Name: אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: חקור תגובות אור ומורפולוגיה של נוירונים ברשתית העכברוש באמצעות תצפית בשני פוטונים ורישום patch-clamp מכוון. שיטה זו מאפשרת זיהוי ויזואלי מדויק של תאים מסומנים בפלואורסצנטית ללא גירוי מוקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (WE849/16 1 / 2 עד KD ו RW). אנו אסירי תודה תומאס אוילר (Töbingen, גרמניה) עבור QDs תוכנה גירוי האור.

התיאור הבא מניחה כי הנסיין יש הבנה בסיסית של מבנה הרשתית, תיקון-clamp הקלטה, שני הפוטונים במיקרוסקופ. למידע שימושי על הקמת מפעיל התקנה תיקון-clamp ושני פוטון מערכת הדמיה לראות השופטים [7-12]. 1. בעלי חיים והכנה רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכבר כהה להתאים לפחות 3 ח בינתיים, להכין 1-2 l פתרון של תאית המורכב (מ"מ) 125 NaCl, KCl 2.5, 1 CaCl 2, 1.6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז לאזן אותו pH 7.4 בגז עם carbogen (5% ב-CO 2 O 2) בטמפרטורת החדר. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתא אוויר חזק על ידי מנת יתר של CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הליך זה לבין השלבים הבאים יש לבצע בחושך. שימוש בתאורה עמומה ארוכת הגל (אנו חוסמים אורכי גל קצרים ממקור אור קר על ידי 690 ננומטר-longpasשל מסנן) כדי לתמוך חזון אישי תוך שמירה על העיניים של החיה כהה מותאם (עכברים רק חזון עני בחלק האדום של ספקטרום האור). לעבודה תאורה להשתמש להשלים החושך אינפרא אדום (&gt; 800 ננומטר) ללבוש משקפי ראיית לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate עיניים עם זוג מספריים מעוקל איריס ולהעבירם צלחת של פתרון תאיים תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת הגוף ריסי ידי פתיחת הנורה העין לאורך serrata אורה (הגבול בין הרשתית ואת הגוף ריסי) עם זוג מספריים אביב (אנחנו הראשונים להשתמש Lancet לחדור נקודת התחלה עבור חיתוך). קח את העדשה בזהירות להפריד את הרשתית של אפיתל הפיגמנט. אם הכיוון של הרשתית הוא חיוני כדי ללמוד שלך, מציינים את זה כמו שופט [12]. חותכים את העצב האופטי בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט ולהסיר את הרשתית מן עיינית. הערה כיוון משטחי רשתית: החלק הפנימי של הרשתית מכורבל הוא ganglבצד יון התא; החיצון הוא הצד photoreceptor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית מעל פני הרשתית הפנימי על ידי משיכתו בעדינות מעל בעזרת קיסם עץ. לשם כך, השתמש נפח קטן של פתרון תאיים כי רק מכסה את הרשתית. מקלות זגוגי עד קיסם והוא יכול להיגרר centrifugally את הרשתית. לאחר מכן, החל חתכים קצרים יחד למתחם הרשתית כדי להקל על שיטוח של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך תא ההקלטה photoreceptor בצד למטה, ופרש אותה על תחתית זכוכית (אנו משתמשים במכחול דק) ו לשתק אותו עם מסגרת ניילון מתוח של נירוסטה. הכן את הרשתית השני באותו אופן ולשמור כהה להתאים פתרון תאיים carboxygenated לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 2. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקינו את תא הקלטת בחושך תחת מיקרוסקופ לייזר זקוף סריקה superfuse הכנת רשתית ברציפות (לא פחות מ 5 מ"ל / min) עם פתרון תאיים carboxygenated מחומם ל 35 ° C. המיקרוסקופ (גם מצויד במצלמת CCD אינפרא אדום רגיש) שוכן על שולחן הלם קליטת האוויר בתוך כלוב פאראדיי עבור מיגון אלקטרוניים. מכסים את הכלוב עם וילון לא שקוף כדי לשמור על הכנת בחושך. יש לנו גם את המסך האור מסכי מחשב על ידי סרט אדום שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון לייזר אינפרא אדום באורכי גל 850-870 ננומטר, או יותר, לעבור למצב במצב נעול, ולהשתמש שני הפוטונים עירור לדמיין GFP-להביע תאים. להחליש את פלט לייזר באמצעות מסננים צפיפות ניטרלי בשליטת התוכנה סריקה לייזר למטה במידה כי הוא מספיק רק הכרה ברורה של התא פלורסנט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיקון-clamp הקלטות מהדק הנוכחי לשימוש micropipettes מצב זכוכית (אנו משתמשים בצינור זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ החיצונית 0.225 מ"מ עובי דופן) מלאים פתרון תאיים המורכב (מ"מ) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0.5 EGTא ', 10 HEPES, טיטרציה pH 7.4 עם KOH (מתן התנגדות פיפטה של ​​כ 5 MΩ). שים לב כי תנאי הניסוי אחרים כמו הקלטה מתח-clamp דורשים פתרון אחר. אם זריקות צבע הם הרצוי, להוסיף בדיקה ניאון (אנו משתמשים 10 mM אלקסה פלואוריד 594) או מולקולה נותב (3% Neurobiotin). הכנס את micropipette לתוך מחזיק ולוודא כי הפניה אלקטרודה (חוט כסף כלור) נמצא בקשר עם הפתרון תאיים בתא ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הלחץ micropipette ואת יעד GFP-להביע תאים (אנו משתמשים 40 פי טבילה אובייקטיבי מים; NA 1.25). גופי התא Amacrine נמצאים בשכבת גנגליון תא (ישירות מתחת לפני השטח בכיוון הנוכחי של הרשתית), וכן בחלק הפרוקסימלי של שכבת הגרעין הפנימית (כ 55-75 מיקרומטר עמוק בתוך ההכנות). לפני מגע micropipette עם תא המטרה, להגביל את הממברנה הפנימית (נדן עשוי גליה endfeet) על הרשתיתהמשטח צריך להיות חדרו. חדירה מוצלחת מוכר על ידי פתרון תאיים כי הוא מונע את מקצה micropipette ו מנתק את קרום הגבלת הפנימי של רקמת הרשתית הבסיסית כפי שניתן לראות בתמונה שידור אינפרא אדום נתפס על ידי מצלמה IR-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגישה לתא הרצוי על ידי השוואת עמדת סומה מהתמונה שני פוטונים עם התמונה של המצלמה IR-CCD מראה את המיקום של micropipette את ההקלטה. שים לב שלב זה לא יושג בקלות דורש קצת תרגול, משום התא GFP-לבטא יש להכיר בדמות שידור אינפרא אדום על מנת לכוון את micropipette אליה. מיקוד נכון מושגת כאשר קצה micropipette גורם מנקדים את פני השטח של התא ניתן לראות תמונה של שני הפוטון. חלופה להליך זה, השתמש צבע פלואורסצנטי (למשל אלקסה פלואוריד 594, 100 מיקרומטר) בפתרון תאיים לחשוף את המיקום micropipette בתמונה שני הפוטון. שני הפוטונים עירור אינפרא אדום מאפשרת הקרינה מספקת של הצבע הזה כדי להפוך micropipette ניכרת. לענין זה, להתאים את טווח גילוי בתוכנה סריקת לייזר כדי לכסות גם פלואורסצנטי אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור הלחץ micropipette ולקבל כל תא תיקון-clamp מהדק תצורה במצב הנוכחי. הקלטה שמיש צריך לתת פוטנציאל הממברנה של mV -50 ל -55 והאחרונה דקות לפחות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירויים חזותיים הווה נוצר על ידי תוכנה גירוי (אנו משתמשים QDs ידי תומאס אוילר, אוניברסיטת טובינגן, גרמניה) 11 על צג המחשב. התאם את המיקום המרחבי של הגירוי להיות מרוכז על התא נרשם: מארק עמדת התא על המסך מראה את התמונה של המצלמה שידור IR-CCD מרכז גירוי ספוט כמו על זה. כוון את עוצמת הגירוי על ידי הוספת פילטרים צפיפות ניטרלי לתוך הנתיב הקורה. עבור כיול של הספקטרום לפקח