Name: ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: למדו לנתח את מיקום מחזור התא בתאי יונקים באמצעות ציטומטריית זרימה וסימון BRDU. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מדויק של תאים בשלבי G1, S ו-G2/M לחקר פרוליפרציה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) והחברה הקנדית למלחמה בסרטן למימון מחקר מחזור התא במעבדה שלהם. MJC הוא מקבל המלגה MD / PhD מן CIHR. MJC ותואר שני חברי ההכשרה CaRTT.

<ol><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li>
<li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker%2C+Us9-GFP%2C+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li>
<li>Qin, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li>
<li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell.+Int%22%5BJournal%5D)">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li>
<li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li>
<li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li>
<li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li>
<li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li>
<li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מניסיוננו, הצלחה עם טכניקות אלה תלויה שולט מפתח כמה תנאי הניסוי. האחד הוא הקמת לשלוט באופן אסינכרוני מתרבים לשימוש בניסויים אלו. שליטה זו משרתת שלוש מטרות חשובות. ראשית, היא מבטיחה כי התנאים תרבות המשמש את כל דגימות ניסיוני מספיקות כדי לתמוך שגשוג מתמשך בהעדר טיפול. מדגם זה גם משרת את המטרה של בקרה חיובית על המתודולוגיה מכתים על מנת להבטיח כי BrdU או CD20 בתאים חיוביים ניתן להבחין כאשר הם נוכחים. לבסוף, מדגם זה משמש לכייל את cytometer לזרום. מדגם זה לשלוט יכול לשמש כדי להתאים את עוצמת propidium מכתים יודיד כדי לזהות תאים ו - 2N 4N ב 200 ו 400 בהתאמה. יתר על כן, רגישות הזיהוי של BrdU או CD20 יכול להיות מותאם כך אותות שליליים וחיוביים מרוכזים כפי שמוצג דמויות 1A ו-2A. כאשר כל הדגימות יש ריכוז דומה של תאים PI-Rפתרון Nase, ולאחר מכן התאמות כמה cytometer הם הצורך דגימות עוקבות מנוהלים. זה חשוב מסיבות באיור. 4B ו 5B שם הצטברות G1 חזקה יוצרת למעשה שיא G1 יחיד שיכול להתפרש בטעות G2 / M. הניסויים נציג גם לעשות נקודות חשובות אחרות. קודם כל, הם מראים כי ספיגת BrdU וסימון יכול להשתנות בין סוגי תאים. מסיבה זו חשוב באופן אמפירי לקבוע את אורך הפולס ותנאי מכתים צריכה מספקת לזהות תאים ב-S שלב. באופן כללי, סוגי תאים כפולים, כי בתרבות בתוך 24 שעות או פחות יכול להיות מתויג עם BrdU בעוד שעה. איטית יותר סוגי תאים הגוברת עשויה לדרוש פולסים ארוכים שינויים מכתים התנאים נוגדן ומשך. תאים MCF10A הם דוגמה מצוינת לעניין זה כפי שהם כונו עם BrdU במשך ארבע שעות ו מוכתם ריכוז פעמיים רמת נוגדנים עבור ארבע פעמים, כל עוד. החוקריםצריך להיזהר שלא יעלה על 6 שעות של BrdU תיוג אפילו עם תאים לאט לאט גדל כמו זה יכול בטעות לגרום הכללת G2 / M בתאים באוכלוסייה S-שלב. שנית, להשוות את ההשפעות של ביטוי p27KIP1 עם אלה של TGF-β1, ברור כי p27 יכול לגרום הצטברות באחת G1 או G2 / M שלבים תוך TGF-β1 איתות משרה מעצר G1. אמצעים מסורתיים של גילוי התפשטות כגון התאגדות H-3 Thymidine והספירה הנצנץ לא מסוגלים להבחין בין האפשרויות הללו. בפרוטוקול החלופית שלנו אנחנו מדגימים את הזיהוי של האוכלוסייה משנה של תאים באוכלוסייה untransfected יותר. חשוב לקבוע באופן אמפירי את הכתב המתאים ביותר לאיתור תאים transfected. מניסיוננו כמה סוגי תאים או משטח להביע תא סמנים גרוע, או לא יכול כראוי תעבורת להם קרום הפלזמה, וכתוצאה מכך חוסר יכולת לזהות תאים transfected. Likewise, לא כל התאים לסבול את הטופס קרום כבול של ה-GFP. בחירת הכתב המתאימה ביותר צריך להיעשות על ידי הערכת יעילות transfection של הכתב, כמו גם את עוצמת יחסי הביטוי בהשוואה לקבוצת הביקורת untransfected. באופן אידיאלי, הביטוי Heterologous של מולקולות אלה יהיה נסבל היטב וזה מרמז כי סמנים יש מעט שום השפעה על חלוקת מחזור התא. מגבלה אחת של סוגים אלה של גישות cytometry הזרימה היא כי הם רק מסוגלים להקים שכיחותם היחסית של שלבי מחזור התא בהשוואה זה לזה. מסיבה זו היא רב משמעית אם הביטוי של p27 באיור 3 באמת גורם מעצר G1 ו - G2 / M, או אם הוא רק מאט את התקדמות דרך שלבים אלה ביחס שלב-S. אפשרויות אלה יכולים להיחקר יותר על ידי טיפול מדגם מקביל של תאים עם מעכב mitotic כגון nocodazole, או G1 / S מעכב כמו aphidicolin. מאז תרופות אלו ליצור Dominaמעצר NT ב-M-שלב מוקדם או S-שלב בהתאמה, תאים מתרבים לאט יצטברו בנקודת המושרה סמים מעצר. עבור תאים למשל נעצר G1 כי הביטוי PRB יישאר G1 למרות הטיפול nocodazole בעוד התאים לשלוט יצברו ב-M-שלב 13. יחדיו, גישות אלו ניסיוני להציע מתודולוגיה גמישה ניתן ליישם במגוון רחב של היונקים מחזור התא שאלות מחקר. הם יכולים בקלות לזהות שינויים התקדמות מחזור התא ולכמת הבדלים בהשוואה שולטת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> התפשטות תאים תיוג מגיב </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU נוגדנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר FITC נוגדנים מצומדות </td><td> וקטור Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים מסננים Cell </td><td> BD פלקון </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 נוגדנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> מחזור רב תוכנה </td><td> הפניקס תזרים מערכות </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

