם אותה בדיוק רב באמצעות במת פייסו (piso) תלת-ממדית מוטמעת. אור הלייזר המפוזר קדימה והמועבר נאספים על ידי קונדנסור שדה בהיר וממוקדים אל גלאי פוטוני כדי לכייל את גודל החבב; טענו תא דגימה עם תמיסה מפוזרת של מיקרוסpheres פוליסטירן בעקבי קוטר של 800 nanometer המדוללים בבופר סליין פוספטי. הניחו למערכת לנוח במשך 10 עד 15 דקות ולאחר מכן שטפו קלות עם בופר.

כדי להסיר מיקרוספירות עודפות, איתרו מיקרוספירה הדבקה באופן אקראי לזכוכית הכיסוי וכווןו את גובה תא הדגימה עד שהמיקרוספירה תהיה כ-1 µm מתחת למיקוד. כדי להפיק תמונה מחוץ למיקוד (defocused image) למדידת הגודל הנראה של התמונה באמצעות LabVIEW, מצאו תחילה את מרכזה של המיקרוספירה באמצעות פונקציית התאמת תבניות גיאומטרית. לאחר מכן, הפקו פרופיל עוצמה רדיאלי של המיקרוספירה על ידי ביצוע ממוצע של 360 מעלות.

סביב מרכזו של כל חתך, התאימו את הפרופיל הרדיאלי, המתבטא כטבעת לבנה בכל אחת מתמונות השדה הבהיר, באמצעות פונקציה ריבועית. כדי למצוא את שיא הבהירות, ניתן להשתמש במרחק שבין שיא זה למרכז כמדד לגודל הנראה של החרוז. בעזרת במת ה-piso המכוילת, הגבירו בהדרגה את המיקום האקסיאלי של המיקרוספירה ורכשו תמונה בכל מיקום אקסיאלי באמצעות מצלמת ה-CCD. חזרו על ניתוח התמונה עבור כל תמונה עוקבת כדי להקריל את הגודל הנראה של המיקרוספירה עם מיקומה האקסיאלי.

הרזולוציה האקסית המתקבלת בשיטה זו היא כ-1.4 nanometers. כדי למפות את הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה, התחילו ביישור קולניארי של קרן המניפולציה וקרן הכיול כאשר קרן המניפולציה כבויה. כלאו מיקרוספירה חופשית בתוך המלכוד הקשיח בהרבה של קרן הכיול. כעת, הדליקו את קרן המניפולציה.

מכיוון שקרן זו חלשה בהרבה מקרן הכיול, המיקום הצירים של המיקרוספירה יסתה קלות. ניתן למדוד את השינוי הנובע מכך במיקום הצירים מתמונות שטח בהיר (bright field) מחוץ למיקוד, כפי שתואר כבר. העבירו את מיקוד הציר וחזרו על הפעולה; שרטטו את ההעתקה delta X אל מול מיקום הציר של מיקוד קרן הכיול.

המיקום האקסיאלי המתאימה להעתקה הגדולה ביותר של המיקרוספירה קובע את מרכז האזור הליניארי של המלכוד האופטי. עבור מתיחה של דגימת DNA, התקינו את התא המכיל מולקולות DNA המקובעות לפני השטח, ובזמן צפייה בתמונת השדה המואר (bright field), מקמו את המוקד של קרן המניפולציה מעט מעל המיקרוספירות הבלתי מתוחות באמצעות כיוון הטלסקופ, ולאחר מכן כווננו את מיקום הבמה עד שמיקרוספירה אחת נלכדת. מקמו בקירוב את המיקרוספירה במרכז מישור ה-XY של המלכוד האופטי, צרו סדרה של גלי ריבוע ב-lab view ושלחו אותם ל-A OD כדי להדליק ולכבות את קרן הלייזר באופן חוזר.

צפו במיקרוספירה בעוד המלכוד מופעל ומכובה שוב ושוב. שימו לב האם הלייזר גורם לכיוון מועדף לתנועת המיקרוספירה בזמן התאמה חזרנית של מיקום המיקרוספירה הן בציר X והן בציר y. באמצעות בקרת במת ה-piso, התנועה האקראית של המיקרוספירה אמורה להפוך לאיזוטרופית במישור X-y, אם כי תהיה מוגבלת באופן ניכר כאשר הלייזר פועל.

בשלב הבא, יישרו את החרוז בציר Z. שוב, הפעילו את קרן הלייזר בפולסים (הדלקות וכיבויים), כשבפעם זו מדדין בו-זמנית את התזוזה האקסיאלית של המיקרוספירות בזמן אמת.

מרכזו את הבמה בתוך האזור הליניארי, שהוא הנקודה שבה נתוני ה-Z הגדולים ביותר עבור מתיחת ה-DNA ramp, את עוצמת הלייזר על ידי שליחת אות מתח ל-A OD מאפס וולט עד 0.5 וולט בצעדים של 0.025 וולט בכל שלב. הקלט 400 פריימים בקצב של 100 פריימים לשנייה ובצע להם מיצע כדי לקבל את ההעתקה האקסיאלית. לבסוף, שרטט את עקומות הכוח-מתיחה והתאם אותן למודל שרשרת דמוית תולעת (worm-like chain) משופר.

מוצגות כאן עקומות כוח-מתיחה עבור רצפי NA דו-ממדיים, באורך של 1, 298 זוגות בסיסים ו-247 זוגות בסיסים עבור מקטעים קצרים של DNA. מודל השרשראת הדמוית-תולעת (WLC) הקונבנציונלי אינו מסביר באופן מלא את הקשר בין הכוח למתיחה, מכיוון שבסדרי גודל אלו, יש להביא בחשבון השפעות של גודל סופי ומתיחה באפס כוח הנובעת מאילוצי גבול. לכן, יש להתאים את מדידות הכוח-מתיחה באמצעות מודל WLC שונה, הכולל אורך התמדה אפקטיבי ומתיחה באפס כוח כפרמטרי התאמה המתוארים בהרחבה בחומרי העזר.

עבור אורכי קונטור גדולים של D-S-D-N-A, אורך ההתמדה האפקטיבי הוא פשוט אורך ההתמדה הנומינלי של כ-50 nanometers, וניתן להזניח את המתיחה באפס כוח מהתאמות WLC המעודכנות. אורכי ההתמדה האפקטיביים הם 35 nanometers עבור ה-DNA בעל 298 base pair, ו-25 nanometers עבור DNA בעל 247 base pair לאחר פיתוחו. שיטה זו סללה את הדרך למגוון של מדידות ננו-מכניות של DNA ושל קומפלקסים של DNA וחלבון, כולל מחקר של קינטיקת ההיווצרות והפירוק של לולאות DNA המתווכות על ידי חלבונים רגולטוריים.