Name: Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: למד שיטת אימונוסטיינינג מהירה ללב עוברי דג הזברה (Danio rerio) לקבלת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים ותת-תאיים. השיטה מקצרת זמני עיבוד ומשפרת חדירות נוגדנים לעומת שיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Beninio Jomok על עזרתו בעלי דג הזברה. עבודה זו ממומנת על ידי NIH HL81753.

1. הכנת שקופיות קאמרית humidified <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר humidified ניתן מתיבת כגון תיבת קצה התרוקן. לעטוף גם את החדר ואת לכסות ברדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך החדר, לשים ערימה של מגבות נייר רטוב כדי לשמור על לחות בתוך החדר, אשר ימנע את דגימות לב מהתייבשות. הגדר microplate קטן בחלק העליון של מגבת נייר כמו מתלה עבור השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר או קווים או עיגולים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית באמצעות עט immEdge לעשות בארות דגימות לב ממד על 5x5 מ"מ. בואו שקופיות יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות בחדר humidified ולהוסיף 50ul פורמלדהיד 4% טרי היטב כל אחד. </li></ol> 2. Dissection הלב העוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העובר דג במים ביצה E3 7 המכיל tricaine 0.4% למשך 1 דקה בערך עד התנועה לעצור דגים הגוף אבל עדיין יש לי לב תקיןמכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות מיקרוסקופ קעור על הבמה של מיקרוסקופ לנתיחה. העברת עוברים לבאר concaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאימו את צירוף האור של המיקרוסקופ לנתח כדי לגלות בבירור את הלב. בהתאם העדפה אישית, זה יכול להיות גם שדה כהה או DIC כמו תנאי אור מקוטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו שני מזרקים אינסולין עם אתנול 75%, אז יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המיקרוסקופ לנתיחה כדי הגדלה גבוהה להתמקד בלב. פיזית לתקן את העובר על ידי הוספת טיפ מחט לתוך גבול חלמון-somite קרוב הראש. הכנס עוד קרוב מחט לאזור הלב ולמשוך את הלב מהר. אם הלב אינו מופרד לחלוטין מן העובר, לנתק את רקמות מחובר הנותרים בין הלב לבין החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המיקרוסקופ כדי הגדלה נמוך ולהתמקד בלב מופרדים. השתמש pipetteman 10μl ולהגדיר אותו נפח 1μl. החל קצה pipetteman כדי או לצייר או לגעתלב המדגם, כך יהיה מבודד בלב או בתוך או לעיקול על פני השטח של קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את קצה פיפטה בתמיסת פורמלדהיד 4% בשקופיות מוכן לדכא את הבוכנה פיפטה לשחרר את הלב לתוך התמיסה. המתח של פני המים גם עוזר לשחרר את הלב מקצה פיפטה לפתרון. שים פחות מ 3 לבבות היטב כל אחד. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החדר והניח אותו על שייקר עם תנועת נדנדה עדין. תקן המדגם הלב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את המים על גבו של השקופיות ולשים את השקופיות על הבמה של מיקרוסקופ לנתיחה עבור חיץ מחליפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את קצה מן pipetteman 10μl לאזור ריק כל טוב ולשמור על קצה רחוק ככל האפשר מן דגימות לב. קח מזהיר, כדי למנוע את הצמדת לב אל קצה, שכן ליבם עשוי לנוע עם זרימת מים כאשר הפתרון הוא נשאב לתוך קצה. לשנותלוקליזציה קצה, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הפתרון על גבי רקמה ולהימנע ייצור כל בועות קצה מאז מדגם הלב הולך לאיבוד בקלות בנוכחות של בועות אוויר. שמירה על דגימות הלב יבש חלקית לזמן קצר יכול לעזור לבבות להישאר מחובר השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl PBST כדי לכסות את המדגם לב לדגור בחדר humidified בתנועת נדנדה איטי 5 דקות. חזור על לשטוף עוד פעם אחת. לאחר שלב זה, דגימות הלב ניתן לאחסן בתא humidified עד 1 שבוע 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק מדגם לב עם סרום כבשים 10% PBST שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם לב עם נוגדנים ראשוניים, כגון דילול 1:200 של נוגדן β-catenin ו 1:200 דילול mef2 נוגדן ספציפי, כבשה 10% סרום / PBST שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם הלב שלוש פעמים PBST (5 דק '. כל אחד) בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם עם המשנינוגדנים, כגון דילול של 1:1000 עכבר אנטי Alexa-tagged ו / או נגד ארנב נוגדנים, ב PBST שעה 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הלב עם דגימות שלוש פעמים PBST (5 דק '. כל אחד) בטמפרטורת החדר. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBST ולהוסיף 10 בינוני הרכבה μl היטב כל אחד. הסלע קאמרית במשך מספר דקות עד לפתרון מתבהרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של המדיום גובר לכסות את כל בארות שקופית אחת עם זכוכית מיקרוסקופ לכסות (24x50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים תמונה לב באמצעות Zeiss Axioplan 2 מיקרוסקופ המצויד ApoTome (Carl Zeiss). </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה של תמונה אשר חושף קרום גרעינים של כל cardiomyocytes דג הזברה הוא באיור. 1. נוגדנים mef2c ו β-catenin שימשו יחד כתם דגימות לב גזור מעובר hpf 52 דג הזברה. בעוד נוגדן כתמים mef2c את הגרעינים של cardiomyocytes, β-cateninנוגדן חושף את הגבול של כל תא 80-10. על ידי התאמת בשלב של המיקרוסקופ המתחם, תמונות של דגימות לב יכול להיות מותאם לכיוון זהה, אשר יאפשר את התצפית של עקמומיות החיצונית עקמומיות פנימית בלב 11. המספר הכולל cardiomyocyte, גודל התא cardiomyocyte, ואת המעגליות לאחר מכן ניתן למדוד. דוגמה נוספת אשר חושף את המבנה sarcomeric לב עוברי מוצג באיור. 2. ביצענו immunostaining באמצעות F59, נוגדן שרירן, בלב העוברית גזור. הרשת myofibril בלב שלם עובריים יכולים להתגלות בבירור בהגדלה נמוכה, בעוד הלהקה מפוספס של נימה עבה יכול להתגלות בהגדלה גבוהה יותר (איור 2) 6. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> באיור 1. Immunostaining של mef2 (אדום) ו β-catenin (ירוק) כדי להראות את הגרעינים ואת outlאינס של cardiomyocytes בתוך החדר דג הזברה. בר סולם = 10μm <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> באיור 2. Immnostaining של שרירן להראות את חוט עבה החדר דג הזברה בהגדלה או נמוך (A) או הגדלה גבוה (B). בבר בקנה מידה = 10μm

