איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated
16 בדצמבר 2011
שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.
המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר את התגובה התאית להיפוקסיה באגריגטים של תאים המעטופים ב-PEG. בשלב הראשון, תאים מפוזרים מודבקים בנגיף הסימון ולאחר מכן תורגבשו על שייקר כדי לאפשר היווצרות של אגריגטים. לאחר מכן, PEG לינארי עובר פונקציונליזציה וה-PEG DM rimer עובר טהרה.
לאחר מכן, מקפסלים את מקבצי התאים בתוך הידרוג'ל PEG DM. לבסוף, מתרבלים את ההידרוג'לים בתנאי חמצן שונים תוך ניטור פלואורסצנטי של אות סמן ההיפוקסיה. בסופו של דבר, ניתן להדמיאן את המיקום וההיקף של פעילות ה-hypoxia inducible factor בתוך מקבצי תאים חיים מקופסלים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פשוטה.
שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי הכליאה התאית והמסירה של טיפולים מבוססי תאים, כגון היכן מתרחשת היפוקסיה בתוך תרביות תלת-ממדיות, וכיצד היא משפיעה על הישרדות התאים ותפקודם? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על גישות של רפואה רגנרטיבית וטיפול בחסרים הורמונליים, כגון סוכרת, בשל ההשפעה המשמעותית של היפוקסיה ברקמות מצוברות וכלואות. הוכח כי פעילות של hypoxia inducible factor one נמצאת במתאם עם ירידה משמעותית בהפרשת אינסולין מתאי בטא, דבר שהניע ניסיונות להפריד איים של לבלב ראשוניים ולהרכיבם מחדש לאיים פסאודו-לבלב.
צברים בעלי קוטר מופחת. המרקר שלנו יכול להעיד על פעילות של hypoxia inducible factor עם צברים ברמה התאית בתוך כל חומר עטיפה שהתרחב. PEG נבחר כחומר לקפסולה בשל תכונות ההעברה המועדפות שלו, התאימות התאית שלו והקלות שבה ניתן לבצע בו שינויים פונקציונליים.
לאחר שוקל שני גרמים של PEG במבחנה מזכוכית בנפח 40 מיליליטר עם כ-308 מיקרוליטר של meth, acrylic, anhydride, סגור את המבחנה בצורה רפויה באמצעות פקק פלסטיק קשיח. חמם את המבחנה במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך שתי דקות במיקרוגל ביתי סטנדרטי. לאחר מכן, בעזרת כפפות עמידות לחום, ערבב את המבחנה היטב ב-vortex וחמם את התמיסה במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות נוספות.
המתינו זמן קצר עד שהמבחנה תתקרר מספיק כדי שניתן יהיה לטפל בה, ולאחר מכן הסירו את הפקק תוך כדי סיבוב של המבחנה. ערבבו באיטיות פנימה methylene chloride, תוך ביצוע vortex לדגימה במידת הצורך, עד שהתמיסה נראית צלולה והומוגנית. לאחר מכן, הוסיפו את התמיסה בטיפות ל-200 milliliters של dathyl ether קר תחת ערבוב כדי להשקיע את ה-PEG dm.
לאחר מכן, אספו את ה-PEG DM באמצעות סינון בוואקום והניחו לו להתייבש. לאחר שה-PEG DM התייבש, המיסו אותו בכ-100 עד 150 מיליליטר של מים דה-יוניים. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לתמיסה כנגד מים דה-יוניים למשך חמישה ימים בצינור דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (MWCO) של 1000 Daltons לאחר הדיאליזה.
העבירו את התמיסה למכלים מתאימים והקפיאו אותם בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה. לאחר מכן, בצעו ליופיליזציה לתמיסה למשך ארבעה ימים כדי להפיק אבקת PEG DM לבנה ומסונת לשחרור התאים מפני השטח של בקבוק התרבית שעבר טיפול. ראשית, שאבו את המצע, שטפו את התאים עם HBSS נטול סידן ומגנזיום בטמפרטורה של 37°C, ושאבו את ה-HBSS.
כעת הוסיפו 2 mL של תמיסת Trypsin ו-EDTA בטמפרטורה של 37 °C, והניחו לתאים להדגר ב-37 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, נקשו בחוזקה על דופן הבקבוק כדי לשחרר את התאים. הוסיפו לבקבוק 8 mL של מצע גידול בטמפרטורה של 37 °C ובצעו פיפטור נמרץ של תגלי התאים למעלה ולמטה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות.
לאחר העברת תמיסת התאים למבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 מיליליטר, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של התאים להדבקה. הוסיפו את הנפח הדרוש של תלי התאים כדי להגיע ל-400,000 תאים לבאר לבארי של פלטת תרבית תלי של שש בארות; העבירו מנה של 50 מיקרוליטר של HBSS לכל באר של תאים להדבקה למבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.8 מיליליטר. לאחר מכן, טפטפו בזהירות את הכמות המתאימה של תלי הנגיף לתוך ה-HBSS שהוכן.
כעת הוסיפו לכל באער את הנפח המתאים של נגיף מדולל כדי להשיג את ה-MOI הרצוי, ולאחר מכן הוסיפו מצע לכל באער עד להבאת הנפח הכולל ל-1.7 milliliters. לבסוף, הניחו את הפלטה על שייקר אורביטלי בתוך האינקובטור, כוון את השייקר להגדרה נמוכה של כ-100 RPM כך שהמצע ישטוף בעדינות את הבאער, והניחו לתאים להצטבר במשך 24 עד 36 שעות. התחילו בחיתוך של הקצה המהודק ממזרק פלסטיק של one milliliter והניחו אותו כשהקצה הפתוח פונה כלפי מעלה במעמד, כדי ליצור כלי שבו ייווצר ההידרוג'ל.
בשלב הבא, העבירו בעזרת פפטה 20 µL של תמיסת PEG DM פוטו-אקטיבית אל הקצה הפתוח של המזרק, על גבי הבוכנה, תוך וידוא שהנפח מכסה את כל שטח פני הבוכנה. כווננו את הבוכנה במרווחים קטנים כדי להשיג משטח נוזל שטוח. כעת, החזירו את הפפטה למעמד והניחו את המעמד תחת מנורת UV למשך כשמונה דקות כדי לאפשר קשירה צולבת (cross-linking) של ההידרוג'ל.
במהלך זמן זה, העבירו באמצעות פיפט נפח המכיל את מספר התאים והאגרגטים הרצוי לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.8 milliliter. סגרו את השפופרת ולאחר מכן צנטריפוגו את התאים והאגרגטים למשך חמש דקות במהירות של 130 gs. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-פיפט, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים שבתחתית השפופרת.
ככל שראש המדיה מתקרב למשקע, השתמש בקצה פ pipette עדין יותר של 10 microliter. פזר את מקבצי התאים באופן אחיד בתוך תמיסת המקדים של הג'ל, תוך וידאי שכל התאים עטופים במלואם. זהו החלק המורכב ביותר בפרוצדורה זו. בעת ביצוע שלב זה, הקפד לערבב ולהעביר את המשקע בעדינות.
כעת, השהו בעדינות את משקע התאים ב-20 microliters של תמיסת ה-PEG DM הפוטואקטיבית. בעזרת טיפ פפטה רחב, העבירו את תליית התאים למזרק, מעל לחלק ההידרוג'ל המצולב, וחשפו את המזרק לשמונה דקות נוספות של אור UV כדי להשלים את בניית ההידרוג'ל. בסיום התהליך, התאים צריכים להיות encapsulated לחלוטין בתוך ההידרוג'ל הגלילי.
לבסוף, הוסיפו 1 mL של HBSS לבאר אחת של פלטת 24 בארות ו-1 mL של מצע גידול לבאר אחרת. לאחר מכן, פלטו את ההידרוג'ל מהמזרק אל תוך ה-HBSS לשטיפה קצרה של הג'ל. העבירו את הג'ל למצע הגידול והדגירו את הפלטה בתנאים הרצויים.
בכל נקודה במהלך התרבית, ניתן לדגום את התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר תחילת האיתות ההיפוקסי; יש להניח את פלטת 24 הבארות עלבמת המיקרוסקופ, תוך מרכוז הבאר עם ההידרוג'ל תחת העדשה. האיתות ספציפי מספיק כדי לזהות תאי איתות בודדים, אך הרזולוציה עשויה להיות לא מספקת לקביעת הלוקליזציה התוך-תאית של האיתות. בתאי איתות, האיתות נצפה בדרך כלל באופן אחיד בכל רחבי הציטופלזמה.
