אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תגובות האור והמורפולוגיה של נוירונים בודדים ברשתית השלמה על ידי שימוש בקו עכבר המבטא סמן פלואורסצנטי אך ורק בסוגי תאים ספציפיים. זה מושג על ידי ניתוח העין תחילה כדי לקבל רשתית מבודדת. השלב השני הוא לשים את הרשתית תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר ולדמיין תא על ידי עירור אינפרא אדום של שני פוטונים.

לאחר מכן משתמשים במיקרו פיפטה כדי להשיג תצורת מהדק תיקון תא שלם לרישום ומילוי צבע. בסופו של דבר, תכשיר זה מאפשר הקלטות של תגובות תאיות לגירוי פוטו וחושף את המורפולוגיה של התא המוקלט על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הקלטת מהדק תיקון לא מודרך מהרשתית הוא שניתן לכוון את ההקלטה חזותית לעבר תא המסומן באופן פלואורסצנטי מבלי לגרות את הרשתית עם אור העירור.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הרשתית, כגון מהי התרומה של אוכלוסיית תאים נתונה לעיבוד מידע חזותי? גם אם לאוכלוסיית התאים יש צפיפות נמוכה ואינה נושאת מאפיינים מורפולוגיים מובהקים שעשויים להקל על הזיהוי. התחילו את הניסוי הזה על ידי התאמת העכבר בחושך לפחות שלוש שעות לפני הניסוי.

בינתיים, הכינו את התמיסה החוץ-תאית כמתואר בכתב היד המצורף ובעבעו אותה בקרבוגן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הקריבו את העכבר וגרעיני את העיניים בעזרת מספריים מעוקלים. העבירו אותם לצלחת של תמיסה חוץ-תאית.

ואז הניחו אותו מתחת למיקרוסקופ מנתח עם מספריים קפיציים. הסר את הקרנית ואת הגוף הריסי על ידי פתיחת פקעת העין לאורך ההילה serrata. הוצא את העדשה והפרד בזהירות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט.

לאחר מכן, חתוך את העצב האופטי בין הרשתית לאפיתל הפיגמנט. יש להסיר את הרשתית מכוס העין. שימו לב שהחלק הפנימי של הרשתית המכורבלת הוא צד תאי הגנגליון.

החלק החיצוני הוא צד קולטני האור. לאחר מכן, הסר את הזגוגית ממשטח הרשתית הפנימי על ידי משיכתו בעדינות בעזרת קיסם עץ. לאחר מכן יש למרוח חתכים קצרים לאורך היקף הרשתית כדי להקל על השטחת הרקמה.

לאחר מכן, העבירו את הרשתית לתא ההקלטה כשצד קולטני האור כלפי מטה. פרשו אותו על תחתית הזכוכית בעזרת מברשת דקה ושיתקו אותו עם מסגרת ניילון מתוחה מפלדת אל חלד. הנח את תא ההקלטה בחושך מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר זקוף.

סופר להתיך את תכשיר הרשתית ברציפות בקצב של לא פחות מחמישה מיליליטר לדקה. עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת לרכב המחוממת ל-35 מעלות צלזיוס, המיקרוסקופ ממוקם על שולחן אוויר בולם זעזועים בתוך כלוב פאראדיי. למיגון אלקטרוני, כסו את הכלוב בווילון לא שקוף כדי לשמור על ההכנה והחושך.

אנו גם מסננים אור ממסכי מחשב על ידי סרטים שקופים אדומים. כוון את לייזר האינפרא אדום לאורכי גל של 850 עד 870 ננומטר או יותר. עבור למצב מצב נעול והשתמש בשני עירור פוטונים כדי לדמיין תאים המבטאים GFP.

להקלטת מהדק תיקון, מלאו מיקרו פיפטות מזכוכית בורו סיליקט בתמיסה התוך-תאית המכילה בדיקה פלואורסצנטית כמתואר בכתב היד המצורף. לאחר מכן הכנס את המיקרו פיפטה למחזיק. ודא שאלקטרודת הייחוס נמצאת במגע עם התמיסה החוץ-תאית בתא ההקלטה.

לאחר מכן, הפעל לחץ על מטרת המיקרו פיפטה תא מבטא GFP באמצעות טבילה במים פי 40 מטרה, גופי תאי אומיקרון ממוקמים בשכבת תאי הגנגליון כמו גם בחלק הפרוקסימלי של שכבת הבין-קליר לפני שמגעי המיקרו פיפטה עם התא הממוקד חודרים לקרום המגביל הפנימי על פני הרשתית. חדירה מוצלחת מזוהה על ידי התמיסה התוך-תאית המונעת החוצה מקצה המיקרו פיפטה וניתוק הממברנה המגבילה הפנימית מרקמת הרשתית הבסיסית. הצבע הפלואורסצנטי בתמיסה התוך-תאית יכול לחשוף את מיקום המיקרופיפטים בתמונת שני הפוטונים תוך התקרבות לתא הרצוי.

לאחר מכן שחרר את הלחץ מהמיקרו פיפטה וקבל תצורת מהדק תיקון תא שלם. במצב מהדק נוכחי, הקלטה שמישה אמורה לתת פוטנציאל ממברנה של מינוס 50 עד מינוס 55 מילי-וולט ולהימשך לפחות 20 דקות. לאחר מכן, הצג את הגירויים החזותיים שנוצרו על צג מחשב.

כוונן את עוצמת הגירוי על ידי הכנסת מסנני צפיפות ניטרלית לנתיב האלומה והתאם את המיקום המרחבי של הגירוי למרכז התא המוקלט. לאחר מכן, התחל את פרוטוקול הגירוי ורשום את תגובות האור. השתמש במחולל הגירויים כדי להפעיל את תוכנת ההקלטה.

כלול דיודת צילום בתוך נתיב האלומה כדי לתעד את תזמון הגירוי. היזהר לא לשלוף את גוף התא בעת נסיגת המיקרו פיפטה. כאשר זה נעשה למילוי צבע, הניחו לחומר הפלואורסצנטי להתפזר לתוך התא המוקלט למשך 30 עד 45 דקות.

הנה דוגמה ל-GFP המבטא תאים בהרכבה שטוחה ברשתית של מתחת למקדם שלהם עבור טירוזין הידרוקסילאז, ניתן להבחין בין שתי אוכלוסיות על ידי בהירות אות ה-GFP. תאים דופמינרגיים מסוג אחד הממוקמים בשכבה הבין-שקופה, מבטאים פלואורסצנטיות חלשה כפי שמוצג על ידי ראשי החצים. באיור A.תאים מסוג שני סומנו באופן אינטנסיבי ויש להם גופי תאים בשכבה כפי שמוצג על ידי חיצים באיור A או נעקרו בשכבת תאי הגנגליון כפי שמוצג באיור B, איור C מציג ריבוד דנדריטי של תאים מסוג שני בשכבה שלוש של שכבת הפרספקס הפנימית המוצגת כאן היא דוגמה למורפולוגיה של תא מסוג 2 המוזרק עם העוקב נוירו-ביוטין.

העוקב הודגם מאוחר יותר על ידי קשירה לסטרפטווידין המסומן פלואורסצנטי, המוצג כאן במג'נטה. להלן דפוסי תגובה שונים של תא מסוג 2 הממוקם בשכבת תאי הגנגליון לאור לבן. גירוי ממושך של שלוש שניות שימש להבחנה טובה יותר של מרכיבי התגובה בגירוי, התחלה וקיזוז בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניסויים פרמקולוגיים, הדמיית סידן או אימונוכימיה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התפקיד התפקודי של סוג תא נתון במעגלי הרשתית.