הסדרת התפשטות תאים מרכזי המורפוגנזה רקמות במהלך הפיתוח של אורגניזמים תאיים. יתר על כן, אובדן שליטה של ​​התפשטות תאים בבסיס הפתולוגיה של מחלות כמו סרטן. ככזה יש צורך גדול להיות מסוגל לחקור התפשטות תאים ו לכמת את חלקם של התאים בכל שלב של מחזור התא. הוא גם בעל חשיבות שאין להבדיל בין השתיים כדי לזהות תאים שיש שכפול ה-DNA שלהם בתוך אוכלוסייה גדולה יותר. מאז ההחלטה של ​​התא כדי להתרבות הוא עשוי בשלב G1 מיד לפני ביצוע סינתזה של DNA ועל התקדמותם דרך שאר מחזור התא, גילוי של סינתזה של DNA בשלב זה מאפשר קביעה חד משמעית מעמדה של תקנה גידול תרבית תאים ניסויים. תוכן ה-DNA בתאים ניתן ונרשמת בקלות על ידי cytometry זרימה של תאים מוכתם יודיד propidium, צבע DNA ניאון intercalating.כמו כן, סינתזת דנ&quot;א פעיל ניתן ונרשמת ידי תאים culturing בנוכחות thymidine רדיואקטיבי, קצירת התאים, ומדידת שילוב של רדיואקטיביות לתוך חלק מסיס חומצה. יש לנו ניסיון רב עם ניתוח מחזור התא ממליצים על גישה שונה. אנו לחקור התפשטות תאים באמצעות bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (מקוצר פשוט BrdU) מכתים המאתר שילוב של אלה אנלוגים תימין לתוך DNA מסונתז לאחרונה. סימון מכתים תאים עם BrdU, בשילוב עם מסך ה-DNA על ידי מכתים יודיד ניתוח propidium ועל ידי זרימת cytometry 1 מציעה את מדד מדויק ביותר של תאים בשלבים שונים של מחזור התא. זוהי השיטה המועדפת שלנו משום שהוא משלב גילוי ה-DNA סינתזה פעילה, באמצעות צביעה בנוגדנים מבוסס על BrdU, עם תוכן ה-DNA הכולל יודיד propidium. זה מאפשר הפרדה ברורה של תאים משלב G1 S מוקדם או מאוחר מן השלב G2 / M.יתר על כן, גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לחקור את ההשפעות של גירויים רבים תאים שונים וסוכני תרופתי על רגולציה של התקדמות דרך שלבים אלה שונים מחזור התא. בדו&quot;ח זה אנו מתארים שיטות תיוג מכתים תאים בתרבית, כמו גם ניתוח שלהם על ידי cytometry הזרימה. אנו כוללים גם דוגמאות ניסיוני של כמה בשיטה זו ניתן להשתמש כדי למדוד את ההשפעות של אותות הצמיחה עיכוב של ציטוקינים כגון TGF-β1, ומעכבי שגשוג כגון מעכבי קינאז תלוי cyclin, p27KIP1. אנו כוללים גם את פרוטוקול חלופי המאפשר ניתוח של העמדה מחזור התא באוכלוסייה משנה של תאים בתוך תרבות גדולה יותר 5. במקרה זה, אנו מדגימים כיצד לזהות מעצר מחזור התא בתאי transfected עם הגן רטינובלסטומה גם כאשר במידה רבה במספרם של התאים untransfected באותה תרבות. דוגמאות אלה ממחישות את דרכים רבות מכתים דנ&quot;אcytometry זרימה יכול להיות מנוצל והותאמו כדי לחקור שאלות בסיסיות של שליטה היונקים מחזור התא.

