כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון תפקוד גנים באופן כמותי ולבחון את התוצאות בקנה מידה גנומי רחב. הדבר מושג תחילה על ידי השתקה (knock down) של הביטוי של כל גן באמצעות RNAi, בלוחות של 96 בארות.

בשלב הבא, מבוצע הבדיקה הרלוונטית לתפקוד הגן. בדוגמה זו, נבחנת היכולת של sea elegance להגיב באופן תקין לזיהום פטרייתי על ידי ניתוח הביטוי של רפורטר פלואורסצנטי הניתן להשראה. לאחר מכן, מבוצע ניתוח כמותי אוטומטי באמצעות ה-Coss bio sortt; בסופו של דבר, ניתוח של תכונות מדידות, כגון ביטוי של גן רפורטר פלואורסצנטי, מראה תתי-קבוצות של גנים הדרושים לוויסות מסלולים ספציפיים, השולטים בהתפתחות, בהתנהגות או בפיזיולוגיה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומים שונים שבהם ניתן לראות אלגנטיות, כגון התפתחות, נוירוביולוגיה, וכן אינטראקציות בין מאכסן לפתוגנים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר פורסמו סקרי RNA רחבי היקף של העין על ידי מעבדת Oranger. פיתוח הכלים הנדרשים ושכלול האוטומציה דרשו מאמץ ניכר.

אדגים את הפרוצדורה יחד עם אוליביה, מדענית צוות ועוזרת מחקר מהמעבדה של ג'ונתן יובנקס. כדי להכין 10 עד 12 לוחות 96-בארות, התחילו בהכנת 100 מיליליטר של מדיום גידול לנמטודות או NGM במים דה-יוניזציה. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב להנחיות.

בעוד המצע עדיין חם, הוסיפו 100 µg/mL של ampicillin, 12.5 µg/mL של tetracycline ו-4 mM של IPTG, וחלקו במהירות 75 µL לכל באר בלוח בעל 96 באערים עם תחתית שטוחה. בדקו והסירו מיד בועות אוויר שנמצאות בבאערים. אחסנו את הלוחות בתא לחות בטמפרטורה של 4 °C.

בשלב הבא, הכין פלטות של 96 בארות עמוקות על ידי הוספת 1.5 milliliters של LB המכיל ampicillin ו-tetracycline. לכל בארה הוסף תווית ייחודית או ברקוד. כסה כל פלטה ושמור בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס אם ההכנה בוצעה מראש; ערבב את פלטת מאגרי ה-LB של 96 הבארות המכילה את ה-RNAI.

בצעו שכפול של קלונים חיידקיים עם ampicillin, tetracycline ו-glycerol, וחלקו 3 µL מכל קלון חיידקי לבאר התואמת בלוח 96 deep well שהוכן מראש. השתמשו בבארים ריקות עבור ביקורות; כסו את לוחות ה-96 deep well בסרט דביק והדגירו אותם למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ערבול. העבירו את לוח השכפולים של ה-96 well למקפיא בטמפרטורה של 80- °C בבוקר שלאחר התרבית הלילית.

העבירו את פלטות ה-NGM בעלות 96 בארות מטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לתא למינרי סטרילי והמתינו 5 עד 15 דקות לחימום וייבוש. לאחר מכן, הוסיפו את התווית או הברקוד המתאימים לכל פלטה. הוציאו את פלטות התרבית עם הבארות העמוקות (96 deep well) מהאינקובטור לאחר דגירה של לילה.

צפו בצנטריפוגה של תרביות חיידקים שגדלו בהצלחה. את פלטות 96 הבארות העמוקות יש לצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-4,000 RPM. יש לנקז את העלייה על ידי הפיכת הפלטה בחדות כלפי מטה וייבוש מהיר.

השהו את קצוות הפלטה על נייר סופג כדי להשעות מחדש את משקע החיידקים בנוזל השארי באמצעות וורטקס. רצוי להשתמש במכשיר ערבוב ייעודי כדי שכל פלטה תקבל טיפול מדויק וזהה. העבירו 5 µL של החיידקים המושעים לתוך פלטות NGM בעלות 96 בארות באמצעות פפית רב-ערוצית בעלת 8 או 12 ערוצים.

הימנעו ממגע עם ה-NGM. תנו לבקטריות להתייבש תחת תא זרימה למינרית סטרילי למשך כשעתיים. תוך כדי בדיקה קבועה כדי למנוע ייבוש יתר של ה-NGM, הדגירו את לוחיות ה-96-well R-N-A-I-N-G-M בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה בתא לחות.

יש לעיין בפרוטוקול הכתוב להכנת אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים לאחר קירור לוחות ה-R-N-A-I-N-G-M בעלי 96 בארות לטמפרטורת החדר. העבירו כ-100 עד 200 תולעים ב-2 µL של M9 לכל בארה. ודאו שבכל בארה ישנן תולעים.

התולעים צריכות לשחות. יש להניח לצלחות להתייבש תחת תא זרימה למינרית סטרילי למשך שעה אחת לכל היותר. יש לבדוק את הצלחות באופן קבוע.

התולעים צריכות לזחול ולא לשחות. יש להניח את הצלחות בתא לחות בטמפרטורה של 25 degrees centigrade למשך הלילה. לאחר בחירת סבב זיהום בעל יעילות גבוהה של Judge Miria spora.