עוצמת לראות שופט [14]. בחר prolongeד interstimulus מרווח (למשל 15 שניות), כדי למנוע הסתגלות. כלול photodiode בתוך נתיב הקורה כדי לשמור על שיא של עיתוי הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את פרוטוקול גירוי ולהקליט את התגובות אור (אנו משתמשים קצב דגימה של 10 קילוהרץ עם סינון על 5 kHz שאינם spiking תאים; הקלטה ספייק קצב דגימה גבוה כמו kHz 20 מומלץ). השתמש בתוכנה גירוי האור כדי לעורר את תוכנת הצריבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צבע המילוי לתת מפוזר סוכן פלורסנט לתוך התא רשמה 30-45 דקות לפני retracting בעיון את micropipette מהתא. הקפידו לא להוציא את גוף התא. אם לא פלורסנט נותב Neurobiotin שימש, זה צריך להדמיה באמצעות קשירה streptavidin מצומדות כדי fluorophore (אנו משתמשים streptavidin-Cy3, מעל 1:400 בלילה 4 מעלות צלזיוס אחרי 20 דקות paraformaldehyde קיבעון של הרשתית; עבור צימוד, צבע מחקרים הדגירה streptavidin יכול להיות ממושכת 3 ד). לחילופין, זריקות יכול להיות גם הופיעה עםאלקטרודות חדה (&gt; 100 MΩ) כאשר צבע מונע iontophoretically לתוך התא משופד (פולסים מלבני: 0.25-1 NA, 100 אלפיות, 100 אלפיות מרווח, הזמן הכולל 3-6 דקות). </li></ol> 3. נציג תוצאות: את התוצאות הבאות שמקורם במחקר על עכבר לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת האמרגן עבור tyrosine hydroxylase 13,14, האנזים catalyzing שיעור הגבלת צעד בסינתזה קטכולאמינים (TH: עכבר ה-GFP). בהתבסס על הבהירות של ה-GFP אותות שתי אוכלוסיות תאים שונות וניתן להבחין בהם (איור 2A). תאים המבטאים את רמת ה-GFP גבוה בעל גוף התא ממוקם שכבת הגרעין הפנימית (INL, איור 2 א) או עקורים בשכבת תא גנגליון (GCL, איור 2B) ו לרבד באמצע השכבה הפנימית plexiform (IPL, איור 2C) . הם זוהו 2 תאים מסוג 14-16 ויכול להיחקר באופן שיטתי לגבי המורפולוגיה (איור 3) ולבחורפעילות rical (איור 4) למרות צפיפות האוכלוסין שלה מסתכם רק 250 תאים / מ"מ 2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ייצוג סכמטי של הגדרת הניסוי. שני הפוטונים עירור (אור אדום שביל מקווקו) של fluorophore-להביע תאים ברשתית שלם מאפשר מיקוד הראייה על ידי micropipette (אור ירוק בנתיב פליטה). הרשתית היא נתון לגירויים אופטי מוקרן דרך הקבל של המיקרוסקופ (נתיב האור הצהוב), ותגובות אור הסלולר נרשמים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. GFP-להביע את התאים flatmount הרשתית של TH: עכבר ה-GFP. שתי אוכלוסיות ניתן להבחין על ידי הבהירות של אות ה-GFP: 1 סוג התאים (תאים DA) הממוקם INL מראה הקרינה חלשה (ראו ראשי חץ) וסוג שכותרתו בעוצמה 2 תאיםעם גופי התא או את INL (ראה חיצים) או עקורים בתוך GCL (B) ריבוד הדנדריטים בשכבה S3 של IPL (C). סולם ברים, 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. מורפולוגיה של תא מסוג 2 מוזרק עם Neurobiotin נותב. נותב היה דמיינו לאחר מכן על ידי streptavidin-Cy3 מחייב (מג'נטה). מיקרוסקופ, שהוא גם המתארת ​​את אות ה-GFP (ירוק), היא השלכה של ערימות התמונה מכסה את GCL ו IPL. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. תגובות אור של תא מסוג 2 נמצא GCL. תגובת דפוס תאורה לבנה שדה מלא אור בעוצמה גוברת בטווח scotopic. עוצמת הגירוי ניתנת photoisomerizations לכל מוט לשנייה (Rh * / מוט / s). גירוי ממושך של 3 שימש יותר ברוריםיון של מרכיבי התגובה תחילת הגירוי (על התגובה) וכן לקזז (OFF תגובה).

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+MB+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. Gerfen, C. , Wiley. (1997).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li>
<li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22maging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).</li>
<li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li>
<li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li>
<li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li>
<li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
<li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li>
</ol>

העכברים טופלו ו מורדמים בהתאם להנחיות המוסדי לרווחת בעלי חיים לבין חוקי על ניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי ממשלת גרמניה.

שיטה זו מציעה את האפשרות ללמוד את התכונות החשמליות של נוירונים ספציפיים ברשתית שלם תחת הדרכתו חזותי ללא השפעה על מצב adaptational של הרשתית. זה מתאים במיוחד עבור אפיון של התאים כיום למד די רע בשל צפיפות אוכלוסין נמוכה כמו רוב אוכלוסיות של תאים amacrine. שני הפוטונים עירור היתרי הדמיה ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה אפילו ממקומות עמוקים יותר של הרקמה 17, תנאי הכרחי מיקוד מדויק ומוצלח תיקון-clamping של תאים בעיקר INL עם צפיפות גבוהה של גופי התא. הרשתית עכבר מבודד הוא בר קיימא עבור 3-4 שעות תחת תנאי הניסוי. אם הרשתית השני הוא מאוחסן בחושך מוחלט תחת בגז carbogen רציפה, הוא שומר את הצבע הסגול של photopigment מולבן וניתן להשתמש בו לאחר סיום ניסויים הרשתית הראשונה. בהתחלה, מיקודהתא הנבחר עם micropipette ב wholemount הרשתית היא קצת מאתגרת דורש קצת תרגול, במיוחד כאשר עובדים בחושך. כולל צבע פלואורסצנטי ב micropipette יכול לפשט את ההליך, כי התא micropipette גלויים תחת עירור שני פוטונים באותו זמן. עם זאת, הוספת רכיבים לפתרון תאיים עשוי לעכב היווצרות gigaseal או לגרום את איכות ההקלטה לסבול. לאחר שהושגו בהצלחה, הקלטה טובה יכולה להימשך כ 1 ח בעוד האור עירור אינפרא אדום עצמו נספג היטב רק על ידי קולטני האור ברשתית, נרגש GFP-לבטא בתאי פולטים אור בחלק הנראה של הספקטרום. עם זאת, fluorophores שמחים רק בנפח מוקד קטן אינו צפוי לשנות את המצב adaptational של הרשתית. כל עוד, עירור נדרשת רק המיקוד יכול להיות כבוי במהלך ההקלטה של ​​תגובות אור. UsefulnESS של גישה זו באה לידי ביטוי כבר על ידי מחקרים על אוכלוסיות ספציפיות של תאים amacrine 14,18 שממנו הקלטות אלקטרו אחרת היה אפשרי רק במקרה 12. לבסוף, טכניקה זו עוצמה נוספת יכולה להיות מורחבת על ידי כולל גישה תרופתי 14, Ca 2 + הדמיה 19 או באמצעות התאים מוזרקים ללימודי immunocytochemical או במיקרוסקופ אלקטרונים. בדרך זו, עמדת תפקודית של סוג תא נתון המעגלים ברשתית יכול להיות פרומים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / צייד-ment </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> משקפי ראיית לילה </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, גרמניה </td><td> Xtron F1 </td><td> כולל מקור אור 800 ננומטר </td></tr><tr><td> פילטר אופטי </td><td> שוט, מיינץ, גרמניה </td><td> RG9 </td><td> longpass מסנן עם הפסקת ב 690 ננומטר </td></tr><tr><td> איריס מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14061-09 </td><td> מעוקל עם להב 22 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> האביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15000-00 </td><td> ישר עם להב 3 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> הקלטה קאמרית </td><td> Luigs &amp; נוימן GmbH, Ratingen, גרמניה </td><td> 200-100 500 0180 סוג (TC) </td><td> טפלון קאמרית עם תלוש התחתונה רכוב מכסה זכוכית (כ 0.15 מ&quot;מ; מס &#39;500 200-100 0182) </td></tr><tr><td> תזרים דוד </td><td> רב מערכות, Reutlingen, גרמניה </td><td> PH01, TC01 </td><td> זלוף צינורית heatable עם טמפרטורה שלאנסור וטמפרטורה בקר </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לייזר סורק </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> נשלט על ידי תוכנה Confocal לייקה </td></tr><tr><td> שולחן האוויר </td><td> ניופורט </td><td> VH-3036W הכבושים </td><td></td></tr><tr><td> לייזר </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> מצב נעול הצונאמי טי: ספיר לייזר </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> PCO AG, Kelheim, גרמניה </td><td> PixelFly QE </td><td> כולל תוכנת שליטה </td></tr><tr><td> Micropipette זכוכית נימי </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, גרמניה </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> פלורסנט צבע </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> לא פלורסנט נותב </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרופוןromanipulator </td><td> Luigs &amp; נוימן GmbH, Ratingen, גרמניה </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> ממונע Mini25 יחידת מניפולטור עם תצוגה SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp מגבר </td><td> NPI אלקטרוניים GmbH, Tamm, גרמניה </td><td> ה-SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> נתונים רכישת תוכנה WinWCP </td><td> ג&#39;ון דמפסטר, אוניברסיטת סקוטלנד, גלזגו, בריטניה </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> גנרטור גירוי חזותי QDs </td><td> תומאס אוילר, אוניברסיטת טובינגן, גרמניה </td><td></td><td> צריך להיות מופעל במחשב נפרד שליטה 2 צגים (ממשק משתמש, גירוי צג) </td></tr><tr><td> הצפיפות מסננים ניטרלי </td><td> ITOS, מיינץ, גרמניה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון אלקטרו של ה-gfp, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