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

בקרה על השגחה תאית היא מרכיב מרכזי במורפוגנזה של רקמות במהלך התפתחותם של אורגניזמים רב-תאוויים. יתרה מכך, אובדן השליטה על...

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר קביעה של פרופורציית התאים בשלבים השונים של מחזור התא. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת ריאגנט לסמן פרוליפרציית תאים, BRDU, לתרבית תאים חיונית לצורך שילובו ב-DNA שסונטז לאחרונה; לאחר מכן צובעים את ה-BRDU בתאים ששילבו את הריאגנטים, ואז צובעים את ה-DNA באמצעות propidium iodide. השלב הסופי הוא הערכת פרופורציית התאים בשלבים השונים של מחזור התא באמצעות ציטומטריית זרימה.בסופו של דבר, ניתן להדמיות את התפלגות מחזור התא של אוכלוסיית תאים ניסיונית באמצעות אנליזה של ציטומטריה עם זרימה של תאים המסומנים ב-BRDU. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שילוב של tri-thymidine וספירת סינטילציה, הוא שבאמצעות סימון BRD ניתן לקבוע את פרופורציית התאים בכל שלב של מחזור התא. הדגמה חזותית של מסר זה היא קריטית, שכן קשה להסביר את הגדרות האנליזה הציטומטרית הנלוות ללא תמונות המלוות של הפרמטרים השונים שיש להתאים.את הפרוצדורה ידגימו שני סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי, מאט צ'י ואני, מירי. הוסיפו BRDU בדילול של 1:1000 לתרביות התאים הניסיוניות, הדגירו למשך שעה אחת, ולצורך קציר התאים, שאבו את מצע התרבית ולאחר מכן שטפו את התאים היטב עם PBS פעמיים כדי להסיר את כל שאריות המצע. הפעם, בעזרת PBS בתוספת 3 millimolar EDTA, שטפו את התרביות במהירות פעם נוספת, ולאחר מכן שאבו את תמיסת ה-P-B-S-E-D-T-A ביסודיות כדי לנתק את התאים.הוסיפו כ-0.5 milliliters של P-B-S-E-D-T-A לכל צלח תרבית בן שישה סנטימטרים והד기로 את הצלחים בטמפרטורה של 22 degrees Celsius למשך כחמש דקות. לאחר מכן, העבירו את תרביות התאים מכל צלחת למבחנות קוניות נפרדות של 15 milliliters. כעת, סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את העילאי (supernatant), ולאחר מכן השעיקו מחדש את התאים ב-100 µL של PBS.לבסוף, קבעו את התאים על ידי הוספה טיפה-טיפה של חמישה מיליליטר של 95% ethanol תוך כדי ערבול ב-vortex, ולאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 times gravity למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוב, הסירו את ה-ethanol והשביו את המשקע במיליליטר אחד של two normal HCL המכיל 0.5% Triton X 100, על ידי הוספת התמיסה לתאים באופן טיפוני תוך ערבול ב-vortex, ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר שקיעת התאים שוב, שאבו את ה-S supernatant, תוך הקפדה מיוחדת, שכן התאים יוצרים שלב זה משקע רופף מאוד.לאחר מכן, השביעה בעדינות את המשקע ב-1 milliliter של sodium tetraborate בריכוז 0.1 molar והדגר את התאים שוב. כעת, השקע את התאים פעם נוספת והדגר אותם הפעם ב-0.5 milliliters של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדני mouse anti BRDU המדוללים ביחס של 1:50. לאחר השקעת התאים פעם נוספת, השביה את המשקע ב-50 µL של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים משניים של rabbit anti-US ZI המשורשרים, המדוללים ביחס של 1:25.