Name: RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד לזהות רגולטורים פוסט-אמבריוניים של ביטוי חלבון ב-C. elegans באמצעות מסך גנומי מבוסס RNAi וחלבונים מתויגים בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת תצפית בשינויים בביטוי ובלוקליזציה תת-תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר ריק פאדג&#39;ט (וקסמן המכון, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג&#39;רזי) על המתנה של dbl-1 cDNA וד&quot;ר כריסטופר Rongo (מכון וקסמן, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג&#39;רזי) לסמן זריקה. המעבדה ד&quot;ר Barth של גרנט ביצעה את האקדח גן הפצצה לשילוב מספר נמוך עותק של מבנה ה-GFP-מתויג-1 dbl. גרסיה רנה המעבדה סיוע טכני במהלך היצירה של texIs100. גרסיה רנה, Lints רובין, ו Hongmin צ&#39;ין מעבדות סיפק ייעוץ פרודוקטיבי. עבודה זו מומנה על ידי הזנק קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם confocal דיסק מסתובב נרכשו במימון מחלקת ומכללת TAMHSC המשרד לרפואה של דין.

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bli-4+%28I%29+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li>
<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

שיטת ההקרנה RNAi המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש ומהיר של מוצרי גנים הנדרשים הפנוטיפ (או המהונדס) רגיל postembryonic. הדוגמה המוצגת היא המסך של גנים המעורבים בלוקליזציה subcellular של חלבון מתויג fluorescently. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות את הגנים המשפיעים על פנוטיפים postembryonic אחרים בעלי עניין. שיטה זו מנצלת את גישת הגן המועמד באמצעות הספרייה RNAi. מסכי קדימה גנטיות באמצעות טכניקות mutagenesis ל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> NGM אגר </td><td> הצמיחה נמטודות בינוני </td><td> IPM מדעי, Inc </td><td> ניתן להכין בעקבות פרוטוקול אגר NGM 25 </td></tr><tr><td> M9 בינוני </td><td> 22 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> אגר אגר, </td><td> EMD כימיקלים בע&quot;מ </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% במים צלחות NGM. 4% במים רפידות שקופיות מיקרוסקופ (החיטוי בתחילה במיקרוגל כדי להמיס לאחר מכן). </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> בקטון דיקינסון - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0.25% </TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 הריכוז הסופי mM </td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​דילול עובד </td></tr><tr><td> LB מרק לנוקס </td><td> בקטון דיקינסון - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> סיגמא </td><td> 268054 </td><td> 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​דילול עובד </td></tr><tr><td> נתרן hypochlorite </td><td> כל מותג </td><td> בית 5% אקונומיקה </td><td> השתמש אקונומיקה טרי. </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> כל מותג </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N המניות </td></tr><tr><td> M9 בינוני </td><td> Wormlab ספר המתכונים </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> סיגמא </td><td> 31742 </td><td> 100 מיקרומטר - 1 דילול עובד mM </td></tr><tr><td> אזיד הנתרן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S227 </td><td> 10 מ&quot;מ דילול עבודה M9 </td></tr><tr><td> 24 גם צלחת </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR מפיץ </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> כל מותג </td><td> 75 x 25 x 1 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי מיקרוסקופ תלושי </td><td> כל מותג </td><td> 22 x 22 מ&quot;מ No.1.5 </td><td> השתמש עובי המומלץ על ידי היצרן מיקרוסקופ. </td></tr><tr><td> תרכובת מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1m </td><td> השתמש יעדים ומסננים כדי להתאים את הצרכים של הניסוי. </td></tr><tr><td> התקשורת משאבת</td><td> Manostat משאבת Varistaltic </td><td> קייט המודל # 72-620-000 </td><td> השתמש בצינור ואת ההגדרות המתאימות למכשיר </td></tr></tbody></table>

rnai הקרנת לזהות פנוטיפים postembryonic ב ג elegans</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

