איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

כדי לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים, יש לשכפל את שני הגנים המעניינים לתוך ה-BF והווקטורים שלנו באמצעות טכניקת כמיהה לשער. מבנים אלה הופכים ל-aerium GV 3 1 0 1. תרביות החיידקים GV 3 1 0 1 המכילות לבנייה יתערבבו ויחדרו יחד לעלים.

אם שני החלבונים המועמדים מתקשרים זה עם זה, ניתן לצפות באות YFP באמצעות מוקד התוצאה מקסיקו. המטרה העיקרית של טכניקת BFC היא לבחון אינטראקציה בין שני חלבונים. בוואו, יצרנו סדרה של BFC ו-IS תואמי שער שני וקטורים היברידיים המספקים לחוקרים כלים קלים לשימוש לביצוע שני מבחנים היברידיים של BFC ו-ISTO.

בסרטון זה, אנו הולכים להדגים את קלות השימוש במערכת ה-BFC שלנו. כדי לבחון את החלבון, אינטראקציות חלבון באופן בלתי סביר מתעלות על מערכת הביטוי. ראשית עליך להכין את תרבית החיידקים GV 3 1 0 1.

אתה צריך לבחור מושבה אחת מהצלחת שלך ולחסן בחמישה זכרים של מדיום YEB עם אנטיביוטיקה מתאימה. אז אתה צריך לנער את התרבויות האלה בן לילה ב -28 מעלות. המהירות היא 200 ריצות לדקה.

תרביות החיידקים אמורות להיות מוכנות למחרת בבוקר. ודא שהחיידקים D גדלו. הוציאו את התרביות מהחממה והעבירו זכר אחד מכל תרבית לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 זכר.

הכניסו את צינורות הצנטריפוגה לצנטריפוגה שולחנית. סובב את החיידקים ב 1000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, השליך את הרשת. לאחר מכן צפו בפנאט על ידי הוספת ארוחה אחת של מדיום הסתננות והערכה מחדש על ידי ליטוף כמה פעמים.

חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות. זה חשוב מכיוון שהוא עוזר להסיר את עקבות האנטיביוטיקה במדיום החיידקי, מה שגורם לך לשתול כלבי ים לאחר הסתננות. לאחר הכביסה הסופית, החייאה תלתה את המזרן באמצעי חדירה של 0.5 זכר שחייב 600 מתלי חיידקים אלה באמצעות פוטומטר ספקטרו באמצעות מדיום הסתננות כבקרת בנק.

לאחר מדידת ה-OD, עליך להתאים את ה-OD באמצעות מדיום הסתננות. ה-OD הסופי צריך להיות בין 1 ל-1.2. כדאי להכין את כל תרחיפי החיידקים לפני שתמשיך לשלב הבא.

העבירו כמות שווה של תרחיפי חיידקים המתאימים לשני החלבונים המועמדים שלכם וערבבו אותם בצינור זכר חדש 1.5 תערובת חיידקים שליליים קשורה כעת לחדירה. הכן את כל השילובים ואל תשכח לכלול בקרה שלילית. עליך להשתמש בקוד של חמישה עד שישה שבועות ובצמחים בצורה הטובה ביותר לחדירה.

אתה יכול להוציא את הצמחים מחדר הגידול ולהניח אותם על אנחנו לילה במשך שעה לפני החדירה כדי לפתוח את מתקפת הסערה. זה יעזור בתהליך ההסתננות. צייר כ -100 מיקרוליטר של חיידקים תלויים של Resus.

מערבבים ליד מזרק קצה החלקה זכר אחד ללא המחט. הניחו את קצה המזרק על הצד התחתון של העלה. תמכו בצד העליון של הברך בעזרת האצבע.

בדרך כלל לחץ כלפי מטה על הבוכנה. אתה אמור להיות מסוגל לראות את הנוזל מתפזר דרך העלה ועדיין מרגיש את חללי האוויר הדקים יותר של מזו לאחר החדירה מאפשרים את האוויר שחדר עם עט סימון. אחרת, לאחר יומיים, לא תוכל לזהות את ההסתננות A.אם אתה צריך להסתנן עם תערובת חיידקים שונה, הקפד לרסס את הכפפה שלך באתנול 50% או להחליף את כפפות ה-G שלך בין הסתננות.

נסה להשאיר מרווח צלעות של מטר אחד בין הסתננות כדי למנוע זיהום צולב. יש לנטר את אותות ה-PFA כל 24 שעות מהסתננות עד חמישה ימים. אתה יכול להשתמש בשני שרוולי כיסוי בגדלים שונים כדי להחזיק את המדגם.

ראשית, הניחו טיפה אחת של מיני מים על שרוול כיסוי חריץ. לאחר מכן חותכים חתיכה קטנה של רקמת סכין בתוך האזור שהסתנן. נסה להימנע מבחילה וריד בדגימה.

הכניסו את רקמת הסכין החתוכה למים על המגלשה מתחת למטה, כסו אותה באמצעות שרוול זרם קטן יותר ולחצו בעדינות. כעת ניתן לצפות במדגם תחת היקף מקסיקו. כאן אנו משתמשים במקסיקו הקונפוקלית הזו של NACA T CSS P כדי לדמיין את אות ה-BIFC.

ניתן להשתמש אפילו בניחוח רגיל של מקסיקו. קונפוקלי מספק תמונות טובות יותר ומזהה אותות חלשים. אתה יכול להשתמש בפרמטר YFP כדי לזהות את אותות ה-VFC במערכת NCAs P Two זו.

אתה יכול פשוט ללחוץ פעמיים על ההגדרה המוגדרת מראש של YFP כאן, שתפעיל אוטומטית את העירור ותגדיר את טווח זיהוי הפליטה. אם אתה משתמש במערכת אחרת, עיין במדריך כדי להגדיר כראוי את הפרמטרים. אנו מקווים שלאחר צפייה בסרטון זה, תוכל לבצע את ה-BFCE לבדיקת אינטראקציות חלבון באמצעות מערכת ביטוי MI Transcend.

אתה יכול גם ליישם הליך זה על צמחי טבק ו-AY. וקטורי ה-BFC שלנו מכילים גם תג HA ותג דגל בהתאמה, כך שתוכל גם לבצע כתובת IP משותפת כדי לאמת את האינטראקציות במידת הצורך.