לאחר מכן, דגרו את התאים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגציה סופית של התאים, דגרו אותם ב-0.5 milliliters של תמיסת propidium iodide ו-RNA בחושך ב-37 °C למשך 30 דקות. לבסוף, העבירו את תמיסת התאים שעברו עיכול דרך מסנן תאים כדי להסיר אגרגטים.לאחר מכן, העבירו את התאים הבודדים למבחנה מתאימה לצורך ספיגת הדגימה בציטומטר זרימה עבור אוכלוסיות תאים בעלות התרבות אסינכרונית, כגון זו המוצגת. בדוגמה זו, הגדירו שער (gate) סביב שני הפסגות השכיחות ביותר בגרף להפרדת דובלטים (doublet discriminating plot) כדי לבחור אירועים של תאים בודדים עבור כל הניתוחים הבאים. לאחר מכן, נתחו דגימה של תרבית בהתרבות אסינכרונית שתשמש כביקורת חיובית לצביעה ולהגדרת הפרמטרים של ציטומטר הזרימה.כווננו את רגישות צינור המכפיל הפוטו-אלקטרי עבור צביעה ב-propidium iodide כך שהשיאים של 2N ו-4N מהתאים הבודדים יהיו ממורכזים ביחידות שרירותיות של 200 ו-400 על ציר ה-x. לאחר מכן, כווננו את רגישות צינור המכפיל הפוטו-אלקטרי הגילוי של FXI כך שתאים שליליים ל-FXI יהיו מעל לרמות הרקע. תאים חיוביים ל-BRDU אמורים להיות בהירים פי 10 בקירוב, וציר ה-x יוצג בסקאלה לוגריתמית.האירועים הבודדים הנלכדים על ידי ציטומטר הזרימה יוצרים קשת בצורת פרסה, החל משלב G1 בפינה השמאלית התחתונה, עולה אל שלב S ואז יורדת חזרה לפינה הימנית התחתונה עבור שלב G2/M. כפי שניתן לראות בדמות מייצגת זו, יש לאסוף 5,000 עד 10,000 אירועי תאים בודדים כדי להגיע לטווח הרצוי של תכולת ה-DNA. לאחר מדידת תכולת propidium iodide ו-BRDU, שייכו את התאים לשלבי G1, S או G2/M באמצעות שערים (gates) סביב שתי האוכלוסיות השליליות ל-BRDU, הממוקמות סביב 200 עבור G1 ו-400 עבור G2/M. כללו את כל האירועים שמעל שני הריבועים הללו בשער יחיד למדידת שלב S; אחוז התאים בכל שער ייצג את מספר התאים היחסי בשלבי G1, S ו-G2/M, כפי שמוצג כאן בגרף העמודות עבור דמות תרשים הפיזור הקודמת.לאחר צביעה לסמן תאי רצוי, בדוגמה זו CD 20, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך 10 דקות ב-22 °C, ולאחר מכן השהו שוב את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS מועשר ב-1%BSA. לאחר הצמדת התאים שוב לצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השתמשו ב-0.5 מיליליטר של תמיסת propidium iodide ו-RNA כדי להחזיר את התאים למצב הידרטציה. לאחר מכן צבעו ועכלו את התאים כפי שהודגם כעת, בצעו gating לשיאי התאים הבודדים של 2n ו-4n, ואז כווננו את הרגישות של שפופרת מכפיל הפוטונים (PMT) לזיהוי FXI כך שהתאים שאינם צבועים יהיו מעל רמות הרקע.באופן אידיאלי, התאים החיוביים ל-CD 20 FXI יהיו צבועים בעוצמה הגבוהה פי 10 עד 100 מהרקע. שוב, יש להציג את ציר ה-x כסולם לוגריתמי. לבסוף, בחרו את התאים החיוביים ל-CD 20 שהם בהירים פי 10 מרמות הרקע ועם צביעת propidium iodide שבין 200 ל-400 להצגה בהיסטוגרמה של propidium iodide מול ספירת תאים כפי שמוצג כאן בדוגמה זו; אספו לפחות 1000 אירועים חיוביים ל-CD 20 עבור כל דגימה כדי להגביל את השונות באיור זה.מוצג ניתוח פלוו-ציטומטרי תלת-ממדי של תאים שצבעו ב-propidium iodide ו-BRDU. שימו לב כי התאים בעלי תוכן DNA של 2n ו-4n מרוכזים מעל הסימונים 200 ו-400 בסולם ציר ה-X. עבור עוצמת הצביעה ב-propidium iodide, עוצמת הצביעה ב-BRDU נמדדת בסולם לוגריתמי.