ללמוד את המאפיינים פיזיולוגיים קשרים סינפטיים של נוירונים ספציפיים ברקמות שלמות היא אתגר עבור אותם תאים חוסר תכונות מורפולוגיות בולט או להראות צפיפות אוכלוסין נמוכה. זה חל במיוחד amacrine תאים ברשתית, מעמד יוצא דופן של רב צורות interneurons המרכיבים בערך 30 תת ביונקים 1. למרות היותו חלק חיוני של עיבוד חזותי על ידי עיצוב פלט הרשתית 2, רוב תת אלה לא נחקרו עד כה בהקשר פונקציונלי כי המפגש התאים האלה עם אלקטרודה ההקלטה היא אירוע נדיר. לאחרונה, מספר רב של קווי עכבר מהונדס זמין המבטאים סמנים ניאון כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של היזמים עבור קולטני קרום או אנזימים ספציפיים משנה בלבד של נוירונים רקמות נתון 3,4. אלה מראש שכותרתו תאים ולכן הם accessibl<html> דואר אל microelectrode ביים מיקוד בשליטה מיקרוסקופיים, המתיר לימוד שיטתי של מאפיינים פיזיולוגיים שלהם באתרם. עם זאת, עירור של סמנים ניאון מלווה בסיכון phototoxicity עבור רקמת החיים. ברשתית, גישה זו היא בנוסף הקשו על ידי הבעיה האור גורם עירור גירוי מתאים של קולטני האור, ובכך גרימת photopigment הלבנת והעברת מעגלים רשתית למצב האור מותאם. חסרונות אלה להתגבר באמצעות עירור אינפרא אדום נמסר על ידי לייזר במצב נעול בפולסים קצרים של טווח femtosecond. עירור שני פוטון מספקת מספיק אנרגיה עבור עירור fluorophore ו באותו זמן מגבילה את עירור לנפח רקמה קטן למזער את הסיכונים של נזקי 5. כמו כן, הוא עוזב את הרשתית מגיבים לגירויים חזותיים מאז אור אינפרא אדום (&gt; 850 ננומטר) נספג היטב רק על ידי photopigments 6. s = &quot;jove_content&quot;&gt; במאמר זה אנו מדגימים את השימוש של הרשתית עכבר מהונדס להשיג אלקטרו בהקלטות באתרו של ה-GFP-להביע תאים ממוקדות חזותית על ידי עירור שני הפוטונים. הרשתית היא מוכנה ומתוחזק בחשכה יכול להיות חשוף לגירויים אופטיים אשר מוקרנים דרך הקבל של המיקרוסקופ (איור 1). Patch-clamp הקלטה של ​​תגובות אור ניתן לשלב עם צבע מילוי כדי לחשוף את המורפולוגיה כדי לבדוק לצבוע הפער צומת בתיווך צימוד תאים שכנים, כך תא היעד יכול ללמוד על רמות על ידי ניסויים שונים.

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

חקירת התכונות הפיזיולוגיות והקשרים הסינפטיים של נוירונים ספציפיים ברקמה שלמה מהווה אתגר עבור תאים שחסרים...

