אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התגובות לאור ואת המורפולוגיה של נוירונים בודדים ברשתית שלמה, באמצעות שימוש בקו עכברים המבטא סמן פלואורסצנטי באופן בלעדי בסוגי תאים ספציפיים. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של העין כדי להוציא רשתית מבודדת. השלב השני הוא הנחת הרשתית תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי והדמיית תא באמצעות עירור אינפרא-אדום דו-פוטוני.

לאחר מכן משתמשים במיקרו-פיפט כדי להשיג קונפיגורציית whole cell patch clamp לצורך הקלטה ומילוי בצבע. בסופו של דבר, הכנה זו מאפשרת הקלטות של תגובות תאיות לגירוי פוטוני וחושפת את מורפולוגיית התא שהוקלט באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו הקלטת patch clamp לא מכוונת מהרשתית, הוא שניתן לכוון את ההקלטה באופן חזותי לעבר תא מסומן פלואורסצנטית מבלי לגרות את הרשתית באמצעות אור העירור.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של הרשתית, כגון מהי התרומה של אוכלוסיית תאים נתונה לעיבוד מידע חזותי? וזאת גם אם לאוכלוסיית התאים צפיפות נמוכה ואין לה מאפיינים מורפולוגיים מובחנים שעשויים להקל על הזיהוי. התחילו בניסוי זה על ידי הסתגלות של העכבר בחשכה למשך שלוש שעות לפחות לפני תחילת הניסוי.

בינתיים, הכינו את התמיסה החוך-תאית כפי שמתואר במאמר המצורף והעבירו דרכה בועות של carbogen בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השמידו את העכבר והוציאו את הגלובוסים של העיניים באמצעות מספרי איריס מעוקלים. העבירו אותם לצלוחית עם תמיסה חוץ-תאית.

לאחר מכן, מקמו אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות מספרי קפיץ. הסירו את הקרנית ואת הגוף הריסני על ידי פתיחת גלגל העין לאורך ה-ora serrata. הוציאו את העדשה והפרידו בזהירות את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי.

לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט. הוציאו את הרשתית מתוך גביע העין. שימו לב כי הצד הפנימי של הרשתית המגולגלת הוא צד תאי הגנגליון.

הצד החיצוני הוא צד הפוטורספטורים. לאחר מכן, הסר את הזגוגית מהמשטח הפנימי של הרשתית על ידי משיכה עדינה בעזרת קיסם עץ. לאחר מכן, בצע חתכים קצרים לאורך היקף הרשתית כדי להקל על יישור הרקמה.

בשלב הבא, העבירו את הרשתית לתא ההקלטה כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מטה. פרסו אותה על תחתית הזכוכית בעזרת מכחול עדין וקבעו אותה באמצעות מסגרת פלדת אל-חלד עם חוט ניילון. הניחו את תא ההקלטה בחשיכה תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי (laser scanning microscope) זקוף.

בצעו פרפוזיה רציפה של הרקמה הרטינלית בקצב של לא פחות מ-5 milliliters per minute. השתמשו בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת המחוממת ל-35 °C, כאשר המיקרוסקופ מונח על שולחן אוויר בולם זעזועים בתוך כלוב פאראדיי. לצורך מיגון אלקטרוני, כסו את הכלוב בווילון שאינו שקוף כדי לשמור על הדגימה בחשכה.

בנוסף, אנו חוסמים אור ממסכי מחשב באמצעות סרטים שקופים אדומים. כוון את לייזר האינפרא-אדום ל-850 עד 870 ננומטר או לאורכי גל ארוכים יותר. עבור למצב locked-mode והשתמש בעירור דו-פוטוני כדי להדמיות של תאים המבטאים GFP.

עבור הקלטת patch clamp, מלאו מיקרו-פיפטות מזכוכית בורו-סיליקט בתמיסה תוך-תאית המכילה גשש פלואורסצנטי, כפי שמתואר בכתב היד המצורף. לאחר מכן, הכניסו את המיקרו-פיפטה למחזיק. ודאו שאלקטרודת הייחוס נמצאת במגע עם התמיסה החוץ-תאית בתא ההקלטה.

