RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

מטרת הליך זה היא לזהות מווסתים פוסט-עובריים של ביטוי חלבון ולוקליזציה באלגנטיות C באמצעות מסך גנומי מבוסס RNAi וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית. לאחר בניית זן הסינון המתאים, נבחרת ספריית RNAi. השלב הראשון בהליך הוא לארוז את שיבוטי הספרייה לחיידקים.

לאחר מכן החיידקים נבחרים, גדלים ומוזנים לנמטודות אלגנטיות מבוימות. לאחר שאפשרו לנמטודות לצמוח במשך 72 שעות, הן נצפות לשינויים בפנוטיפ המעניין. בסופו של דבר, שינויים בביטוי או בלוקליזציה התת-תאית של חלבון מותקף מוצגים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לזהות גנים הנדרשים ללוקליזציה תת-תאית נכונה של חלבון מתויג פלואורסצנטי. עם זאת, ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לזהות גנים המשפיעים על פנוטיפים פוסט-עובריים אחרים מעניינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים שפורסמו הוא שביצענו אופטימיזציה של העקביות והרמה של תגובת ה-RNAi בבעלי חיים על ידי השראת ייצור ה-RNA הדו-גדילי בחיידקים לפני הציפוי.

תדגים את ההליך תהיה קתי פוס, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי תוך חודשיים מתחילת הניסוי, הכינו את חיידקי הפס הראשון של ספריית השיבוטים משיבוטים נבחרים של ספריית האכלה, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות על לוחות טטרציקלין פחמניים LB. לבקרה חיובית, השתמש בשיבוט המכיל גן המייצר פנוטיפ פוסט-עוברי תלוי מינון, כגון BLE four. עבור בקרה שלילית, השתמש בווקטור ריק או בשיבוט המכיל פסאודוגן חזוי ללא פנוטיפים נצפים.

דגרו את הצלחות למשך הלילה עבור כל שיבוט חיסנו שני מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר. חומצה פחמנית עם מושבה אחת מלוחות הפסים, דוגרת על התרביות למשך הלילה עם תסיסה למחרת בבוקר. הפתרונות צריכים להיות ייצור עכור של RNA דו-גדילי על ידי הוספת IPTG לתרביות ודגירה שלהן למשך ארבע עד חמש שעות נוספות באותם תנאים.

הוספת IPTG מבטיחה נוקדאון עקבי וחזק יותר של תוצר הגנים המושרה על ידי RNAI מאשר להסתמך אך ורק על ה-IPTG ועל המקדחה של לוחית ה-NGM לאחר הדגירה של IPTG נקודה של 30 מיקרוליטר של תרבית מכל שיבוט לכל באר של צלחות ה-NGM RNAi המוכנות של 24 בארות. שיבוט אחד לכל באר. לכל צלחת צריכות להיות שתי בארות המוקדשות לבקרות.

בדוק בזהירות את מיקומה של כל ספרייה. שיבוט ב -24 צלחות הבאר מניח כעת את הצלחות החשופות במכסה זרימה סטרילי לייבוש כ -20 דקות. אל תאפשר לשולי האגר להתרחק מהצלחת.

לאחר ייבוש בנמטודות מבוימות לצלחות, ניתנות הוראות להכנת נמטודות. בחלק הבא, התחל עם אוכלוסייה מדורגת של שלב הזחל הראשון או L נמטודות אחת. החל מ-L, זחל אחד עוקף פנוטיפים קטלניים עובריים פוטנציאליים.

אוכלוסייה מבוימת של בעלי חיים לבדיקה גם מגבירה את הביטחון שכל הווריאציות שנראות נובעות מה-RNAi ואינן רק וריאציות נורמליות המתרחשות בשלבים שונים. עם זאת, אם ה-RNAi גורם לעיכוב התפתחותי, יש לציין זאת על ידי המסנן Bleach. אוכלוסיית שלב מעורב של זן ההקרנה.

רק עוברים מוגנים בקליפת ביצה ישרדו שלב זה בעלי חיים תוך 12 שעות אם הם מבוצעים ב-20 מעלות צלזיוס או תוך 18 שעות. אם נערך ב-16 מעלות צלזיוס ביום החיסון של תרביות חיידקים. בחר שלוש צלחות של 100 מילימטר של בעלי חיים בריאים המכילים גם כוח משיכה, בוגרים וגם עוברים.

שוטפים את כל בעלי החיים במדיה סטרילית M nine ומעבירים את הכביסה לצינור סטרילי של 15 מיליליטר עם מכסה בורג. אם הכביסה גדולה מ -3.5 מיליליטר, סובב על בעלי החיים והסר את כל הנוזלים מלבד 3.5 מיליליטר. אם פחות מ -3.5 מיליליטר.

הגדל את הנפח ל -3.5 מיליליטר עם מים או M 9 כדי לשחרר את העוברים מהמבוגרים ב -1.5 מיליליטר של תערובת של נתרן הידרוקסיד ואקונומיקה לכל שטיפה. אפשר לבעלי החיים לדגור לא יותר מעשר דקות בתמיסה זו. לאחר הפעלת טיימר, מערבל כל צינור למשך 10 שניות וחזור על המערבולת כל שתי דקות.

לאחר כל מערבולת, התבונן בתמיסה תחת טווח ניתוח של פגרי בעלי חיים. תוך שש עד שמונה דקות, הבוגרים יהיו מקוטעים ויש לשחרר את העוברים. הסר את העוברים מתמיסת האקונומיקה על ידי כדוריהם והסרתם כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בנפח של 10 מיליליטר על ידי הוספת M 9 סטרילי ושימוש בתסיסה. חזור על תהליך כביסה זה לפחות פעם נוספת עד שריח האקונומיקה אינו ניתן לזיהוי לחלוטין. כדי לשלב בצורה הדוקה יותר, בעלי החיים עוצרים אותם בשלב L אחד שלהם על ידי בקיעת עוברים במדיום M 9 ללא מזון.

זה נעשה על ידי העברת העוברים ב-M 9 לבקבוק ארלנמאייר קטן. לנער את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה המתאימה לזן ולהתנסות. בזמן זה, כל החיות יבקעו וייעצרו ב-L דיאפאוזה אחת למחרת.

המשך את צמיחת הזחלים מנקודת זמן מוגדרת על ידי העברתם לחיידקים המוכנים המבטאים RN דו-גדילי. זה באותו היום שבו 24 לוחות הבארות זוהו בחיידקים. התחל בהעברת בעלי החיים L one לצינור של 15 מיליליטר וסיבובם כלפי מטה. לאחר מכן רכזו את החיות לחצי עד מיליליטר אחד של M 9 והניחו חמישה מיקרוליטרים של נמטודות מרוכזות על צלחת.

ספרו את מספר בעלי החיים בצלחת והתאימו את תמיסת הנמטודה המרוכזת. TE 30 תולעים לכל שלושה עד 10 מיקרוליטר. לבסוף, הבחין בכ-30 ליטר בעלי חיים בשלב אחד על החיידקים בכל באר של המוכן.

צלחת 24 באר יותר מ -30 בעלי חיים לבאר עלולה לגרום לרעב לאחר שהכתמים התייבשו, מה שייקח מספר דקות, אבטח את המכסה עם הגומייה דגר את החיות הפוכות בטמפרטורה ומשך הזמן הנדרשים כדי להבקיע את בעלי החיים בשלב הרצוי. ברגע שהנמטודות מוכנות לסינון, ודא שהבקרות החיוביות והשליליות מייצרות את הפנוטיפים הצפויים. לאחר מכן התבונן בחיות הניסוי לאיתור חריגות התפתחותיות.

לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ מנתח הרכיבו שמונה עד 12 בעלי חיים מכל באר על מגלשות 4% Agri PET עם טיפה של חמישה מיקרוליטר של חומר הרדמה. לאחר מריחת פתק הכיסוי המתאים, בצע תצפיות על לפחות חמישה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופיה מורכבת. שמור על מסד נתונים מסודר של הגן, מספר בעלי החיים שנצפו והתוצאות הפנוטיפיות.

עבור כל ניסוי RNAI, אמת כל פנוטיפ R RNAi שנוצר על ידי פנוטיפ משני אחר במידת האפשר, ועל ידי חזרה על הניסוי, ניסויים חוזרים יכולים להשתמש בחיידקים מאותו רצף. פסים ישנים יותר עלולים לגרום לצמיחה לקויה בתרביות לילה נוזליות, ויש לפספס אותם תחילה. תרביות חיידקים מסוימות לא יגדלו היטב בגלל תוצר הגנים המתבטא בפלסמיד שלהן.

במקרה זה, פשוט רכזו את החיידקים לפני הציפוי. לבדיקה מתמשכת, חשוב לשמור על הרבה עוברים מוכנים תמיד לשלב תמיד יש להאכיל את זן ההקרנה, לא להרעיב אותו, וללא מזהמים שעלולים להשפיע על הפנוטיפ המעניין.

קבענו לוח זמנים לתחזוקה להאכלת בעלי חיים. גנים המשפיעים על לוקליזציה של DBL אחד זוהו על ידי RNAi באמצעות עיצוב זן עבור מסך זה. ביטוי נורמלי של תג GFP dbl אחד כולל גופי תאי חבל עצב גחוניים, ושורה של בעלי חיים פונקטיים שהוזנו ב-RA אנטי-סנס ל-DBL.

mRNA אחד הראה ביטוי מוחלש מאוד של DBL אחד. בעלי חיים אלה היו גם קטנים כמו בעלי חיים חסרי DBL L פונקציונלי. מסך ה-RNA I זיהה בהצלחה גנים רבים אחרים שתוצריהם משפיעים על לוקליזציה של DBL one, ובכך הרחיב את ההבנה שלנו לגבי האופן שבו TGF beta נסחר תת-תאי ומספק נקודת השקה למחקרים רבים נוספים.

באמצעות שיטה זו, אדם יחיד יכול לביים באופן סביר ולצפות בשניים עד ארבעה סטים של ניסויים בכל שבוע. לדוגמה, ניתן לצפות בבעלי חיים בימי שני ושלישי בימי חמישי ושישי בהתאמה, וניתן לצפות שוב בבעלי חיים בימי שישי ושבת בימים שני ושלישי. תצפית בעת ביצוע הליך זה לאורך כל המסך.

חשוב לשמור על הרבה עוברים מוכנים לשלב הקמה, לכן שמרו על זן ההקרנה באופן קבוע. כמו כן, חשוב לרשום הערות מפורטות על כל התצפיות.