מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפעיל מניפולציה על מולקולות DNA קצרות באורך 100 nanometers באמצעות כוחות אופטיים קבועים ומכוילים היטב. דבר זה מושג על ידי קישור של קצה אחד של ה-DNA לזכוכית כיסוי (cover slip) והקצה השני למיקרוספירה של פוליסטירן. לאחר מכן, המלקחים האופטיים (optical tweezers) מיושרים ומכוילים.

לאחר מכן, ה-DNA נמתח הרחק מהמשטח באמצעות שילוב של כוחות גרדיאנט וכוחות פיזור הפועלים על המיקרו-ספירה. לבסוף, ה-DNA מוארך על ידי לכידת החרוז באזור הליניארי של הפוטנציאל. הפרוטוקול שימש למחקרי תכונות מכניות של DNA וקינטיקה של קישור חלבונים ל-DNA, והיה יעיל בנוסף בבירור חשיבותן של תנאי השפה על גמישותם של מבני DNA קצרים.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהיישור והכיול של המלקחיים האופטיים בעלי הכוח הקבוע הם קשים ומורכבים. המלקחים האופטיים כוללים קרן מלייזר בעל אורך גל של 1064 nanometer המפוצלת לשתי קרניים בעלות קיטוב אורתוגונלי. אחת משמשת למניפולציה של הביומולקולה והשנייה משמשת למטרות כיול.

עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי מסיט אופטי AO או OD. לאחר מכן, הקרניים מאחדות שוב באמצעות מפחית קרניים מקטב נוסף. הקרניים ממוקדות באופן הדוק על תא הדגימה באמצעות עדשת מיקרוסקופ עם טבילה בשמן plan APO 60 x 1.4. מערך פינצטה זה משולב עם מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) שנבנה במעבדה, המספק תאורה מנורת הלוגן הממוקדת על תא הדגימה באמצעות קונדנסור.

תמונת השדה המואר מופרדת מאור הלייזר על ידי מראה דיכרואית ואז מדומה על שתי מצלמות CCD. מצלמת CCD אחת משמשת כאמצעי העיקרי לרכישת נתונים ומופעלת על ידי תוכנה כדי להשיג קצבי דגימה מדויקים. מצלמת ה-CCD השנייה משמשת לדמיון של מיקרוספירה אחת קבועה המשמשת כנקודת ייחוס, שמיקומה משמש כמערכת בקרת משוב כדי לפצות על סחף במיקרוסקופ.

הדגימה ממוקמת במיקום גס ביחס לעדשה אובייקטיבית באמצעות במה מסוג XY, ולאחר מכן ניתן למקם אותה באופן מדויק באמצעות במת piso תלת-ממדית מוטמעת. אור הלייזר המפוזר קדימה והמועבר נאספים על ידי קונדנסור שדה בהיר וממוקדים אל גלאן פוטו כדי לכייל את גודל החלקיק, טען תא דגימה עם תמיסה מפוזרת של מיקרו-כדורי פוליסטירן בקוטר 800 nanometer המדוללים במיlighter phosphate buffered saline. הנח לדגימה לנוח במשך 10 עד 15 דקות ולאחר מכן שטוף קלות בבופר.

כדי להסיר מיקרוספירות עודפות, אתרו מיקרוספירה שנדבקה באופן אקראי לזכוכית הכיסוי והתאימו את גובה תא הדגימה עד שהמיקרוספירה תהיה בערך מיקרומטר אחד מתחת למיקוד. כדי להפיק תמונה מחוץ למיקוד (defocused) למדידת הגודל הנראה של התמונה באמצעות LabVIEW, מצאו תחילה את מרכז המיקרוספירה באמצעות פונקציית התאמת תבניות גיאומטרית. לאחר מכן, הפקו פרופיל עצימות רדיאלי של המיקרוספירה על ידי ביצוע ממוצע של 360 מעלות.

סביב המרכז של כל חתך רוחב, התאימו את הפרופיל הרדיאלי, התואם לטבעת לבנה בכל אחת מתמונות השדה הבהיר, באמצעות פונקציה ריבועית. כדי למצוא שיא בהירות, ניתן להשתמש במרחק בין שיא זה למרכז כמידה לגודל הנראה של החרוז. באמצעות במת piso מכוילת, הגבירו בהדרגה את המיקום הציריי של המיקרוספירה ורכשו תמונה בכל מיקום צירי באמצעות מצלמת ה-CCD. חזרו על ניתוח התמונות עבור כל תמונה עוקבת כדי להקרין את הגודל הנראה של המיקרוספירה אל מול מיקומה הצירי.

הרזולוציה האקסית שהושגה בשיטה זו היא כ-1.4 nanometers. כדי למפות את הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה, התחילו ביישור קו (coline) של קרן המניפולציה וקרן הכיול כאשר קרן המניפולציה כבויה. כלאו מיקרוספירה חופשית בתוך המלכוד הקשיח הרבה יותר של קרן הכיול. כעת הדליקו את קרן המניפולציה.

מכיוון שהוא חלש בהרבה מקורת הכיול, המיקום האקסיאלי של המיקרו-ספירה יסתומם קלות. ניתן למדוד את השינוי הנובע מכך במיקום האקסיאלי מתמונות שדה בהיר מחוץ למיקוד (defocused bright field), כפי שתואר לעיל. הסיטו את המיקוד האקסיאלי וחזרו על הפעולה; שרטטו את דלתת ההעתקה delta X אל מול המיקום האקסיאלי של מיקוד קורת הכיול.

המיקום הצירים המתאים להעתקה הגדולה ביותר של המיקרוספירה קובע את מרכז האזור הליניארי של המלכוד האופטי. עבור מתיחה של דגימת DNA, התקן את התא המכיל מולקולות DNA קשורות לפני השטח, ובזמן צפייה בתמונת שדה בהיר (bright field), מקם את מיקוד קרן המניפולציה מעט מעל המיקרוספירות שאינן מתוחות על ידי כיוון הטלסקופ, ולאחר מכן כוון את מיקום הבמה עד שמיקרוספירה אחת נלכדת. מקם באופן גס את המיקרוספירה במרכז מישור ה-XY של המלכוד האופטי, צור סדרה של גלי ריבוע ב-LabVIEW ושלח אותם ל-AOD כדי להדליק ולכבות את קרן הלייזר באופן מחזורי.

צפו במיקרוספירה בזמן שהמלכוד מופעל ומכובה שוב ושוב. שימו לב אם הלייזר גורם לכיוון מועדף לתנועת המיקרוספירות בעודכם מכוונים באופן איטרטיבי את מיקום המיקרוספירה הן בציר ה-X והן בציר ה-y. באמצעות בקרת במת הפיזו (piso stage), התנועה האקראית של המיקרוספירה אמורה להפוך לאיזוטרופית במישור X-y, אם כי תהיה מוגבלת באופן ניכר כאשר הלייזר פועל.

בשלב הבא, יישרו את החרוץ בכיוון ציר Z. שוב, הפעילו את קרן הלייזר בפולסים (הדלקות וכיבויים), כאשר הפעם מדדו בו-זמנית את התזוזה האקסיאלית של המיקרוספירות בזמן אמת.

מרכז את הבמה בתוך האזור הליניארי, שהוא הנקודה שבה הסטה ב-Z היא הגדולה ביותר עבור מתיחת רמפת ה-DNA, את עוצמת הלייזר על ידי שליחת אות מתח ל-A OD מאפס וולט עד 0.5 וולט במדרגות של 0.025 וולט בכל שלב. הקלט 400 פריימים בקצב של 100 פריימים לשנייה ובצע להם ממוצע כדי לקבל את ההסטה האקסית (axial). לבסוף, שרטט את עקומות הכוח-מתיחה והתאם אותן למודל שרשרת דמוית תולעת (worm-like chain model) משונה.

מוצגות כאן עקומות כוח-מתיחה עבור רצפי NA דו-ממדיים, באורך של 1, 298 ו-247 זוגות בסיסים עבור מקטעים קצרים של DNA. מודל השרשרת דמוית התולעת (WLC) הקונבנציונלי אינו מסביר במלואו את הקשר בין הכוח למתיחה, כיוון שבסדרי גודל אלו יש להתחשב בהשפעות של גודל סופי ובמתיחה באפס כוח הנובעת מאילוצי שפה. לפיכרון, יש להתאימה את מדידות הכוח-מתיחה באמצעות מודל WLC משופר, הכולל אורך התמדה אפקטיבי ומתיחה באפס כוח כפרמטרי התאמה, המתוארים בהרחבה בחומרי ההשלמה.

עבור אורכי קונטור גדולים של D-S-D-N-A, אורך ההתמדה האפקטיבי הוא פשוט אורך ההתמדה הנומינלי של כ-50 nanometers, וניתן להזניח את ההארכה באפס כוח מהתאמות WLC המעובדות. אורכי ההתמדה האפקטיביים הם 35 nanometers עבור DNA של 1,298 base pair, ו-25 nanometers עבור DNA של 247 base pair לאחר פיתוחו. שיטה זו סללה את הדרך למגוון של מדידות ננו-מכניות על DNA ועל קומפלקסים של DNA-חלבון, כולל מחקר על קינטיקת ההיווצרות והפירוק של לולאות DNA המתווכות על ידי חלבון רגולטורי.