בשלב הבא, הפעילו לחץ על תא המטרה המבטא A GFP באמצעות מיקרו-פיפט, תוך שימוש בעדשה אובייקטיבית עם הגברה של 40x המיועדת לטבילה במים. גופי תאי Omicron ממוקמים בשכבת תאי הגנגליון וכן בחלק הפרוקסימלי של השכבה הבין-צלולית (interplexiform layer). לפני שהמיקרו-פיפט יבוא במגע עם התא המיועד, חלחלו דרך קרומי הגבלה הפנימיים (inner limiting membrane) לפני שטח הרשתית. חדירה מוצלחת מזוהה על ידי יציאת התמיסה התו-תאית מקצה המיקרו-פיפט וההיפרדות של קרומי הגבלה הפנימיים מרקמת הרשתית שמתחתיהם. הצבע הפלואורסצנטי בתמיסה התו-תאית יכול לחשוף את מיקומו של המיקרו-פיפט בתמונת הדו-פוטון בזמן ההתקרבות לתא הרצוי.

לאחר מכן, שחרר את הלחץ מהמיקרו-פיפט והשג קונפיגורציית whole cell patch clamp. במצב current clamp, הקלטה שמימה צריכה להראות פוטנציאל ממברנה של 50- עד 55- millivolts ולהימשך לפחות 20 דקות. לאחר מכן, הצג את הגירויים הוויזואליים שנוצרו על מסך המחשב.

כוון את עוצמת הגירוי על ידי הכנסת מסנני צפיפות ניטרלית לנתיב הקרן, והתאם את המיקום המרחבי של הגירוי למרכז התא המוקלט. לאחר מכן, התחל את פרוטוקול הגירוי והקלט את התגובות לאור. השתמש במחולל הגירויים כדי להפעיל את תוכנת ההקלטה.

שלבו פוטודיודה בנתיב הקרן כדי לתעד את תזמון הגירוי. היזהרו לא למשוך את גוף התא בעת נסיגת המיקרו-פיפטה. בסיום מילוי הצבע, המתינו 30 עד 45 דקות כדי שהחומר הפלואורסצנטי יפעפף אל תוך התא המוקלט.

להלן דוגמה לתאים המבטאים GFP בתוך הרכבה שטוחה (flat mount) של רשתית תחת הפרומוטר שלהם. עבור tyrosin hydroxylase, ניתן להבחין בין שתי אוכלוסיות לפי עוצמת אות ה-GFP. תאי דופמינרגים מסוג 1 הממוקמים בשכבה הבין-צלולה (interclear layer), מבטאים פלורסצנציה חלשה, כפי שמוצג על ידי חצי החיצים באיור A. תאים מסוג 2 סומנו בעוצמה גבוהה וגופי התאים שלהם נמצאים בשכבה, כפי שמוצג על ידי החיצים באיור A, או מודחים לשכבת תאי הגנגליון, כפי שמוצג באיור B. איור C מראה ריבוי דנדריטי של תאים מסוג 2 בשכבה השלישית של השכבה הפלקסיפורמית הפנימית (inner plexiform layer). מוצגת כאן דוגמה למורפולוגיה של תא מסוג 2 שהוזרק עם הסמן neurobiotin.

הסמן הודגם מאוחר יותר על ידי קישור לסטרפטאווידין המסומן פלואורסצנטית, המוצג כאן בצבע מגנטה. להלן דפוסי תגובה שונים של תא מסוג שני הממוקם בשכבת תאי הגנגליון לאור לבן. לאחר הליך זה, נעשה שימוש בגירוי ממושך של שלושה שניות כדי להבדיל טוב יותר בין מרכיבי התגובה בזמן תחילת הגירוי ובסיומו.

ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון ניסויים פרמקולוגיים, דימוי סידן או אימונוכימיה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון התפקיד התפקודי של סוג תא נתון במעגלי הרשתית.