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
<li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cardiac+development%3A+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li>
<li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart%3A+A+functional+study+of+tnnt2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , (2007).</li>
<li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle%3A+the+regulation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li>
<li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo%22%5BJournal%5D)">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li>
<li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li>
<li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לעומת שיטות קלאסיות immunostaining כל הר, בשיטה שלנו יש את היתרונות הבאים. ראשית, אותות ניאון חזק הרבה יותר ניתן להשיג באופן עקבי בשל חדירה משופרת. ב שיטת הר שלם immunostaining, רקמת העור צפוף המקיף את הלב משמעותית את החדירה של נוגדנים רבים, וכתוצאה מכך רקע גבוה בכל הגוף. בעיה זו חמורה במיוחד עבור עוברי מבוגר יום 3 לאחר ההפריה (DPF). לעומת זאת, רק לבבות גזור מורכבת שכבות תאים ספורים, עיבוד חדירה הרבה יותר טוב. שנית, בגלל החדירה משופרים בהרבה, כל התהליך של immunostaining ניתן להפחי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> tricaine </td><td> מחקר אורגניים </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> מזרק אינסולין </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenin נוגדן </td><td> סיגמא </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anti-Mef2c נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinin נוגדן </td><td> סיגמא </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> אנטי ודומיו נוגדן </td><td> תא האיתות </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד נגד 488 עיזים עכבר IgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> הרכבה בינונית עבור הקרינה </td><td> וקטור </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge עט </td><td> וקטור </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> פולי-L-מסן שקופיות מצופה </td><td> במיקרוסקופ אלקטרונים מדעי </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ </td><td> דיג </td><td> 12-543-D </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות Concaved </td><td> דיג </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td> לייקה MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> מתחם מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0.5% טריטון X-100 &quot;ent&gt; 25X Tricaine: 400 מ&quot;ג Tricaine 97.9 מ&quot;ל DDH 2 O 2.1 מ&quot;ל (1M טריס pH9) התאם את ה-pH 7.0

immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

עובר דג הזברה הופך פופולרי מודל חוליות vivo לחקר התפתחות לב ומחלות לב אדם עקב אמבריולוגיה יתרון שלה בגנטיקה 1,2. אודות 100-200 עוברי זמינים בכל שבוע מזוג אחד של דגים בוגרים. עוברי שקוף המתפתחים ברחם לשעבר להפוך אותם אידיאליים להערכת פגמים לב 3. הביטוי של הגן כל ניתן להשפיע באמצעות morpholino טכנולוגיית הזרקה או RNA 4. יתר על כן, קדימה מסכי גנטית יצרו כבר רשימה של מוטציות שעלולות להשפיע על היבטים שונים של cardiogenesis 5. הר שלם immunostaining היא טכניקה חשובה במודל זה חיה כדי לחשוף את דפוס הביטוי של החלבון ברקמות ממוקדות מסוים 6. עם זאת, תמונות ברזולוציה גבוהה שיכולים לחשוף מבנים הסלולר או subcellular היה קשה, בעיקר בשל locat הפיזייון של הלב חדירה לקויה של הנוגדנים. כאן, אנו מציגים שיטה כתובת אלה צווארי בקבוק ידי ביתור הלב הראשון ולאחר מכן לנהל את התהליך מכתים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית. כדי למנוע אובדן של דגימות לב קטן כדי להקל על הטיפול פתרון, אנחנו מוגבלים דגימות לב בתוך עיגול על פני השטח של המיקרוסקופ מגלשות רתומות עט immEdge. לאחר מכתים, אותות הקרינה ניתן לצפות ישירות על ידי מיקרוסקופ המתחם. השיטה החדשה שלנו משפר באופן משמעותי את החדירה של נוגדנים, שכן לב מהדגים עובריים רק מורכב משכבות תאים בודדים. תמונות באיכות גבוהה של לבבות שלמים ניתן להשיג תוך זמן התהלוכה הרבה מופחת עבור עוברי דג הזברה בן 2 מיום ליום 6. בשיטה שלנו ניתן להאריך פוטנציאל כתם איברים אחרים גזור מן דג הזברה או חיות קטנות אחרות.