איור זה מציג דוגמה מייצגת של אגרגטים של minx המעטופים בתוך הידרוג'ל PEG בתוך תא הג'ל. האגרגטים צריכים להיות סגורים לחלוטין בתוך המטריצה ומפוזרים באופן הומוגני כדי לאפשר הובלה טובה יותר של חומרי הזנה, כפי שנראה כאן. שימו לב כי הג'ל מקושר-הצלב הוא מוצק לאורכו ומקבל את צורת הכלי שבו בוצעה התגובה.
באיור זה מוצג סיגנל פלואורסצנטי מייצג של היפוקסיה בתאי min six מצוברים בתוך הידרוג'ל PEG DM; התאים הוכנסו לקפסולציה ולאחר מכן הוכנסו לדגירה ב-20% oxygen למשך 44 שעות. התאים המוצגים משמאל אינם מראים סיגנל של היפוקסיה, בעוד שתאים שעברו קפסולציה ולאחר מכן דגירה ב-2% oxygen למשך 44 שעות, כפי שמוצג מימין, מראים סיגנל ברור ונרחב. ניתן לעקוב אחר היפוקסיה גם בסוגי תאים אחרים.
איור זה מציג סיגנל היפוקסיה מייצג באגרגטים של תאי גזע מזנכימליים עטופים. כפי שניתן לראות באיור השמאלי ביותר, הסיגנל הפלואורסצנטי אינו ניתן לזיהוי לאחר 12 שעות ב-2% oxygen, לאחר מכן, כפי שניתן לראות באיור המרכזי, הוא בולט יותר לאחר 24 שעות ב-2% oxygen. ולבסוף, כפי שניתן לראות מימין, הוא מבוטא מאוד לאחר 96 שעות ב-2% oxygen בעקבות פרוצדורה זו.
ניתן לבצע שיטות נוספות כגון Eliza, ניתוח של חלבונים מופרשים ובדיקות חיות תאים כדי לקשר בין איתות היפוקסי לבין הפנוטיפ של התא. באמצעות פיתוח זה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחומי הנדסת הרקמות והמסירה הטיפולית מבוססת-תאים לחקור את פונקציית ההישרדות וההדDifferentiation של תאים בתוך פיגומים וחומרי אנקפסולציה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לאנקפסולציה פוטו-כימית של תאים בתוך הידרוג'ל PEG מקושר, המאפשרת מעקב אחר אותות היפוקסיה באגרגטים של אינסולינומה עכברית שנעשו להם אנקפסולציה. הטכניקה מאפשרת בחינה סדרתית של תאים בתוך פיגום הידרוג'ל ומקשרת בין אותות היפוקסיה לבין שינויים בפנוטיפ התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- כמיסת תאים
- שיווך היפוקסיה
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- היפוקסיה משפיעה על הישרדות התאים ותפקודם בתרביות תלת-ממדיות (3D).
- PEG נבחר בשל תכונות ההעברה הנוחות שלו והתאימות התאית שלו.
- הבנת ההיפוקסיה חיונית לטיפולים המכוונים למחסור בהורמונים.
- פעילות של גורם השראה להיפוקסיה (Hypoxia inducible factor) נמצאת במתאם עם הפרשת אינסולין מתאי בטא.
מטרת המחקר
- לניטור תגובות תאיות להיפוקסיה במקבצי תאים עטופים ב-PEG.
- להדמיה של פעילות גורם השראה להיפוקסיה (hypoxia inducible factor) בתוך מקבצי תאים חיוניים.
- לבחינת השלכות על הולכה תרפויטית מבוססת תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקה של תאים מפוזרים עם נגיף בעל סימון פלואורסצנטי.
- תרבית תאים ליצירת אגרגטים על שייקר.
- פונקציונליזציה וניקוי של PEG לינארי.
- כליאה של אגרגטי תאים בתוך הידרוג'ל של PEG DM.
תוצאות עיקריות
- הכחסה מוצלחת של תאים בתוך ההידרוג'ל.