בציר Y, שימו לב למיקומי השערים המשמשים לכימות תאים בשלבי G1 ובשלבי G2/M של מחזור התא. הפרופורציה היחסית של תאים בכל אחד מהשערים של G1 ו-G2/M מהאיור הקודם מוצגת כאן. כאן, propidium, iodide ו-CD 20.מוצגת צביעה של תערובת תאים, שחלקם ביטאו באופן אקטופי CD 20 ו-PRB. שימו לב כי התאים עם שתי n וארבע NDNA, האוכלוסיות השכיחות ביותר, מרוכזים מעל הסימנים 200 ו-400 בציר ה-x. מיקום ה-gate של התאים החיוביים ל-CD 20 בוחר תאים הצבוים בעוצמה הגבוהה לפחות פי 10 מהרקע.היסטוגרמה זו מייצגת את ספירת התאים לעומת צביעה ב-propidium iodide עבור תאים שליליים ל-CD 20 מתוך תרשים הפיזור הקודם, אשר מתחלקים באופן אסינכרוני; בהיסטוגרמה זו מוצגים תאים חיוביים ל-CD 20 מתוך תרשים הפיזור של CD 20 המוקדם יותר, אשר הונחו לעצור את מחזור השכפול באמצעות ביטוי של p rrb ומכילים תאים עם תכולת 2N DNA בעיקר. נתונים אלו מדגימים כי ניתן להבחין בין תת-אוכלוסייה שעצרה לבין תאים אחרים בתרבית באמצעות טכניקת צביעה זו. בשלוש הדמויות הבאות, מוצגים נתונים מניתוח של ציטומטריה של זרימה של ביטוי רטרו-ויראלי של מעכב הקינאז התלוי-ציקלין P 27 KIP one בפיברובלסטים עובריים של עכבר.ניתוח Propidium iodide ו-BRDU שימש למדידת שלבי מחזור התא באוכלוסיית תאים בעלת התרבות א-סינכרונית, שהועברו אליהם באמצעות טרנסדוקציה וקטור רטרו-ויראלי ריק של P babe כפי שמוצג כאן. אירועים מעטים חיוביים ל-BRDU נצפו בשער של שלב S בתגובה ל-P 27. שימו לב גם לעוצמה הגבוהה יותר של אירועים בשערים של G1 ו-G2 M.באופן דומה, אחוז התאים בשלב S עבור תאים המבטאים P 27 נמוך למדי, כפי שמוצג בתרשים בדמות זו. סוג זה של ניתוח התגלה כיעיל מאוד באפיון ליקויים בבקרת מחזור התא בתאים שהופקו מזנים שונים של עכברים עם שבירה גנטית ממוקדת (gene targeted mice). בשתי הדמויות הבאות, תאי אפיתל של בלוטת הזיכרון שאינם מעוצבים טופלו בציטוקין מעכב גדילה, TGF beta one, למשך 24 שעות.כפי שניתן לראות באיור ראשון זה, סימון BRDU בתאי שלב S פוחת באופן משמעותי עקב סיגנל של TGF beta one. שימו לב להצטברות התאים בעיקר בשלב G one של מחזור התא, כפי שניתן לראות בפאנל האמצעי. כימות השלבים השונים של מחזור התא מאשר כי TGF beta one מעכב בעיקר את השגשוג בשלב G one של מחזור התא, מה שמוביל להצטברות בשלב זה.בסדרה אחרונה זו של ניתוחים ניסיוניים, תאי SAS two חסרי PRB עברו טרנספקציה עם וקטור ביטוי של CMV CD 20 וכן עם CMV RB או CMV beta GAL כביקורת. איור ראשון זה מדגים את התפלגות מחזור התא של התאים שעברו טרנספקציה של ביקורת שלילית בהשוואה להתפלגותם לאחר 72 שעות של ביטוי PRB. שימו לב לנוכחות כמעט בלעדית של פסגת 2N בפאנל הימני באיור סופי זה; התאמת עקומות באמצעות תוכנת multi-cycle גילתה כי התאים הצטברו בעיקר בשלב G1 בעקבות ביטוי PRB.בעוד שהאוכלוסיות בשלבי s ו-G2/M היו דלולות יחסית. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להתאים טכניקה זו למחקר של סמנים אחרים של מחזור התא, כגון היסטונים מפוספורים ב-mph. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו קובעים את התפלגות מחזור התא של אוכלוסיית תאים.אל תשכחו שחומצה כלורית רגילה היא חומר קורוזיבי ופרופידיום יודיד הוא קרצינוגן פוטנציאלי. הם עלולים להיות מסוכנים בשימוש.יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת שימוש בחומרים כימיים אלה.