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

עוברי דג הזברה הופכים למודל חולייתים פופולרי למחקר in vivo של התפתחות הלב ומחלות לב אנושיות, וזאת בשל האמבריולוגיה היתרונית שלהם...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית על לבבות עובריים מבודדים של דגי זבראפיש (zebrafish) כדי לחשוף מבנים תאיים או תת-תאיים ברזולוציה גבוהה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת שקופיות בתא לחות לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית. לאחר מכן, הלב מבודד מעובר זבראפיש שהורדם, ולאחר מכן מבוצעת צביעה אימונוהיסטוכימית של הלב העוברי באמצעות נוגדן ספציפי.לאחר מכן, תמונות של לבבי דגים מתועדות באמצעות מיקרוסקופ המצויד ב-aome. לבסוף, מבנים תאיים או תת-תאיים בלב עוברי של דג זברה נחשפים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה, הודות לחדירות מוגברת משמעותית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימות מקובעות (home mount), הוא היכולת להשיג תמונות באיכות גבוהה של לב דג זברה סטנדרטי. כדי להכין תא לחות ולהגן על הדגימות מאור, השתמשו בנייר אלומיניום לעטיפת התא ומכסה של קופסת טיפים ריקה.מנעו מהדגימות להתייבש על ידי הנחת ערימה של מגבות נייר רטובות בתחתית התא, והניחו מעליהן מיקרופלט (microplate) קטן שישמש כמעמד לשקיות. בעזרת עט לסימון תבניות, שרטטו עיגולים או קווים במימדים של כ-5 על 5 מילימטרים על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור בארות. הניחו לשקופיות להתייבש.הניחו את השקופיות בתא הלחות והוסיפו 50 µL של פורמאלדהיד לכל באר. כדי לבצע דיסקציה של הלב העוברי, הרדימו את עובר הדג במי ביצים E3 המכילים 0.4% trica עד שעובר הדג מפסיק כל תנועת גוף, אך עדיין שומר על פעימות לב תקינות. תהליך זה נמשך כדקה אחת.העבירו את העוברים למסבית (concave). הניחו זכוכית מיקרוסקופ בעלת שקע על משבתו של מיקרוסקופ דיסקציה, תוך שימוש בשדה כהה או באור מקוטב מסוג DIC. כווננו את תאורת המיקרוסקופ כדי להבחין בלב בבירור.בשלב הבא, נקו שני מזרקי אינסולין בעזרת 75% ethanol. לאחר מכן ייבשו אותם, הגדילו את ההגדלה של המיקרוסקופ כדי להתמקד בלב. לאחר מכן, קבעו פיזית עובר על ידי החדרת קצה מחט אחת אל תוך החלמון, כך שגבול הטרימיה יהיה קרוב לראש.לאחר מכן, הכניסו מחט נוספת קרוב לאזור הלב, ושלפו במהירות את הלב. אם הלב אינו מופרד לחלוטין מהעובר, גזרו את רקמת החיבור שנותרה בין הלב לחלמון. התמקדו בלב בהגדלה נמוכה יותר.באמצעות פיפט עם טווח של 10 µL המכוון לנפח של 1 µL, השתמשו בחוד הפיפט כדי לשאוב או לגעת בדגימת הלב, כך שהלב המבודד יהיה בתוך חוד הפיפט או צמוד לפניו. טבלו את חוד הפיפט לתוך תמיסת הפורמלהיד על גבי שקופיות מוכנות, ולחצו על בוכנת הפיפט כדי לשחרר את הלב אל תוך התמיסה.כאשר הלבבות נמצאים בפורמלהיד על שקופיות השקע, סגרו את התא והניחו אותו על מערער (shaker) בטלטול עדין למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, נגבו את המים מגב השקופיות והניחו את השקופיות על במה של מיקרוסקופ דיסקציה לצורך החלפת בופר. השתמשו בפיפטמן של 10 µL כדי לשאוב בזהירות את הפורמלהיד מהשקופית, תוך הקפדה שלא להזיז את הלבבות. הוסיפו 50 µL של PBST לכיסוי דגימות הלב והדגירו בתא לח המוסיף למשך חמש דקות.שטפו את הלבבות פעם שנייה ב-PBST. לאחר מכן, חסמו את דגימת הלב באמצעות סרום כבשים 10% ב-PBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגרימו את דגימות הלב עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים ל-beta catenin ו-F בריכוז של 1:200 ב-PBST עם סרום כבשים 10% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.יש לשטוף את דגימות הלב עם PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל פעם בטמפרטורת החדר. יש להדגיר את הדגימות עם דילול של 1:1000 של נוגדנים משניים עם תג Alexa, אנטי-עכבר (anti mouse) ו/או אנטי-ארנב (anti rabbit) ב-PBST למשך 30 דקות. יש לשטוף שוב את הדגימות שלוש פעמים עם PBST לצורך הדמיה של הדגימות.הסיר את ה-PBST והוסף מיקרוליטר אחד של מדיום קיבוע (mounting medium) לכל תא. נער את התא במשך מספר דקות עד שהתמיסה תהפוך לצלולה. דגם את לב הדג באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio Plan 2 המצויד ב-aome. בתמונה זו, הגרעינים וממברנות התאים של קרדיומיוציטים של דג זברה מעובר דג זברה 52 שעות לאחר ההפריה מזוהים באמצעות נוגדנים נגד MEF2C ובטא-actin, בהתאמה.על ידי כיוונון השולחן של המיקרוסקופ המרכב, ניתן להביא את התמונות של דגימות הלב לאותו כיוון, דבר המאפשר התבוננות בקימור החיצוני ובקימור הפנימי של הלב. לאחר מכן ניתן למדוד את מספר הקרדיומיוציטים הכולל, את גודל תאי הקרדיומיוציטים ואת העגוליות שלהם. כאן מוצג המבנה הסרקומרי של לב עוברי מובדל באמצעות הנוגדן myosin F 59. רשת ה-Myofibril בחדר של לב עוברי שלם נראית בבירור בהגדלה נמוכה, בעוד שפסים משוררי של פילמנטים עבים נראים בהגדלה גבוהה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית של לב דג זברה מנוסח, ובמיוחד כיצד לבצע ניתוח להוצאת הלב מדג זברה, וכיצד לטפל בלב במהלך תהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית.

immunostaining-of-dissected-zebrafish-embryonic-heart

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

סרטון זה מתאר טכניקה של בידוד הלב מדגי זברה בשלבים התפתחותיים מרובים כדי לחקור התפתחות לבבית, התבגרות והזדקנות.

דיסקציה של הלב: שיטה להתבוננות בהתפתחות הלב של דגי זברה

כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

השימוש בדגי זברה למחקר קרדיווסקולרי מתרחב למחקר על לבבות בוגרים. עבור יישומים אלה, בידוד מהיר ופשוט של רקמות לב הוא המפתח למניעת שינויים לאחר המוות ולהשגת מספר מספיק של דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה וניתנת לשחזור לניתוח לבבות דגי זברה בוגרים.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.

שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

מחקר זה קובע שיטת הדמיה רגישה מבוססת אימונופלואורסצנציה לכימות מתילציה גלובלית של DNA בלבבות עובריים בודדים של דגי זברה. גישה זו מתגברת על האתגר של מגבלות חומר רקמה ועוקפת את הצורך בהמרת ביסולפיט.

זיהוי מתילציה גלובלית של DNA בלבבות זחלי דגי זברה

למד שיטת אימונוסטיינינג מהירה ללב עוברי דג הזברה (Danio rerio) לקבלת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים ותת-תאיים. השיטה מקצרת זמני עיבוד ומשפרת חדירות נוגדנים לעומת שיטות מסורתיות.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים