Name: מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד כיצד למתוח מולקולות DNA קצרות באורך של כ-100 ננומטר באמצעות פינצטה אופטית קבועה בכוח. השיטה מאפשרת חקר תכונות מכניות של DNA וקינטיקת קישור חלבונים תוך מזעור הפרעות סטריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר Yih-Fan חן לעזרה עם פינצטה האופטית הצירית ותורם לחלק מהנתונים של מתיחתו לכתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי מענק NSF PHY-0957293 ולהתמקד מענק PHY-0114336.

1. פינצטה התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלומת ליזר מננומטר 1064 מחולקת לשתי אלומות orthogonally מקוטבות. אחד משמש כדי לתפעל את biomolecule ואילו השני משמש למטרות כיול (ראה איור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי הטיה acousto אופטית (AOD), ואילו מעמדו וההתמקדות של כל קרן נשלט באופן עצמאי על ידי ההיגוי מראה קורה וטלסקופים אופטיים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורות מכן recombined עם מפצל עוד קרן קיטוב והתנו נוספים על ידי קבוצה סופית של אופטיקה המתקפלת מעט ימלא יותר מדי את הצמצם האחורי של מטרת מיקרוסקופ. תמלא יותר מדי 50% לקרן הכיול מוביל למלכודת אופטית הדוקה, בעוד גורם מעט קטן לקורת המניפולציה, כ 20%, נותן דגש רדוד שמיתרגם אזור עביד גדול יותר של הפוטנציאל לינארי. הקורות מתמקדות בחוזקה על ידי obj PlanApo 60x/1.4 שמן טבילת מיקרוסקופective אל תא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת פינצטה זה בשילוב עם מיקרוסקופ הבית נבנה brightfield המספק תאורה ממנורת הלוגן הממוקד על תא המדגם על ידי קבל. תמונת brightfield מופרדת מאור הליזר על ידי מראה Dichroic ולאחר מכן צלמה בשתי מצלמות רגילות. אחד מעשי CCD כאמצעי העיקרי שלנו לרכישת נתונים ותוכנה מופעלת שיביא לשיעורי דגימה מדויקים, ואילו שני CCD משמש לתמונה אחת microsphere תקוע התייחסות תפקידו משמש כמערכת משוב בקרה כדי לפצות על היסחפות במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם ממוקם גס ביחס למטרה על ידי במת XY, ואז יכול להיות ממוקם בדיוק על ידי 3 פייזו שלב ממדי מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור הליזר קדימה המפוזר ומועבר נאסף על ידי קבל brightfield וממוקד על photodetector. האות המתקבלת היא מסוננת דרך מסנן אנטי-aliasing ב 100 קילוהרץ, מוגבר וcquired ב 200 קילוהרץ באמצעות כרטיס DAQ. </li></ol> 2. כיול גודל גלוי של החרוז למיקום צירי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען קאמרי מדגם 9 עם פיזור הפתרון של 800 ננומטר קוטר הקלקר microspheres דילול בפוספט נאגר מלוח. תן לו לשבת במשך 10-15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם חיץ קל להסיר microspheres העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר microsphere התקוע באקראי לcoverglass ולהתאים את הגובה של חדר הדגימה עד microsphere הוא כ 1 מיקרומטר מתחת למוקד כדי ליצור תמונה מטושטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את גודלו הנראה של התמונה, ראשון למצוא מרכז microsphere באמצעות הדגם הגיאומטרי התאמת פונקציה בLABVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, ליצור פרופיל עוצמת הרדיאלי של microsphere על ידי ממוצעים של ° 360 על מרכזו של כל חתך. פרופיל רדיאלי, אשר תואם את הטבעת לבנה בכל אחת מתמונות brightfield, יכול להיות מצויד עם פונקציה ריבועית למצואשיא בהירות. מרחק בין השיא הזה והמרכז יכול לשמש כמדד לגודלו הנראה של החרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש piezostage המכויל, להגדיל בהדרגה את העמדה הצירית של microsphere ולרכוש תמונה בכל עמדה צירית עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הניתוח של כל תמונה ברציפות כדי לתאם את גודלו הנראה של microsphere עם המיקום הצירי שלה (ראה איור. 3). הרזולוציה הצירית מתקבלת על ידי שיטה היא כ -1.4 ננומטר 7. </li></ol> 3. מיפוי הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין על ידי יישור קורה המניפולציה וקרן כיול collinearly. קרן הכיול צריכה להיות סביב 50 mW בפתח האחורי של המטרה ואילו קרן המניפולציה צריכה להיות הרבה יותר חלשה, יניח 10 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קרן המניפולציה כבויה, להגביל microsphere חינם בתוך המלכודת הרבה יותר הנוקשה של קורה הכיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, הפעל את מאניקרן pulation. מאז קרן המניפולציה היא חלשה בהרבה מקורה הכיול, העמדה הצירית של microsphere תהיה מעט מוטרדת. כתוצאה מכך לשנות את העמדה צירית ניתן למדידה מתמונות brightfield defocused כפי שכבר תארו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את קורה מניפולציה ועם microsphere עדיין לכוד בקרן הכיול, להעביר את המיקוד הצירי של קרן הכיול על ידי התאמת העדשה טלסקופית. הפעל את קרן המניפולציה, למדוד את העקירה הבאה של microsphere וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ΔX ההתקות ניתן להתוות נגד העמדה הצירית של המיקוד של קרן הכיול. התפקיד המקביל לתזוזה הגדולה ביותר של microsphere הצירי קובע מרכז אזור יניארית של המלכודת האופטית (ראה איור. 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב האחרון בקבלת הכח האופטי של קרן המניפולציה כפונקציה של מיקום צירי דורש מדידה קפדנית של הנוקשות שלקרן כיול. כדי להשיג את זה, להעביר את microsphere, נלכד על ידי קרן הכיול, לכ מיקרומטר מעל פני השטח על ידי התאמת העדשה טלסקופית תוך קורה המניפולציה כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את התנועה הצירית התרמית של microsphere על ידי מדידת עוצמת האור מועבר עם photodetector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Autocorrelation של האות ניתן להתאים לפונקצית דעיכה מעריכית יחידה לתת את הזמן המתמיד של התנודות,. Τ z </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדם החיכוך הידרודינמית ζ, של microsphere ניתן לתקן לקרבת microspheres ל5,10 שטח. הנוקשות של מלכודת כיול אז ניתן על ידי κ (ראו חומרים משלימים ו-B) z = ζ / τ z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידיעת הנוקשות של מלכודת הכיול מאפשרת לאדם להמיר את ההתקות הציריות נמדדו בעבר בכוח ƒ z = κ z אינטגרצית ΔX של thiשל עקום תשואות מיפוי מרחבים של הפוטנציאל האופטי הצירי של קרן המניפולציה (ראה איור. 4). </li></ol> 4. מתיחת דגימת DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרי 9 מולקולות המכילות משטח כבולים DNA (&lt;1 KBP) ובעודו צופה בתמונת brightfield, למקם את המיקוד של אלומת המניפולציה מעט מעל microspheres unstretched ידי התאמת טלסקופ. ואז להתאים את המיקום של הבמה עד שאחד מmicrospheres לכודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערך למקם microsphere במרכז מטוס XY של המלכודת האופטית. לייצר סדרה של גלים מרובעים בLabVIEW ולשלוח אותם לAOD שוב ושוב להפוך את קרן הליזר וכיבוי. זהירות לשלוט על עוצמת הליזר ואת משך הזמן של המדינה על מנת למנוע חימום של חדר המדגם. בדרך כלל, להשתמש סביב 2 mW של ליזר כוח (נמדד בפתח האחורי של אובייקטיבי) ולשלוח פולסים של 200 מילישניות (ב) ו500 מילים (כבוי). המשרעת של הכיכר wשד 'נשלח לAOD צריך להיות סביב 0.5 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה microsphere כמלכודת פנתה שוב ושוב לסירוגין ולשים לב אם הליזר גורם לכל כיוון מועדף לתנועה של microsphere. בעוד ערוך את התאמת עמדת microsphere בשניהם X ו Y הכיוון, על ידי שליטה על piezostage, התנועה האקראית של microsphere צריכה להיות איזוטרופי במישור XY, אם כי מוגבלת במידה ניכרת כאשר הליזר מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, ליישר את החרוז בכיוון Z. שוב דופק את קרן הליזר וכיבוי בזמן, הפעם, במקביל למדידת תזוזת microspheres הצירי בזמן אמת. מרכז הבמה באזור ליניארי, המהווה את הנקודה שבה עקירת Z היא גדולה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יישור זהיר בכיוון Z, זה הכרחי כדי לבדוק שהמלכודת עדיין מרוכזת במישור XY. אם יישור XY השתנה, יש לחזור על שניהם XY ויישור Z עד microsphere מרוכז כראוי לאורך כל שלושצירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתיחת ה-DNA, להגביר את עוצמת הליזר על ידי שליחת אות מתח לAOD, בין 0 ל 0.5 V V בצעדים של 0.025 V. בכל שלב, שיא 400 מסגרות ב100 FPS והממוצעים להשיג עקירה הצירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העקומות המאריכות הכח עכשיו ניתן להתוות ותתאמנה למודל modified WLC 11 (ראה חומרים משלימים B). </li></ol> 5. נציג תוצאות: אנו מציגים עקומות הארכת תוקף למשך רצפי DNA: 1298 BP ורצף 247 נ"ב, האחרון להיות רצף הקצר ביותר שהצלחנו למתוח reproducibly. לפרקים קצרים של דנ"א, השרשרת הקונבנציונלית דמוית תולעת (WLC) מודל אינו מסבירה באופן מלא את יחסי הארכת התוקף כי בסולמות אורך אלה יש להסביר תופעות סופית בגודל ובהארכת תוקף אפס נובעת מאילוצי גבול. המדידות המאריכות הכח, ולכן, צריכות להיות בכושר תוך שימוש במודל שונה WLC שיש effective אורך התמדה וסיומת כוח אפס כפרמטרים לנכון, שתוארו בהרחבה בחומרים המשלימים. עבור אורכי גובה גדולים של dsDNA, אורך ההתמדה היעיל הוא פשוט האורך הנומינלי ההתמדה (~ 50 ננומטר) וסיומת הכח אפס יכול להיות מוזנחת. עם זאת, כאורך קווי המתאר מתקצר אורך ההתמדה האפקטיבית פוחת הרבה מתחת 50 ננומטר ו-DNA, גם בכוח אפס, מראה הרחבה משמעותית. את הנתונים ואת ההתקפים המקבילים של עקומי המאריכים הכח מוצגים באיור. 5 עבור שני הרצפים. מעדכון WLC המתאים, קבע את אורכי ההתמדה היעילים להיות 35 ננומטר ל1298 BP-DNA ו25 ננומטר לדנ"א 247 נ"ב. לשם המחשה, אנו מציגים אמצעים יחידים של העקומות המאריכות הכח לכל רצף. בפועל, אפשר הייתה לחזור על המדידות מספר פעמים ולקבל את התוצאות הממוצעות יחד עם סטיות ההתקן. זה חייב גם לציין thaלא לאחר הקבלה כל עקומה זה הכרחי כדי להבטיח שנשאר לכודי microsphere וממוקם כראוי בתוך אזור יניארית, אחרת microsphere יש realigned כפי שתואר לעיל בפרוטוקול. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> עיקרון איור 1 מתוך פינצטה אופטית צירית. (שמאל) מלכודת פינצטה אופטית קונבנציונלית קרובה למוקד. החרוז ולאחר מכן עבר לרוחב לcoverslip להפעיל מתח. (מימין) בפינצטה אופטית צירית, microsphere לכוד הרחק מהפוקוס, באזור ליניארית של הפוטנציאל האופטי. בתצורה זו, הפולימר מתקיים במתח מתמיד למגוון סיומות. יתר על כן, להגדיל את עוצמת הליזר נע microsphere בכיוון הצירי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> ייצוג סכמטי של איור 2מלקט צירי אופטי ליזר אור (1064nm Nd: YvO 4). מחולק לשתי אלומות על ידי עובר דרך מקטב האלומה ספליטר (PBS). קרן המניפולציה, עוברת דרך הטיה acousto אופטית (AOD) וקרן הכיול יכולה להיות מותאמת באופן עצמאי באמצעות עדשות טלסקופיות. שתי הקורות מכן recombined שימוש אחר PBS וממוקד על ידי המדגם אובייקטיבי NA גבוה. במקביל, brightfield תאורה משמשת למעקב microsphere, עובר דרך הדגימה, הוא אינפרא אדום (IR) המסונן ולאחר מכן הוא צלם בשתי מצלמות, אחת מהן לוקחת מדידות ואילו מעשים האחרים, כחלק ממערכת בקרת משוב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור כיול מיקום 3 צירי. כדי לכייל את העמדה הצירית, אנו לרכוש תמונות מטושטשות של חרוז הדבוק לcoverslip הקאמרי בשינוי עמדות ציריות של הבמה. הגודל של מייקרוphere ניתן על ידי את המרחק בין המרכז שלה ועמדתה של עוצמת שיא על הטבעת הבהירה נוצרה סביב דמותו של microsphere. ההבלעה מציגה את התפלגות העוצמת הרדיאלי אשר נותנת את הגודל של החרוז. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4 עיקרון מאחורי מיפוי הפוטנציאל האופטי. כדי למפות את הכח האופטי של קרן המניפולציה, העקירה הצירית שהוא גורם בmicrosphere לכוד בתוך אלומת כיול הרבה יותר חזקה נמדדת. מרכז אזור יניארי שבו ההעברה הזאת מקסימום הוא ממוקם. החיל האופטי לעומת עקומת עמדה צירית יכול להיות משולב כדי למצוא את הפוטנציאל האופטי. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> Curve האיור 5 חיל הארכה. נתונים יוצג למשך 1298 נ"ב אקראי ו247 BP (הבלעה) segmenלא של dsDNA נמתח על ידי פינצטה אופטית צירית. נקודתי הנתונים שתתאמנה לעדכון WLC המודל של משוואה. 3 (קווים מלאים) והניבו אורכי התמדה אפקטיביות של 34 ננומטר ו 25 ננומטר לבהתאמה 1298bp ו247bp.

<ol><li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li>
<li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loops+in+DNA%3A+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Phys.+J.+E.+Soft.+Matter%22%5BJournal%5D)">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li>
<li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA%3A+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li>
<li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li>
<li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li>
<li>Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Meiners+Lab%22">Meiners Lab</a>. , University of Michigan. (2011).</li>
<li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule%2C+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li>
<li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פינצטה אופטית קונבנציונלית להסתמך על משוב או אנלוגי או מבוקר מחשב להפעיל כוח קבוע על אובייקט refractile. מערכות משוב פעילים אלו יש קושי בביצוע בתנאים שבו שינויים פתאומיים בהארכה את הדגימה מתרחשים, למשל, מההתקשרות של חלבון ל-DNA או הקפיצה המהירה של מנוע מולקולרי לאורך חוט. שיטות פסיביות שונות להחלת כוחות קבועים שלאחרונה פותחו. שיטה אחת כזו, המשמשת כדי לפתור את הקפיצה של RNA פולימראז ברזולוצית basepair, מעורבת עובדת בתוך האזור ליניארית של הפוטנציאל האופטי של גאוס ליזר 12 ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Nd: ליזר YVO4 </td><td> ספקטרה פיסיקה </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto אופטי מטה הטיה </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> מטרת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> PlanApo </td><td> 60x, 1.4 NA </td></tr><tr><td> שלב Piezo </td><td> מעבדות עיר מטורפות </td><td> Nano-LP100 </td><td> שלב XYZ </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodetector </td><td> אלקטרו אופטיקה טק </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי פוליסטירן </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin מצופה </td></tr><tr><td> אנטי digoxigenin </td><td> רוש </td> 11333089001 <td> מכבשים </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG אופרון </td><td> oligos המותאם אישית </td><td> פריימר אחד: ביוטין אחר: digoxigenin </td></tr><tr><td> ריאגנטים PCR </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> פולימראז תקי, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כימיקלים אחרים עבור בלם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> חומרים משלימים מקדם חיכוך הידרודינמית א לקביעת מקדם החיכוך הידרודינמית של microsphere ליד משטח אחד ישתמש ב5,10 ההרחבה הבא: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="משוואה 1"> שם קיצור השעות הבאותכפי שהציג: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="משוואה 2"> מקדם החיכוך מוגדר במונחים של את צמיגות נוזל η והרדיוס של microsphere, עם המרכז של microsphere ממוקם מרחק η מעל פני השטח. הסיכום מתכנס סביר כאשר התרחבו לכ 10 מונחים. השפעה על מצב ב 'צירי על כיול נוקשות הכיול של קשיחות המלכודת כרוכה איזון בין דיוק הכיול, אשר מגביר במרחק גדל והולך משטח, והעמדה הצירית האמיתית שבו המלכודת משמשת בניסוי. באופן כללי, המלכודת מכוילת בסביבות 800-1000 ננומטר מהמשטח, שהוא גבוה יותר מתנאי הניסוי בפועל. ג השתנה שרשרת דגם דמוי תולעת (WLC) העקומות המאריכות הכח ניתן להתאים לעדכון WLC מ 'אודל, שמסביר את תופעות הדרת נפח בכוח אופטי אפס כדלקמן: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="משוואה 3"> כאשר F הוא כוח opt האופטי, x o היא פרמטר ראוי להארכת התוקף אפס, x opt הוא ההארכה בכוח, אני הוא אורך קווי המתאר של ה-DNA, ואני * p הוא פרמטר שני לכושר "יעיל "אורך התמדה. F WLC ניתן על ידי המודל הרגיל WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="משוואה 4"> בי ε היא הסיומת-DNA היחסית.

מתיחת רצפים קצרים של dna עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

טכניקות מולקולה בודדה למתיחת DNA של אורכי גובה פחות מkilobase הן כרוכות בקשיים ניסיוניים. עם זאת, מספר רבים של אירועים ביולוגיים מעניינים כגון מחייב היסטון וחלבון בתיווך לולאות של DNA 1,2, מתרחשים בקנה מידת אורך זו. בשנים האחרונות, את התכונות המכאניות של ה-DNA הוכחו לשחק תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים בסיסיים כמו האריזה של ה-DNA לתוך nucleosomes הקומפקטי וסיבי הכרומטין 3,4. ברור, אז זה חשוב להבין את התכונות המכאניות של מותחים קצרה של ה-DNA. במאמר זה, אנו מספקים מדריך מעשי לטכניקת מריטות חוזרת ונשנית מולקולה בודדה אופטית שפתחנו כדי ללמוד את ההתנהגות המכאנית של ה-DNA באורכי גובה זמן הקצר של כמה מאה basepairs. המשוכה העיקרית במתיחת קטעים קצרים של DNA היא שפינצטה אופטית קונבנציונלית נועדה בדרך כלל להפעלת כוח בdirection לרוחב לשלב 5,6, (ראה איור. 1). בגיאומטריה זה, הזווית בין החרוז וcoverslip, כדי שהדנ&quot;א הוא קשור, הופכת תלולה מאוד לדנ&quot;א אורך submicron. העמדה הצירית עכשיו יש בחשבון, שיכול להיות אתגר, ומאז ההארכה גוררת microsphere קרוב יותר לcoverslip, אפקטים סטריים משופרים. יתר על כן, כתוצאה מהסימטריה של microspheres, רחבות לרוחב תפקנה רמות שונות של מומנט עקב סיבוב של microsphere בתוך המלכודת האופטית מאז הכיוון של שינויי הכח תגובתי במהלך ההארכה. שיטות חלופיות לדנ&quot;א submicron מתיחה נתקלות מכשולים הייחודיים משלהם. לדוגמה, מלכודת קורה כפול אופטית מוגבלת למתיחות סביב ה-DNA של גל, שבו השפעות התערבות נקודות בין שתי מלכודות ומפיזור האור בין microspheres מתחילות להוות בעיה משמעותית. החלפה אחת מהמלכודותעם micropipette היית כנראה סובל מאתגרים דומים. בעוד אחד יכול להשתמש ישירות את הפוטנציאל הצירי למתוח את ה-DNA, סכימת משוב פעילה, תהיה צורך להפעיל כוח קבוע ורוחב הפס של זה יהיה מוגבל למדי, במיוחד בכוחות נמוכים. אנו לעקוף בעיות יסוד אלה על ידי משייכת ישירות את ה-DNA מcoverslip באמצעות כוח קבוע הצירית האופטית פינצטה 7,8. זו מושגת על ידי לכידת החרוז באזור ינארית של הפוטנציאל האופטי, שבו הכח האופטי הוא הכח קבוע, אשר יכול להיות מכוון על ידי התאמת כוח הליזר. השמנה באזור יניארי משמשת גם ככוח-מהדק כל אופטי בדנ&quot;א המשתרע על כמעט 350 ננומטר בכיוון הצירי. אנחנו במקביל לפצות על סחיפה תרמית ומכאנית על ידי התאמת העמדה של השלב דק, כך שההתייחסות microsphere הדבוק לcoverslip נשאר באותה העמדה ומיקוד,llowing לתקופת תצפית בלתי מוגבלת כמעט.

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ&quot;א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ&quot;א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

טכניקות של מולקולה אחת למתיחת DNA בעלי אורכי קונטור הפחותים מקילובייס רצופות בקשיים ניסיוניים. עם זאת, רבים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפעיל מניפולציה על מולקולות DNA קצרות באורך 100 nanometers באמצעות כוחות אופטיים קבועים ומכוילים היטב. דבר זה מושג על ידי קישור של קצה אחד של ה-DNA לזכוכית כיסוי (cover slip) והקצה השני למיקרוספירה של פוליסטירן. לאחר מכן, המלקחים האופטיים (optical tweezers) מיושרים ומכוילים.לאחר מכן, ה-DNA נמתח הרחק מהמשטח באמצעות שילוב של כוחות גרדיאנט וכוחות פיזור הפועלים על המיקרו-ספירה. לבסוף, ה-DNA מוארך על ידי לכידת החרוז באזור הליניארי של הפוטנציאל. הפרוטוקול שימש למחקרי תכונות מכניות של DNA וקינטיקה של קישור חלבונים ל-DNA, והיה יעיל בנוסף בבירור חשיבותן של תנאי השפה על גמישותם של מבני DNA קצרים.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהיישור והכיול של המלקחיים האופטיים בעלי הכוח הקבוע הם קשים ומורכבים. המלקחים האופטיים כוללים קרן מלייזר בעל אורך גל של 1064 nanometer המפוצלת לשתי קרניים בעלות קיטוב אורתוגונלי. אחת משמשת למניפולציה של הביומולקולה והשנייה משמשת למטרות כיול.עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי מסיט אופטי AO או OD. לאחר מכן, הקרניים מאחדות שוב באמצעות מפחית קרניים מקטב נוסף. הקרניים ממוקדות באופן הדוק על תא הדגימה באמצעות עדשת מיקרוסקופ עם טבילה בשמן plan APO 60 x 1.4. מערך פינצטה זה משולב עם מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) שנבנה במעבדה, המספק תאורה מנורת הלוגן הממוקדת על תא הדגימה באמצעות קונדנסור.תמונת השדה המואר מופרדת מאור הלייזר על ידי מראה דיכרואית ואז מדומה על שתי מצלמות CCD. מצלמת CCD אחת משמשת כאמצעי העיקרי לרכישת נתונים ומופעלת על ידי תוכנה כדי להשיג קצבי דגימה מדויקים. מצלמת ה-CCD השנייה משמשת לדמיון של מיקרוספירה אחת קבועה המשמשת כנקודת ייחוס, שמיקומה משמש כמערכת בקרת משוב כדי לפצות על סחף במיקרוסקופ.הדגימה ממוקמת במיקום גס ביחס לעדשה אובייקטיבית באמצעות במה מסוג XY, ולאחר מכן ניתן למקם אותה באופן מדויק באמצעות במת piso תלת-ממדית מוטמעת. אור הלייזר המפוזר קדימה והמועבר נאספים על ידי קונדנסור שדה בהיר וממוקדים אל גלאן פוטו כדי לכייל את גודל החלקיק, טען תא דגימה עם תמיסה מפוזרת של מיקרו-כדורי פוליסטירן בקוטר 800 nanometer המדוללים במיlighter phosphate buffered saline. הנח לדגימה לנוח במשך 10 עד 15 דקות ולאחר מכן שטוף קלות בבופר.כדי להסיר מיקרוספירות עודפות, אתרו מיקרוספירה שנדבקה באופן אקראי לזכוכית הכיסוי והתאימו את גובה תא הדגימה עד שהמיקרוספירה תהיה בערך מיקרומטר אחד מתחת למיקוד. כדי להפיק תמונה מחוץ למיקוד (defocused) למדידת הגודל הנראה של התמונה באמצעות LabVIEW, מצאו תחילה את מרכז המיקרוספירה באמצעות פונקציית התאמת תבניות גיאומטרית. לאחר מכן, הפקו פרופיל עצימות רדיאלי של המיקרוספירה על ידי ביצוע ממוצע של 360 מעלות.סביב המרכז של כל חתך רוחב, התאימו את הפרופיל הרדיאלי, התואם לטבעת לבנה בכל אחת מתמונות השדה הבהיר, באמצעות פונקציה ריבועית. כדי למצוא שיא בהירות, ניתן להשתמש במרחק בין שיא זה למרכז כמידה לגודל הנראה של החרוז. באמצעות במת piso מכוילת, הגבירו בהדרגה את המיקום הציריי של המיקרוספירה ורכשו תמונה בכל מיקום צירי באמצעות מצלמת ה-CCD. חזרו על ניתוח התמונות עבור כל תמונה עוקבת כדי להקרין את הגודל הנראה של המיקרוספירה אל מול מיקומה הצירי.הרזולוציה האקסית שהושגה בשיטה זו היא כ-1.4 nanometers. כדי למפות את הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה, התחילו ביישור קו (coline) של קרן המניפולציה וקרן הכיול כאשר קרן המניפולציה כבויה. כלאו מיקרוספירה חופשית בתוך המלכוד הקשיח הרבה יותר של קרן הכיול. כעת הדליקו את קרן המניפולציה.מכיוון שהוא חלש בהרבה מקורת הכיול, המיקום האקסיאלי של המיקרו-ספירה יסתומם קלות. ניתן למדוד את השינוי הנובע מכך במיקום האקסיאלי מתמונות שדה בהיר מחוץ למיקוד (defocused bright field), כפי שתואר לעיל. הסיטו את המיקוד האקסיאלי וחזרו על הפעולה; שרטטו את דלתת ההעתקה delta X אל מול המיקום האקסיאלי של מיקוד קורת הכיול.המיקום הצירים המתאים להעתקה הגדולה ביותר של המיקרוספירה קובע את מרכז האזור הליניארי של המלכוד האופטי. עבור מתיחה של דגימת DNA, התקן את התא המכיל מולקולות DNA קשורות לפני השטח, ובזמן צפייה בתמונת שדה בהיר (bright field), מקם את מיקוד קרן המניפולציה מעט מעל המיקרוספירות שאינן מתוחות על ידי כיוון הטלסקופ, ולאחר מכן כוון את מיקום הבמה עד שמיקרוספירה אחת נלכדת. מקם באופן גס את המיקרוספירה במרכז מישור ה-XY של המלכוד האופטי, צור סדרה של גלי ריבוע ב-LabVIEW ושלח אותם ל-AOD כדי להדליק ולכבות את קרן הלייזר באופן מחזורי.צפו במיקרוספירה בזמן שהמלכוד מופעל ומכובה שוב ושוב. שימו לב אם הלייזר גורם לכיוון מועדף לתנועת המיקרוספירות בעודכם מכוונים באופן איטרטיבי את מיקום המיקרוספירה הן בציר ה-X והן בציר ה-y. באמצעות בקרת במת הפיזו (piso stage), התנועה האקראית של המיקרוספירה אמורה להפוך לאיזוטרופית במישור X-y, אם כי תהיה מוגבלת באופן ניכר כאשר הלייזר פועל.בשלב הבא, יישרו את החרוץ בכיוון ציר Z. שוב, הפעילו את קרן הלייזר בפולסים (הדלקות וכיבויים), כאשר הפעם מדדו בו-זמנית את התזוזה האקסיאלית של המיקרוספירות בזמן אמת.מרכז את הבמה בתוך האזור הליניארי, שהוא הנקודה שבה הסטה ב-Z היא הגדולה ביותר עבור מתיחת רמפת ה-DNA, את עוצמת הלייזר על ידי שליחת אות מתח ל-A OD מאפס וולט עד 0.5 וולט במדרגות של 0.025 וולט בכל שלב. הקלט 400 פריימים בקצב של 100 פריימים לשנייה ובצע להם ממוצע כדי לקבל את ההסטה האקסית (axial). לבסוף, שרטט את עקומות הכוח-מתיחה והתאם אותן למודל שרשרת דמוית תולעת (worm-like chain model) משונה.מוצגות כאן עקומות כוח-מתיחה עבור רצפי NA דו-ממדיים, באורך של 1, 298 ו-247 זוגות בסיסים עבור מקטעים קצרים של DNA. מודל השרשרת דמוית התולעת (WLC) הקונבנציונלי אינו מסביר במלואו את הקשר בין הכוח למתיחה, כיוון שבסדרי גודל אלו יש להתחשב בהשפעות של גודל סופי ובמתיחה באפס כוח הנובעת מאילוצי שפה. לפיכרון, יש להתאימה את מדידות הכוח-מתיחה באמצעות מודל WLC משופר, הכולל אורך התמדה אפקטיבי ומתיחה באפס כוח כפרמטרי התאמה, המתוארים בהרחבה בחומרי ההשלמה.עבור אורכי קונטור גדולים של D-S-D-N-A, אורך ההתמדה האפקטיבי הוא פשוט אורך ההתמדה הנומינלי של כ-50 nanometers, וניתן להזניח את ההארכה באפס כוח מהתאמות WLC המעובדות. אורכי ההתמדה האפקטיביים הם 35 nanometers עבור DNA של 1,298 base pair, ו-25 nanometers עבור DNA של 247 base pair לאחר פיתוחו. שיטה זו סללה את הדרך למגוון של מדידות ננו-מכניות על DNA ועל קומפלקסים של DNA-חלבון, כולל מחקר על קינטיקת ההיווצרות והפירוק של לולאות DNA המתווכות על ידי חלבון רגולטורי.

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

פינצטה המגנטית, טכניקת מניפולציה מולקולה בודדת חזקה, יכולה להיות מותאמת למדידות הישירות של טוויסט (שימוש בתצורה הנקראת באופן חופשי, המקיף פינצטה המגנטית) ומומנט (באמצעות תצורה כינתה פינצטה מומנט מגנטי) במקרומולקולות ביולוגיות. הנחיות לביצוע מדידות כאלה מקבלות, כוללים יישומים למחקר של ה-DNA וחוטי Nucleo-חלבון קשורים.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

פינצטה אופטית שימשה לחקר קיפול RNA על ידי מתיחת מולקולות בודדות מקצות 5' ו-3' שלהן. כאן מתוארים נהלים נפוצים לסינתזה של מולקולות RNA לפינצטה, כיול המכשיר ושיטות למניפולציה של מולקולות בודדות.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

למד כיצד למתוח מולקולות DNA קצרות באורך של כ-100 ננומטר באמצעות פינצטה אופטית קבועה בכוח. השיטה מאפשרת חקר תכונות מכניות של DNA וקינטיקת קישור חלבונים תוך מזעור הפרעות סטריות.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

גלה סרטונים נוספים