- ניטור פלואורסצנטי של אות סמן היפוקסיה בתנאי חמצן משתנים.
- ויזואליזציה של פעילות הגורם המושרה על ידי היפוקסיה (hypoxia inducible factor) ברמה התאית.
- תובנות לגבי השפעת ההיפוקסיה על הישרדות ותפקוד תאים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך לחקר היפוקסיה בתרביות תלת-ממדיות (3D).
- יש לה יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית ובטיפול בסוכרת.
- מחקרים נוספים עשויים לשפר את ההבנה של טיפולים מבוססי תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניטור של איתות היפוקסי במקבצי תאים מעטופים נותן מענה לאתגר קריטי בטיפולים מבוססי תאים: הבטחת חיות תפקודית של רקמות מושתלות בתנאים המוגבלים על ידי דיפוזיה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של השפעות מחסור בחמצן על תאים מייצרי אינסולין, ובכך תומכת בביטחון ניבוי לגבי היעילות הטיפולית. באמצעות קביעת מתאם בין פעילות HIF-1α למדדים תפקודיים, היא מסייעת בהפחתת סיכונים של אסטרטגיות עיטוף עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית ובטיפול בסוכרת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי קישור הפעלת הגורם המושרה על ידי היפוקסיה (hypoxia-inducible factor) לירידה תפקודית בהפרשת אינסולין.
- ערך תפעולי: מספק קריאה פלואורסצנטית כמותית לצורך הבהרת מסלולים במודלים של תאי בטא תכולים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי זיהוי ספי ס 산חמנו (oxygen thresholds) הפוגעים בתפקוד התאים לפני בדיקות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: יצירת הידרוגלים סטנדרטיים עם אגרגטים encapsulated לסריקת מדרג חמצן הדירה.
- פלט כמותי: מאפשר מיפוי מרחבי וזמני של סיגנלינג היפוקסי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תועלת הפלטפורמה: מקלה על סטנדרטיזציה של הבדיקה תחת תנאי חמצן שונים כדי להעריך את ביצועי חומר ה-encapsulation.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את המיקרו-סביבה חסרת כלי דם שנתקלים בה איורי לבלב encapsulated בטיפול בסוכרת מסוג 1.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הערכת ההיפוקסיה בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של הישרדות ותפקוד השתל.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לבחירת חומרים ולתכנון גאומטרי במטרה לצמצם אובדן תפקודי שנגרם מהיפוקסיה במועמדים טיפוליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת הערכת היפוקסיה לאחר היווצרות האגרגטים ולפני סריקה תפקודית, ובכך תומכת בזיהוי של פורמולציות כיסוי (encapsulation) מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מסלולים תלויי-חמצן בצבירי תאי בטא עטופים.
- סריקה: מספק הידרוגלים הניתנים לבדיקה וניתנים לשחזור לצורך הערכת השפעות של תרכובות או חומרים תחת היפוקסיה מבוקרת.
- אנליטיקה: מספק פלואורסצנציה המונעת על ידי HIF-1α כביומרקר כמותי להשוואת תנאי חמצן ויעילות העטיפה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סיגנל היפוקסיה in vitro לתוצאות פרה-קליניות על ידי קורלציה בין פעילות הסמן לנתוני הפרשת אינסולין.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מודולרית להערכת חומרי עטיפה במגוון סוגי תאים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בירידה תפקודית המתווכת על ידי היפוקסיה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של אנקפסולציה והדמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי מוקדם של סיכונים הקשורים להיפוקסיה בשלבי הפיתוח.
- השפעה על פורטפניו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של אסטרטגיות אנקפסולציה, בהתבסס על שימור התפקוד בתנאי חמצן נמוך.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בווירולוגיה, תרביות תאים וייצור הידרוגלים.
- תלוי בתשתית לקשירה צולבת באמצעות UV וביכולות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה של מערכות תרבית בבקרה של רמות חמצן כדי לאפשר השוואה בין צוותים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השגריר להיפוקסיה על אגרגטים של תאים ראשוניים או תאים נגזרים מתאי גזע.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים ברזולוציית האות עבור לוקליזציה סוב-סלולרית ותלות ביעילות הטרנסדוקציה הוויראלית.