השתמש בבופר M9 כדי לאסוף את הנבגים מתוך צלחת בקוטר 9 ס"מ. חלק 4 µL של נבגים לכל באר ובדוק שבכל באר קיימים נבגים. התולעים צריכות לשחות.

הניחו לצלחות להתייבש תחת מчиеב זרימה למינרית סטרילית למשך כשעה אחת. בדקו את הצלחות באופן קבוע עד שהתולעים יתחילו לזחול. לאחר מכן, העבירו את הצלחות המודבקות לתא לחות בטמפרטורה של 25 °C למשך הלילה.

בדקו את התולעים לפני האנליזה באמצעות תצפית מהירה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא התפתחות תקינה, השראה טובה של GFP בביקורות השליליות ופליעת פלואורסצנציית GFP מופחתת בבארות של הביקורות החיוביות. אם ההשראה טובה, העבירו את התולעים בעזרת פיפט רב-ערוצי של 8 או 12 ערוצים עם 100 µL של 50 mM NaCl ו-0.05% triton ללוח חדש של 96 בארות בעלות תחתית עגולה, המסומן בתווית או בברקוד.

הקפיאו את הפלטות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד ליום האנליזה. ביום האנליזה, הפשירו את הפלטות הקפואות בטמפרטורת החדר. לאחר הפשרת הפלטות, המשיכו לאנליזה אוטומטית באמצעות מערכת ה-COPA bios.

המכונה מעבדת את הפלטה באר אחר באר ומנתחת את הפרמטרים של כל תולעת, כגון הפלואורסצנציה שלהן. העבירו את המידע שהתקבל מה-COPA bios sortt לקובץ Excel לצורך אימות איכות הנתונים. לאחר מכן, שמרו את הנתונים הגולמיים, הכוללים צפיפות אופטית, אורך צירי ופליטות פלואורסצנטיות, בחבילת limbs לצורך ניתוחים כמותיים מפורטים בהמשך.

בניסוי זה, תולעים טרנסגניות ביטאו באופן קבוע reporter P call 12 ds red ו-PNLP 29 GFP הניתן להשראה. תולעי ה-reporter נחשפו לבקרת או ל-A-G-F-P-R-N-A eye clone למשך 48 שעות. הפאנלים משמאל הם תולעים שאינן מזוהמות, והפאנלים מימין הם תולעים 18 שעות לאחר הדבקה ב-D spora.

כאשר הפנוטיפ המבוקש הוא ביטוי של GFP reporter, בארות גנים עם GFP RNAi clone מספקות בקרת איכות חזקה. מערכת ה-COPA bios SORTT מייצרת נתונים מספריים עבור כל תולעת שנבדקה. גרפים אלו מציגים את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל בארה של תולעתים טרנסגניות.

ביטוי קבוע של רפורטר p call 12 DS red וביטוי הניתן להשראה של רפורטר PNLP 29 GFP לאחר RNAI והדבקה ב-diaspora. המיון מנתח את זמן הטיסה או TOF, המתואם לגודל התולעים, את הפלואורסצנציה האדומה, ואת היחס בין הפלואורסצנציה הירוקה ל-TOF. קלונים מסוימים גורמים לפגמים בצמיחה ו/או משפיעים על הביטוי של P 12 DS red.

אחרים משפיעים באופן ספציפי על ביטוי FP. לדוגמה, שיבט מסוים זה מכוון לגן NS Y אשר הוכח בעבר כחשוב עבור הרגולציה של NLP 29. פלואורסצנציה ירוקה ואדומה ו-TOF נמדדים ביחידות שרירותיות אך קבועות.

אחת החדשנויות של פרוטוקול זה היא השימוש בפלטות הקפאה כדי לדחות את ניתוחן. ההקפאה מאפשרת לאחסן את הפלטות למשך עד שבועיים מבלי לשנות באופן מהותי את התוצאות, כפי שמוצג כאן. למרות שערכיהם המוחלטים של מדדי הפלואורסצנציה עשויים להשתנות, היחסים היחסיים ביניהם נשארים דומים.

ארבעה תולעי L4 הנושאים את הטרנסגנים PNLP 29 GFP ו-P call 12 ds red הודאו או שלא הודאו ב-diaspora. לאחר 18 שעות, כל צלחית חולקה בקירוב לשניים; מחצית אחת נותחה מיד והמחצית השנייה הוקפאה במינוס 80 °C למשך 24 שעות לפני הפסקה. ערכי ניתוח עבור גודל ממוצע, עכירות ופלואורסצנציה ירוקה ואדומה חושבו עבור כל דגימה.

הגרף מציג את היחס בין הממוצע של דגימות נגועות לדגימות שאינן נגועות עבור הדגימות הקפואות והחיות המוצגות כאן. מניתוחים כפולים של פלטה מייצגת נגזרים יחסי הפלואורסצנציה הנורמליים עבור כל באר, שהם ממוצע הפלואורסצנציה של באר בחלוקה לממוצע המקוצץ של הפלטה. לאחר השליטה בפרוטוקול זה, קבוצה של שניים עד שלושה אנשים תוכל לבצע סריקה רחבה של הגנום תוך חודשייים עד שלושה חודשים.

ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה דורש עבודת צוות רבה. חברי הקבוצה שלי השקיעו מאמץ רב כדי ליצור פרוטוקול יעיל וקל יחסית לביצוע.