analysis-of-cell-cycle-position-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

miRNA או microRNA הם מווסתי מפתח של התקדמות מחזור התא. סרטון זה מתאר ניתוח מחזור תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי סרטן ריאות הנגועים ב-miRNA, כדי לחקור את ההשפעה של miRNA על ויסות מחזור התא. עיכוב התרבות על ידי עצירת התקדמות מחזור התא הראה פוטנציאל להיות גישה מבטיחה לטיפול בסרטן.

ניתוח מחזור התא: גישה לחקר ויסות מחזור התא של תאי סרטן ריאה נגועים ב- miRNA

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

אנו מדווחים על שני פרוטוקולים של סינכרון תאים המספקים הקשר ללימוד אירועים הקשורים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. אנו מראים כי גישה זו שימושית לניתוח הרגולציה של גנים ספציפיים במחזור תאים לא מופרע או בחשיפה לסוכנים המשפיעים על מחזור התא.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

שיטה מבוססת הדמיה מתואר כי ניתן להשתמש כדי לזהות שלב S ולנתח מחזור התא דינמיקה ב germline אנדרוגינוס C. elegans באמצעות של תימידין אדו אנלוגי. שיטה זו דורשת לא transgenes והוא תואם עם immunofluorescent מכתים.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

למדו לנתח את מיקום מחזור התא בתאי יונקים באמצעות ציטומטריית זרימה וסימון BRDU. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מדויק של תאים בשלבי G1, S ו-G2/M לחקר פרוליפרציה תאית.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים