ביאור של תפקוד הגן הצמח דרך Genomics, metabolomics משולבים אינפורמטיקה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגלות ולאפיין תפקודים גנטיים חדשים באמצעות אנוטציה של גנים, תוך שימוש בניתוח משולב של פרופילי מטבוליטים וניתוח ביטוי משותף (co-expression). מטרה זו מושגת על ידי תכנון ניסויי המתמקד במסלולים מטבוליים ספציפיים ובמיני צמחים מסוימים. כשלב שני, נעשה שימוש בגישות אנליטיות כדי לבנות את המסלול המטבולי המלא, בהתבסס על המבנים הכימיים של התרכובות שזוהו.

בשלב הבא, המבנה של המסלול החזוי משולב עם אנליזת ביטוי משותף (co-expression analysis) לצורך צמצום הגנים המועמדים, אשר עשויים להצביע על גנים מרכזיים במטבוליזם. לבסוף, התוצאות מתקבלות על ידי ביצוע מערכות מינימליות של ניסויים תוך שימוש יעיל במספר משאבים ביולוגיים, במטרה לאפיין את הזיהוי התפקודי של הגנים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר מצאנו מתאם גבוה מאוד של גנים ציסטיים של Abosi OID במאגר הביטוי המשותף בשם ate.

הסקנו כי אסטרטגיה זו היא אחת הדרכים המהירות ביותר למציאת תפקודי גנים חדשים באמצעות מאגרי נתונים זמינים לציבור ושימוש יעיל במשאבים ביולוגיים. כדי להתחיל את המיצוי, קצרו את חומרי הצמח והקפיאו אותם מיד בחנקן נוזלי. לאחר שהחומרים קפאו, טחנו את חומרי הצמח לאבקה באמצעות טחנת כדורים (mixer mill), חלקו את חומר הצמח הקפוא למבחנות Eppendorf בנפח 2 ml, והוסיפו למבחנה כדור מתכת.

הוסיפו 250 µL של בופר מיצוי לכל 50 mg של דגימה. בופר המיצוי מכיל את הסטנדרט הפנימי לצורך נורמליזציה. לאחר מכן, הומוגניזו את האבקה הקפואה באמצעות מטחנה מעורבבת (mixer mill) למשך שתי דקות.

בתדר של 25, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 12,000 RPM למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את supernatant למסנן צנטריפוגי. לאחר ביצוע סבב שני של צנטריפוגה, העבירו את supernatant למבחורת einor חדשה.

בשלב הבא, הגדירו את ה-HPLC על ידי בדיקה תחילה שטמפרטורת תנור העמודה היא 35 °C, וטמפרטורת מגש הדגימות היא 10 °C. הגדירו את תנאי הספקטרומטריית המסה ובדקו את מצב הוואקום ואת הניפוח של הנימים (capillary heating). בצעו כיול של טעינת יתר של מסה (mass overcharge calibration) של גלאי ה-MS באמצעות הזרקת עירוי של תערובת תמיסות הכיול.

השתמשו באפליקציית הכיול האוטומטית בתוכנה. לאחר מכן, העבירו 50 µL מהתמציות לבקבוק זכוכית. עבור HPLC, בצעו לפחות חמש הזרקות של באפר מיצוי לפני ביצוע האנליזה לדוגמה הראשונה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר הגדרת כלי לניתוח ספקטרומטריית מסות, בחר את הנתונים שיועבדו. הכן טבלה של הפסגות (peaks) המותירות עניין שזוהו, בהתאם לסוג התרכובות המופיע בפרוטוקול הכתוב. זהה את הפסגות באמצעות קו-אבולוציה עם תרכובות סטנדרטיות, ואנוטט את הפסגות שזוהו באמצעות ניתוח Ms.MS, ספרות, סקר וחיפוש במאגרי מידע של מטבוליטים בשלב זה.

חיזוי המסלול צריך להתבסס על המבנים הכימיים על ידי קישור התפקוד האנזימטי במסלול המטבולי. לכן, שלבים אלה צריכים להתבצע באמצעות זיהוי מדויק של התרכובות שהתגלו. מאגרי מידע של מסלולים מטבוליים כלליים, כגון מאגר ה-keg ו-plant psych, יעילים מאוד לחיזוי המסלול המטבולי הרלוונטי.

כדי להכין רשימת גנים עם גנים אורתולוגיים של Arabidopsis ומספרי זיהוי (ID), הורד תחילה רשימת מזהי גנים ממאגר הגנומי. הוסף את מזהי הגנים של Arabidopsis עבור גנים אורתולוגיים במקרה שהצמח הנחקר אינו Arabidopsis. לאחר מכן, הכן רשימה של גנים במסלול הביולוגי הרלוונטי.

אנוטציה של נתוני מסלולים ונתוני משפחות גנים של Arabidopsis זמינה באתר TAAR. לאחר מכן ניתן לשלב רשימות של גנים אורתולוגים של Arabidopsis. בצע ניתוח של רשת ביטוי משותף (co-expression network analysis) באמצעות רשימת מזהי הגנים שהוכנה, כדי לחפש במסד הנתונים המתאים ביותר עבור המסלול החזוי.

בדיקת המתאם של זוגות גנים ידועים במסלול הנחקר. במקרה שמאגר הביטוי המשותף (co-expression) או מאגר ביטוי הגנים אינם זמינים, ובמסלול הנחקר, יש להשתמש במאגר הביטוי המשותף של Arabidopsis עם רשימה של גנים אותולוגיים של arabidopsis.

בשלב הבא, בנה את תשתית רשת ביטוי השיתופי (co-expression network) של היעד. בהתבסס על הקשרים של הגנים המוכרים במסלול הנחקר, הוסף גנים מועמדים בעלי מתאם ובדוק את ההערות הגניות (gene annotation) שלהם במשפחות החיזוי בתוך הקשרים של רשת זו, כדי למצוא את המועמד המבטיח ביותר.

יש לתאם את סף ערכי המקדמים של הגנים בהתאם למבנה הרשת ולצפיפות הגנים המתואמים. כעת, צור רשימה של גנים שניתן לצמצם אותם כגנים המתמחים במסלול המטרה. באמצעות רשימה זו, בדוק את ביטוי הגנים של הסגוליות האיבריות ואת תגובות העקה של הגנים המועמדים.

התחילו את אינטגרציית המידע על ידי הוספת גנים מאופיינים היטב, ששימשו לשאילתות של ניתוח ביטוי משותף (co-expression analysis), אל המסלול המטבולי החזוי. בצעו סקירה ספרותית כדי לבדוק אם החלקים הבלתי מאופיינים של מסלול זה הם חדשים, כולל שלבים אנזימטיים בלתי מאופיינים, חלבוני מעבר וגורמי שעתוק. בשלב זה, חזו את אנוטציית הגנים המתאימה ביותר עבור השלבים הבלתי מאופיינים החסרים אלו.

שילוב תוצאות פרופיל המטבוליטים וגנים מועמדים של ביטוי גנים in silico בהתבסס על המסלול החזוי. לאחר מכן, סדרו את הגנים המועמדים על המסלול החזוי בהתאם לתפקוד הגן. לדוגמה, אצטיל-טרנספראז עבור מטבוליט מאצטיל, גליקוזיל-טרנספראז עבור גליקוזיד ו-P450 עבור תרכובת חמצונית.

בדוק את העקביות של ספציפיות רקמות או תגובות למסגרות עקה בין הצטברות מטבוליטים לבין רמות הביטוי של הגנים המועמדים. כמו כן, בדוק את הקשרים למסלולי מטבוליזם אחרים לצורך אספקת סובסטרטים ואת הגנים המגיבים לעקה. כשלב סופי, בצע ניסוי לזיהוי תפקודי הגן באמצעות משאבים ביולוגיים כגון ספריית מוטציות knockout וספריית cDNA באורך מלא.

להלן דוגמה לניתוח רשת של ויסות משותף (co-regulation) של נתיב האנתוציאנין. ניתוחי ביטוי משותף (co-expression) בוצעו באמצעות מדד הביטוי המשותף של PRAM, המבוסס על מערך הנתונים של גרסה שלוש המוסיפה את תוכנית PX המוצגת כצמתים אדומים; 12 גנים אנזימטיים של אנתוציאנין ושני גורמי שעתוק לייצור אנתוציאנין שימשו לחיפוש גנים מועמדים. רשת ביטוי משותף הכוללת 68 גנים מועמדים מתואמים ו-14 גני שאילתה, שוחזרה על ידי קישוריות של חיפוש קבוצות באמצעות מאגר הנתונים prime, מה שהביא לקובצי פלט של T net ששורטטו באמצעות תוכנת PX.

הצמתים הכחולים מצביעים על הגנים המועמדים שהראו מתאם עם גני אנתוציאנין לאחר התפתחותם. אסטרטגיה זו תספק רמז יעיל לחיזוי תפקודים של גנים חדשים במטבוליזם של צמחים.