סי אלגנס הוכיחה להיות מערכת מודל ערך לגילוי ואפיון פונקציונלי של גנים רבים ושבילים גנים 1. כלים מתוחכמים יותר ומשאבים ללימודי במערכת זו יש להקל על הגילוי המתמשך של גנים עם פנוטיפים או תפקידים יותר עדינים. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית התאמנו לזיהוי ג elegans גנים עם פנוטיפים postembryonic בעלי עניין באמצעות RNAi 2. הליך זה שונה בקלות assay הפנוטיפ של בחירה, בין אם על ידי אופטיקה אור פלואורסצנטי או על מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. זה פרוטוקול ההקרנה מנצל את הנכסים הפיזיים של האורגניזם וכלים מולקולריים ג הקהילה elegans המחקר הפיק. כדוגמה, אנחנו מדגימים את השימוש transgene משולבת המבטאת מוצר ניאון במסך RNAi לזהות גנים הנדרשים לוקליזציה רגיל לכךהמוצר הזחלים בשלב מאוחר ומבוגרים. ראשית, השתמשנו ספריה זמינים מסחרית RNAi גנומית עם באורך מלא מוסיף cDNA. ספריה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים רבים על ידי הפחתת RNAi של המוצר הגן המועמד. שנית, אנו שנוצר transgene משולב המבטא חלבון מתויג fluorecently שלנו עניין ברקע RNAi רגיש. שלישית, על ידי חשיפת בעלי החיים בקעו כדי RNAi, מסך זה מאפשר זיהוי של מוצרים גנים שיש להם תפקיד חיוני עובריים שאחרת להסוות תפקיד שלאחר עובריים בוויסות חלבון של עניין. לבסוף, המסך הזה עושה שימוש במיקרוסקופ המתחם מצויד לפתרון תא בודד.

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות מסך RNAi מבוסס גנומית transgene משולב המבטא חלבון פונקציונלי, מתויג fluorescently.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

*C. elegans* הוכיח עצמו כמערכת מודל בעלת ערך לגילוי ולאפיון פונקציונלי של גנים ומסלולים גנטיים רבים1. מערכות מתוחכמות יותר...

מטרת פרוצדורה זו היא לזהות רגולטורים פוסט-עובריים של ביטוי חלבונים ומיקומם ב-C elegance, באמצעות סריקה גנומית מבוססת RNAi וחלבונים מסומנים פלואורסצנטית. לאחר בניית זן הסריקה המתאים, נבחרת ספריית RNAi. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא אריזת השיבוטים מהספרייה אל תוך חיידקים.לאחר מכן נבחרים החיידקים, גודלים ומוזנים לנמטודות *C. elegans* בשלבים שונים. לאחר מתן זמן גדילה של 72 שעות לנמטודות, הן נבחנות לאיתור שינויים בפנוטיפ הרלוונטי. לבסוף, שינויים בביטוי או בלוקליזציה התת-תאית של החלבון הנבדק מוצגים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.שיטה זו יכולה לזהות גנים הדרושים למיקום תת-תאי תקין של חלבון המסומן בفلורסצנציה. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לזהות גנים המשפיעים על פנוטיפים פוסט-עובריים אחרים שמעניינים את החוקר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים שפורסמו הוא שביצענו אופטימיזציה לעקביות ולרמה של תגובת ה-RNAi בבעלי החיים על ידי השראת ייצור של ה-RNA הדו-גדילי בחיידקים לפני הפיזור בצלחים.את הפרוצדורה תדגים קתי פוס, עמיתה למחקר מהמעבדה שלי. בתוך חודשיים מתחילת הניסוי, הכינו את ספריית השיבוט; ראשית, בצעו ריסוס (streak) של חיידקים משבטי ספריית ההאכלה שנבחרו, וכן של בקרות חיוביות ושליליות, על מצעי LB עם tetracycline. כבקרת חיובית, השתמשו בשיבוט המכיל גן המייצר פנוטיפ פוסט-עוברי תלוי-מינון, כגון BLE four. כבקרת שלילית, השתמשו בווקטור ריק או בשיבוט המכיל פסאודוגן חזוי ללא פנוטיפים נצפים.דגרו את הצלחות למשך לילה. עבור כל שיבט, תתחיlo את שני מיליליטר של מצע LB המכיל 50 micrograms per milliliter של חומצה קרבונית עם מושבה בודדת מלוחות הריסוס, ודגרו את התרביות למשך לילה עם ערבוב. למחרת בבוקר, התמיסות צריכות להיות עכורות. השרה את ייצור ה-RNA דו-גדילי על ידי הוספת IPTG לתרביות ודגרו אותן למשך ארבע עד חמש שעות נוספות תחת אותם תנאים.הוספת IPTG מבטיחה השתקה (knockdown) עקבית וחזקה יותר של תוצר הגן באמצעות RNAi בהשוואה להסתמכות בלבד על ה-IPTG והמיזריקה (auger) של פלטת ה-NGM. לאחר הדגירה עם IPTG, טפטפו 30 µL תרבית מכל שיבט לתוך כל באער של פלטות NGM RNAi בנות 24 באערים שהוכשרו. שיבט אחד לכל באער. בכל פלטה יש להקצות שני באערים עבור הביקורות.סמנו בעי carefully את מיקומו של כל ספרייה. לאחר השכפול לפלטות בעלות 24 בארות, הניחו את הפלטות ללא כיסוי בתוך מנדף סטרילי למשך כ-20 דקות לייבוש. ודאו ששולי האגר אינם נפרדים מהפלטה.לאחר ייבוש של נמטודות בשלבים שהועברו לצלחות, ניתנות הנחיות להכנת הנמטודות. בחלק הבא, התחילו עם אוכלוסייה בשלב התפתחותי של הדרגה הזחלית הראשונה או נמטודות L1. התחלה עם זחלי L1 עוקפת פנוטיפים פוטנציאליים של מוות עוברי.שימוש באוכלוסיית בעלי חיים בשלבים התפתחותיים מדורגים לצורך סריקה מגביר גם את הביטחון בכך שכל וריאציה שנצפתה נובעת מה-RNAi ואינה פשוט וריאציה נורמלית המתרחשת בשלבים שונים. עם זאת, אם ה-RNAi גורם לעיכוב התפתחותי, הדבר צריך להיות רשום על ידי הסורק. Bleach. אוכלוסייה בשלבים מעורבים של זן הסריקה.רק עוברים המוגנים בקליפת ביצה ישרידו בשלב זה. השביחו את בעלי החיים לשלב של עד 12 שעות אם הפעולה מבוצעת ב-20 °C, או עד 18 שעות אם היא מבוצעת ב-16 °C, ביום שבו מוחדרים התרביות החיידקיות. בחרו שלוש צלחות של 100 מילימטר של זן סינון עם בעלי חיים בריאים, הכוללים הן בוגרים בהריון והן עוברים.שטפו את כל בעלי החיים במצע M9 סטרילי והעבירו את תמיסת השטיפה למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר עם מכסה הברגה. אם נפח השטיפה עולה על 3.5 מיליליטר, סובבו את בעלי החיים בצנטריפוגה והסירו את כל הנוזל למעט 3.5 מיליליטר. אם הנפח קטן מ-3.5 מיליליטר.הגדילו את הנפח ל-3.5 milliliters באמצעות מים או M nine כדי לשחרר את העוברים מהבוגרים, תוך הוספת 1.5 milliliters של תערובת sodium hydroxide ומלבן לכל שטיפה. אפשרו לבעלי החיים להדגריר בתמיסה זו למשך לא יותר מ-10 דקות. לאחר הפעלת טיימר, ערבבו כל מבחנה במכשיר vortex למשך 10 שניות וחזרו על פעולת ה-vortex בכל שתי דקות.לאחר כל ערבוב במכשיר vortex, בחנו את התמיסה תחת מיקרוסקופ סטריאו (dissecting scope) כדי לזהות שאריות של גופות בעלי חיים. בתוך שש עד שמונה דקות, הפרטים הבוגרים יתפרקו והעוברים אמורים להשתחרר. הסירו את העוברים מתמיסת האקונומיקה על ידי סבסוב (pelleting) והסרת מרב הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע.לאחר מכן, השעה מחדש את המשקע בנפח של 10 milliliters על ידי הוספת M nine סטרילי תוך כדי ערבוב. חזור על תהליך שטיפה זה לפחות פעם אחת נוספת, עד שריח האקונומיקה אינו ניתן לזיהוי לחלוטין. כדי להגיע לדיוק גבוה יותר בשלב התפתחות בעלי החיים, עכב אותם בשלב L one על ידי בקיעת עוברים במצע M nine ללא מזון.פעולה זו מבוצעת על ידי העברת העוברים במצע M nine לבקבוק ארלנמייר קטן. נעזער את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה המתאימה לזן ולניסוי. במהלך זמן זה, כל בעלי החיים יבקעו וייעצרו בדיאפאוזה של שלב L1 למחרת.חדש את צמיחת הזחלים מנקודת זמן קבועה על ידי העברתם לחיידקים המבטאים RNA דו-גדילי שהוכנו מראש. זהו אותו היום שבו בוצע הזריעה של החיידקים על פלטות ה-24 באר. התחל בהעברת בעלי חיים בשלב L1 למבחנה של 15 מיליליטר וסובב אותם במערך צנטריפוגה. לאחר מכן, רכז את בעלי החיים ל-0.5 עד 1 מיליליטר של M9 והצב 5 מיקרוליטר של נמטודות מרוכזות על פלטה.ספרו את מספר בעלי החיים בצלחית והתאימו את תמיסת הנמטודות המרוכזת. השגיחו 30 תולעים לכל שלוש עד 10 µL. לבסוף, טפטפו כ-30 תולעים בשלב אחד על הבקטריות בכל באער של הפלטה שהוכנה.בפלטה בעלת 24 בארות, מספר של יותר מ-30 בעלי חיים לכל בארה עלול להוביל להרעבה. לאחר שהכתמים התייבשו, תהליך שייקח מספר דקות, הדקו את המכסה באמצעות הגומייה. דגרו את בעלי החיים במצב הפוך בטמפרטורה ובמשך הזמן הנדרשים, כדי להגיע לשלב הרצוי של בעלי החיים. כאשר הנמטודות מוכנות לסריקה, ודאו שהביקורות החיוביות והשליליות מראות את הפנוטיפים הצפויים. לאחר מכן, בחנו את בעלי החיים הניסויים לאיתור חריגות התפתחותיות.בשלב הבא, בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, העבירו שמונה עד 12 בעלי חיים מכל באר אל שקופיות Agri PET בריכוז 4% באמצעות טיפה של 5 µL של חומר הרדמה. לאחר הנחת מכסית זכוכית מתאימה, בצעו תצפיות בלפחות חמישה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ אור. תחזקו מאגר נתונים מאורגן של הגן, מספר בעלי החיים שנצפו והתוצאות הפנוטיפיות.עבור כל ניסוי RNAi, יש לאמת כל פנוטיפ שהתקבל באמצעות פנוטיפ משני נוסף במידת האפשר, וכן על ידי חזרה על הניסוי; בניסויים חוזרים ניתן להשתמש בחיידקים מאותו פס (streak). פסים ישנים עלולים להוביל לצמיחה דלה בתרביות נוזליות במהלך הלילה, ובמקרה כזה יש לבצע פס מחדש תחילה. חלק מהתרביות החיידקיות לא יצמחו היטב בשל תוצר הגן המובע בפלסמיד שלהן.במקרה זה, יש להרכז פשוט את החיידקים לפני הזריעה. עבור סריקה מתמשכת, חשוב להחזיק תמיד מספר רב של עוברים מוכנים לשיוך לשלב התפתחותי. יש להזין את זן הסריקה באופן קבוע, ולא להרעיבו, ולוודא שהוא נקי ממזהמים שעשויים להשפיע על הפנוטיפ הנחקר.קבענו לוח זמנים לתחזוקה עבור האכלת בעלי החיים. גנים המשפיעים על לוקליזציה של DBL one זוהו באמצעות RNAi תוך שימוש במערך זנים עבור סריקה זו. ביטוי נורמלי של תג GFP dbl one כולל גופי תאים של חוט העצבים הבטני, ושורה של נקודות (puncta) בבעלי חיים שהוזנו ב-RA antisense ל-DBL.mRNA אחד הראה ביטוי מוחלש מאוד של DBL one. בעלי חיים אלו היו קטנים, בדומה לבעלי חיים חסרי DBL L one תפקודי. סריקת ה-RNA I זיהתה בהצלחה גנים רבים נוספים שמוצריהם משפיעים על מיקום ה-DBL one, ובכך הרחיבה את הבנתנו לגבי אופן ההובלה התת-תאית של TGF beta וסיפקה נקודת מוצא למחקרים רבים נוספים.באמצעות שיטה זו, אדם אחד יכול להכין ולהבחין באופן סביר בשתי עד ארבע סדרות של ניסויים בכל שבוע. לדוגמה, בעלי חיים שהוכנו בימי שני ושלישי ניתנים למעקב בימי חמישי ושישי בהתאמה, וניתן להכין שוב בעלי חיים בימי שישי ושבת עבור ימי שני ושלישי. ביצוע תצפיות במהלך מעקב זה לאורך כל הסריקה.חשוב להחזיק מספר רב של עוברים מוכנים לשלב הדירוג, ולכן יש לתחזק את זן הסריקה באופן קבוע. כמו כן, חשוב לרשום הערות מפורטות על כל התצפיות.

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Neurexins ו neuroligins הם קרום תא עצב הידבקות חלבונים אשר מבצעים תפקידים חיוניים בידול הילוכים הסינפטי ו. Neuroligin מוטנטים לקוי...

הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף...

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.<br...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

למד לזהות רגולטורים פוסט-אמבריוניים של ביטוי חלבון ב-C. elegans באמצעות מסך גנומי מבוסס RNAi וחלבונים מתויגים בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת תצפית בשינויים בביטוי ובלוקליזציה תת-תאית.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

גלה סרטונים נוספים