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התגובות לאור ואת המורפולוגיה של נוירונים בודדים ברשתית שלמה, באמצעות שימוש בקו עכברים המבטא סמן פלואורסצנטי באופן בלעדי בסוגי תאים ספציפיים. הדבר משיג תחילה על ידי ניתוח של העין כדי לקבל רשתית מבודדת. השלב השני הוא הנחת הרשתית תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי והדמיות של תא באמצעות עירור אינפרא-אדום דו-פוטוני.לאחר מכן משתמשים במיקרופיפט כדי להשיג תצורת patch clamp של תא שלם (whole cell patch clamp configuration) לצורך הקלטה ומילוי בצבע. בסופו של דבר, הכנה זו מאפשרת הקלטות של תגובות תאיות לעירור באמצעות אור (photo stimulation) וחושפת את המורפולוגיה של התא המוקלט באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטת patch clamp לא מכוונת מרשתית העין, הוא שניתן לכוון את ההקלטה באופן חזותי לעבר תא מסומן פלואורסצנטית ללא צורך בעירור הרשתית באמצעות אור העירור.שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במחקר רשתית העין, כגון מהי התרומה של אוכלוסיית תאים מסוימת לעיבוד מידע חזותי? זאת גם אם לאוכלוסיית התאים צפיפות נמוכה והיא אינה בעלת מאפיינים מורפולוגיים מובחנים העשויים להקל על הזיהוי. התחילו את הניסוי על ידי הסגאת העכבר בחושך למשך שלוש שעות לפחות לפני הניסוי.בינתיים, הכינו את התמיסה החוץ-תאית כפי שמתואר במאמר המצורף והחליפו את האוויר בה באמצעות קרבוגן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הקריבו את העכבר והוציאו את העדשות מהעיניים באמצעות מספרי קשת עבור הקשתית. העבירו אותן לצלוחית עם תמיסה חוץ-תאית.לאחר מכן, הנח אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציית (מיקרוסקופ סטריאוסקופי) בעזרת מספרי קפיץ. הסר את הקרנייה ואת הגוף הציליארי על ידי פתיחת גלגל העין לאורך ה-ora serrata. הוצא את העדשה והפרד בזהירות את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי.לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי בין הרשתית לאפיתל הפיגמנטים. הוציאו את הרשתית מתוך גביע העין. שימו לב שהחלק הפנימי של הרשתית המגולגלת הוא צד תאי הגנגליון.הצד החיצוני הוא צד הפוטורספטורים. לאחר מכן, הסר את הזגוגית מפני השכבה הפנימית של הרשתית על ידי משיכה עדינה בעזרת קיסם עץ. לאחר מכן, בצע חתכים קצרים לאורך היקף הרשתית כדי להקל על יישור הרקמה.בשלב הבא, העבירו את הרשתית לתא ההקלטה כאשר צד הפוטורספטורים פונה כלפי מטה. פרסו אותה על התחתית הזכוכיתית בעזרת מברשת עדינה וקבעו אותה באמצעות מסגרת פלדת אל-חלד עם חוטי ניילון. הניחו את תא ההקלטה בחשכה תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר עומד.בצעו פיוזציה (Superfuse) רצופה של הדגימה הרטינלית בקצב שאינו נמוך מ-5 mL לדקה. כאשר התמיסה החוץ-תאית מחמצנת חומת ב-35 °C, המיקרוסקופ ממוקם על שולחן אוויר בולם זעזועים בתוך כלוב פאראדיי. לצורך מיסוך אלקטרוני, כסו את הכלוב בכיסוי לא שקוף כדי לשמור על הדגימה בחשכה.אנו מסננים גם אור ממסכי מחשב באמצעות סרטים שקופים בצבע אדום. כוון את לייזר האינפרה-אדום לאורכי גל של 850 עד 870 ננומטרים או אורכי גל ארוכים יותר. עבור למצב של נעילת מוד (mode locked) והשתמש בעירור דו-פוטוני כדי להדגים תאים המבטאים GFP.עבור הקלטת patch clamp, מלאו מיקרו-פיפטות מזכוכית בורוסיליקטור בתוך התמיסה התו-תאית המכילה פרוב פלואורסצנטי, כפי שמתואר במאמר המצורף. לאחר מכן, הכניסו את המיקרו-פיפטה למחזיק. וודאו שאלקטרודת הייחוס נמצאת במגע עם התמיסה החוץ-תאית בתא ההקלטה.בשלב הבא, הפעל לחץ באמצעות המיקרו-פיפט על תא המטרה המבטא A GFP, תוך שימוש בעדשה אובייקטיבית של טבילה במים עם הגדלה של 40; גופי תאי האומיקרון ממוקמים בשכבת תאי הגנגליון וכן בחלק הפרוקסימלי של השכבה הבין-צלולה. לפני שהמיקרו-פיפט בא במגע עם התא המטרה, חדירה דרך הקרום המגביל הפנימי (inner limiting membrane) על פני הרשתית. חדירה מוצלחת מזוהה על ידי יציאת התמיסה התאיכלית (intracellular solution) מקצה המיקרו-פיפט וההיפרדציה של הקרום המגביל הפנימי מרקמת הרשתית שמתחתיו. הצבע הפלואורסצנטי בתמיסה התאיכלית יכול לחשוף את מיקומו של המיקרו-פיפט בתמונת הדו-פוטון בעת ההתקרבות לתא הרצוי.לאחר מכן, שחרר את הלחץ מהמיקרו-פיפט והשג קונפיגורציית whole cell patch clamp. במצב current clamp, הקלטה שמיש צריכה להניב פוטנציאל ממבנה של 50- עד 55- millivolts ולהימשך לפחות 20 דקות. לאחר מכן, הצג את הגירויים הוויזואליים שנוצרו על מסך המחשב.כוון את עוצמת הגירוי על ידי החדרת מסנני צפיפות ניטרלית למסלול הקרן, והתאם את המיקום המרחבי של הגירוי למרכז התא המוקלט. לאחר מכן, הפעל את פרוטוקול הגירוי והקלט את התגובות לאור. השתמש במחולל הגירויים כדי להפעיל את תוכנת ההקלטה.שלבו פוטודיודה בנתיב הקרן כדי לתעד את תזמון הגירוי. היזהרו שלא למשוך את גוף התא בעת נסיגת המיקרו-פיפטה. עם סיום מילוי הצבע, הניחו לחומר הפלואורסצנטי לדיפוזיה אל התא המוקלט למשך 30 עד 45 דקות.להלן דוגמה לתאים המבטאים GFP במישראתם במישראתם ב-retinal flat mount של טירוזין הידרוקסילאז (tyrosine hydroxylase); ניתן להבחין בין שתי אוכלוסיות על פי עוצמת אות ה-GFP. תאי דופמין מסוג 1, הממוקמים בשכבה הבין-צלולית (interclear layer), מבטאים פלואורסצנציה חלשה, כפי שמוצג על ידי חצי החיצים באיור A. תאים מסוג 2 סומנו בעוצמה רבה וגופי התאים שלהם נמצאים בשכבה זו, כפי שמוצג על ידי החיצים באיור A, או מוסטים לשכבת תאי הגנגליון (ganglion cell layer), כפי שמוצג באיור B. איור C מראה ריבוד דנדריטי של תאים מסוג 2 בשכבה השלישית של השכבה הפלקסיפורמית הפנימית (inner plexiform layer). מוצג כאן דוגמה למורפולוגיה של תא מסוג 2 שהוזרק עם הסמן neuro biotin.הסמן הודגם מאוחר יותר על ידי קישור לסטרפטאבידין המסומן פלואורסצנטית, המוצג כאן בצבע מגנטה. כאן מוצגים תבניות תגובה שונות של תא מסוג שני הממוקם בשכבת תאי הגנגליון לאור לבן. גירוי ממושך של שלושה שניות שימש להבחנה טובה יותר של מרכיבי התגובה בעת תחילת הגירוי ובסיומו, בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניסויים פרמקולוגיים, דימוי סידן או אימונוכימיה, במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון התפקיד התפקודי של סוג תא מסוים במעגלי הרשתית.

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

הסרטון מדגים שיטה לחקור את ההתרגשות של תאים עצביים המבטאים חלבון פלואורסצנטי באמצעות מהדק זרם טלאי שלם. במצב מהדק הנוכחי, פוטנציאלי פעולה המעידים על רגישות עצבית נוצרים.

חקר ההתרגשות של תאי עצב פלואורסצנטיים באמצעות מהדק טלאי של תא שלם

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

חקור תגובות אור ומורפולוגיה של נוירונים ברשתית העכברוש באמצעות תצפית בשני פוטונים ורישום patch-clamp מכוון. שיטה זו מאפשרת זיהוי ויזואלי מדויק של תאים מסומנים בפלואורסצנטית ללא גירוי מוקדם.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

גלה סרטונים נוספים