Name: איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: חקור מעקב אחר איתות היפוקסי בתאים מצורפים בציטוקומפטיביות PEG hydrogel באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניטור סדרתי של תגובות תאיות לחמצן נמוך בתרביות תלת-ממדיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הודות Anseth קריסטי במעבדה של אוניברסיטת קולורדו בבולדר בנדיבות עבור אספקת MIN6 תאים. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NSF.

1. PEGDM סינתזה PEGDM photoactive macromer הכנה פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2g של PEG (ליניארי, 10,000 Da) לתוך בקבוקון זכוכית 40mL עם מכסה פלסטיק קשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ 308μL של אנהידריד methacrylic ואת כובע רופף את הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל את הבקבוקון על גבוה למשך 2 דקות במיקרוגל ביתי רגיל. חום לבישת כפפות עמידות, מערבולת ביסודיות את הבקבוקון, אז מיקרוגל גבוה עבור 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לאפשר הבקבוקון להתקרר מספיק כדי להיות מטופלים עם כפפות. פותח את הפקק לאט להוסיף מתילן כלוריד בעוד מתערבל את הבקבוקון. הוסף מספיק כך שהפתרון נראה ברור ואחיד, vortexing המדגם לפי הצורך. ההיקף הכולל של מתילן כלוריד המשמש צריך להיות 1.5-2 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGDM המשקע ב 200 מ"ל של קר, עוררה אתר diethyl ידי הוספת dropwise פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את PEGDM על ידי סינון ואקום ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את PEGDM בסכום הולםמים deionized (בדרך כלל 100 -150 מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הפתרון נגד מים deionized במשך 5 ימים בצינור דיאליזה בעל משקל מולקולארי חתך של 1000 Da. החלף את המים פעם ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הפתרון לתוך מכולות מתאים להקפיא ב -80 מעלות למשך הלילה. Lyophilize הפתרון במשך 4 ימים להניב מטוהרים לבן אבקת PEGDM. אחסן את האבקה על 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון PEGDM photoactive, תחילה להכין 0.5 אחוזים במשקל photoinitiator פתרון המניות על ידי המסת Irgacure 2959 במים deionized. הפתרון וורטקס ולאחסן אותו בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PEGDM 10 wt% ו 0.025% wt Irgacure 2959 פתרון תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). וורטקס ביסודיות כדי להבטיח פירוק PEGDM. אנחנו בדרך כלל להכין 1mL של פתרון זה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניוםולאחסן ב 4 ° C </li></ol> 2. תרבות, זיהומים, הצטברות של תאים MIN6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MIN6 תאים בתרבית בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% FBS, גלוקוז 7mm, 100 יחידות / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, ועל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotercin B בסביבה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחרר את התאים מן השטח טופלו בקבוק תרבות, לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 37 ° C סידן / מגנזיום ללא HBSS, לשאוב HBSS, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 37 ° C-EDTA טריפסין פתרון ולאפשר לתאים דגירה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היטב בצנצנת את הצד של הבקבוק כדי להפיל את התאים ללא תשלום, ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של 37 ° C ו-בינוני במרץ פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מקפיד שלא להכניס בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer או תאים אחרים ספירת ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהכנת להדביק את התאים עם יצרניתהנגיף, תחילה לקבוע את המספר הכולל של תאים להיות נגוע לחשב את עוצמת הקול של השעיה וירוס הנדרש כדי להשיג את הרצוי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) (5-10 חלקיקים זיהומיות לכל תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנגיף HBSS בקפידה על ידי pipeting את הכמות הנכונה של השעיה וירוס לתוך נפח טרום aliquoted של HBSS בתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. 50 μL של HBSS לכל טוב של תאים צבירה המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את התאים על ידי pipeting אותם למעלה ולמטה הצינור שלהם, אז pipet נפח הדרושים כדי להשיג 400,000 תאים לכל גם לתוך הבארות של צלחת 6-היטב בתרבות ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של הנגיף מדולל היטב כל אחד כדי להשיג את הרצוי משרד הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עד טוב כל כדי להביא את הנפח הכולל של עד 1.7 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הגדר את שייקר על הגדרה נמוכה, כך המדיום בעדינות שוטף סביב בארות (~ 100 סל"ד). אפשר את התאים aggregate עבור 24-36 שעות. המצרפים בקוטר משוער של 75-175 מיקרומטר צריך להיווצר. </li></ol> 3. Encapsulation של תאים PEGDM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים להיות במארז כמו פיזור (שלב 2.4) או צבירת הבא (שלב 2.10). מאז מבשר הידרוג פתרון PEGDM הוא נוזל, תאים נוטים להתיישב לפני crosslinking היווצרות הידרוג'ל. אם ליישוב צפויה להתרחש במהירות, כגון עם אגרגטים גדולים יותר, זה עשוי להיות מועיל כדי לייצר את הידרוג בשני שלבים, כך התאים ליישב למישור המרכזי של הג'ל. צעד אחד סינתזה הידרוג הליך מתאים תאים מפוזרים מוצג (איור 2) ואת הליך בן שני שלבים מוצג היטב (איור 3) ו המפורטים להלן (3.2-3.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת כלי שבו הידרוג תוקם על ידי חיתוך קצה נמוגו של מזרק פלסטיק 1 מ"ל ו הצבתו לפתוח בסופו של דבר במעמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 Pipet μL של PEGDM photoactive כךlution אל הקצה הפתוח של המזרק על הבוכנה לוודא נפח מכסה את פני הבוכנה כולה. התאם את הבוכנה במרווחים קטנים על מנת להשיג משטח שטוח נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את pipet במעמד ולמקם את מתלה מתחת מנורת UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) למשך כ 8 דקות, כדי לאפשר crosslinking הידרוג'ל. במהלך תקופה זו, הכנה של תאים עשויה להיות החל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Pipet המכיל את המספר הרצוי של תאים / אגרגטים לתוך צינור 1.8 microcentrifuge מ"ל, כובע, ו צנטריפוגות התחתית 130 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipettor, להסיר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה בקצה הצינור. כאשר ראש התקשורת מתקרב גלולה, זה עשוי להיות מועיל להשתמש עדינה, 10 טיפ pipet μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התא גלולה ב 20 μL של פתרון photoactive PEGDM (משתמש קצה פעורת פה pipet אם עובדים עם אגרגטים) ולהוסיף את ההשעיה התא המזרק על גבי הדואר crosslinked בעבר חלק הידרוג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המזרק עד 8 דקות נוספות של אור UV להשלים את הבנייה של הידרוג. בסיום, התאים צריכים להיות במארז מלא בתוך הידרוג גלילית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הידרוג מן המזרק לתוך 1 מ"ל של HBSS היטב הצלחת 24 באר בקצרה לשטוף את הג'ל. מעבירים את הג'ל על 1 מ"ל של התקשורת גם הצלחת 24 באר ותרבות בתנאים הרצוי. </li></ol> 4. היפוקסיה מעקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב כלשהו במהלך התמונה תרבות, התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר תחילת איתות hypoxic. תלוי מה נעשה הדמיה ניתן התמונה צלחת רב היטב או להעביר את הג'ל אל המיקרוסקופ שקופית לפני ההשמה על הבמה מיקרוסקופ. עירור שיא של Ds האדום מושגת ב 556nm ופליטה השיא מתרחש 586nm. פליטה חזקה למדי ולכן photobleaching לא היה observאד להיות בעייתי. זמן השהיה בין תחילת ייצור החלבון וזיהוי האות הראשונה היא כ 12 שעות. אות הוא ספציפי מספיק כדי לזהות תאים איתות בודדים, אבל ההחלטה עשויה להיות מספקת לצורך קביעת לוקליזציה אותות תאיים. בתאים איתות, אות הוא נצפה בדרך כלל בצורה אחידה בכל בציטופלסמה. עוצמת האות ניתן גם להגדיל את החשיפה המורחבת היפוקסיה, למרות שאנחנו עדיין לא נקבע באופן מלא אם זה נובע ביטוי חלבון מוגברת, הצטברות חלבון הכוללת, או חלבון התבגרות מאוחרת. </li></ol> 5. נציג תוצאות למשל נציג MIN6 אגרגטים הגלום הידרוג PEG מוצגת באיור 4. ג'ל crosslinked יהיה מוצק לאורך, לוקח את הצורה של הכלי שבו התגובה בוצעה. ג'ל עם המשטחים החיצוניים חלקים עדיפה להשתלה כדי לסייע למניעת מחדש גוף זרsponse. בתוך הג'ל, אגרגטים התא צריך להיות סגור לגמרי במטריצה ​​ומופץ homogenously כדי לאפשר תחבורה מזין יותר. תמונות נציג איתות hypoxic ב MIN6 אגרגטים הם בתמונה באיור 5. זהים MIN6 אגרגטים נגוע בווירוס סמן היו בתרבית או 20% O 2 (5 א) או 1% O 2 (5 ב) עבור 44 שעות לפני לכידת תמונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg"> באיור 1. סכמטי של פעילות של מערכת סמן היפוקסיה שלנו. הכניסה adenoviral של האדום Ds DR גנים האמרגן הזרם HRE מאפשר ייצור היפוקסיה-Induced של חלבון פלואורסצנטי תחת שליטה של ​​HIF-1. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg"> באיור 2. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה צעד יחיד של התפזרו MIN6 תאים CRosslinked הידרוג PEGDM. עבור כל ג'ל, התאים מפוזרים הם תלויים 40μL של הפתרון PEGDM photoactive macromer. זה ממוקם מזרק 1mL ערופה לבין הידרוג נוצר תחת אור UV 365nm לאחר 10-12 דקות. בסיום, הדיסק הידרוג יוסר המזרק, שטף והניח בצלחת בינוני מלא גם עבור הדגירה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg"> באיור 3. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה כפול צעד של MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM crosslinked. עבור ג'ל כל חצי ג'ל נוצר לראשונה על ידי crosslinking UV של 20μL של הפתרון PEGDM macromer photoactive במשך 8 דקות. MIN6 אגרגטים מושעים בקפידה 20μL נוספת של פתרון photoactive macromer אשר מתווסף על גבי ג'ל וחצי מראש יצרו. הג'ל מלא נוצרת על ידי 8 דקות נוספות של חשיפה UV עם אגרגטים במארז מלא המדיאלימטוס של הג'ל. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg"> איור 4. מקדימה של הידרוג 40μL בהגדלה 20X. MIN6 אגרגטים (~ 400,000 תאים בסך הכל) נראים בבירור בתוך הג'ל. קוטר Hydrogel הוא כ 6 מ"מ (בר = 1mm). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg"> איור 5. היפוקסיה פלורסנט איתות MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM. תאים שהיו במארז והניח אז הדגירה 20% O 2 במשך 44 שעות לא יוצגו איתות היפוקסיה (א) תוך התאים היו ארוזים אז מודגרות ב 2% O 2 במשך 44 שעות להציג איתות ברור, בכל מקום. (בר = 100μm) (ב).

<ol><li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li>
<li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li>
<li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Appli.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li>
<li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li>
<li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li>
<li>Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+%CE%B2-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocyte+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polymer+Edn%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+on+isolated+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Soc.+Artif.+Intern.+Organs%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue.</a> Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li>
<li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li>
<li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hypoxia-inducible+factors+%28HIF%29%2C+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מציעה שיטה מהירה ופשוטה אנקפסולציה תא הידרוג PEG עם שימוש מינימלי ללא תנאים פיזיולוגיים. PEG מהווה חומר אנקפסולציה מאוד שימושי עבור biocompatibility שלה וקלות שינוי. וריאציה פשוטה של ​​אחוז PEG בפתרון photoactive, למשל, ניתן להשתמש כדי להתאים את תכונות מכניות, כגון מודולוס דחיסה, ומאפיינים הובלה באמצעות גודל הנקבוביות. כמו כן, PEG הוא לשנות בקלות על ידי תוספת של שרשראות צד. הידרוג PEG, אם כן, מייצגים הן מכשיר קליני מבטיח פלטפורמה גמישה עבור במבחנה מחקר שיטה למעקב אחר היפוקסיה ב-PEG הגלום בתאים יש גם הציג. שיטה זו שימושית עבור הפשטות של זיהוי היפוקסיה ועל נמנע הצורך להקריב את התאים של עניין. הטכניקה ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים מגוון רחב של מצבים שהופך אותנו שלהefulness רחב. למשל, היפוקסיה כרמז על התמיינות בתאי גזע עשוי להיות במעקב בתא תרבויות גזע micromass. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת רק כדי לפזר מערכות תא או מערכת שבה פזורים תאים מצטבר מאוחר יותר. כמו כן, זיהוי של אות ניאון עלול להיות קשה ברקמות גדול יותר או צפופים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות (אופציונלי </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309,028, 500 גרם </td><td></td></tr><tr><td> Methacrylic אנהידריד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276,685, 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוגל </td><td> אמרסון </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> תעשיות מדע </td><td> Si-A236 </td><td></td></tr><tr><td> מתילן כלוריד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl Ether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> דיאליזה Tubing </td><td> ספקטרום </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעבדות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מקפיא </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> משאבת ואקום </td><td> וולש </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> מזרק Filter </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * מנהג ניסוח </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA מעבדות </td><td> ת 15-351 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003-CF </td><td></td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> NAPCO סדרה 8000 WJ w / O2 דיכוי </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital שאכר</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> מנורת UV </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> מחזיק בשתי 40W, 365nm כחול blacklight נורות UV </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * סדר מספר. דגם R 5810 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> עם filterset עבור עירור 556nm / פליטה 586nm </td></tr></table>

איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי encapsulated

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

בסוכרת מסוג 1, הרס אוטואימוני של תאי בטא (β-cells) בלבלב מוביל לאובדן ייצור האינסולין ולהיפרגליקמיה שעלולה להיות קטלנית. כאפשרות טיפול חלופית להזרקת אינסולין חיצוני, נבחנה השתלה של רקמת לבלב תפקודית1,2. גישה זו מבטיחה שחזור טבעי וארוך טווח יותר של נורמוגליקמיה. כדי למנוע דחייה, נדרשת הגנה על רקמת התורם מפני מערכת החיסון של המארח, ואנקפסולציה היא שיטה המשמשת לסיוע בהשגת מטרה זו.
חומרים ממקור ביולוגי, כגון alginate3 ו-agarose4, היו הבחירה המסורתית לבניית קפסולות, אך הם עלולים לגרום לדלקת או לצמיחה פיברוטית מוגברת5 שעלולה להפריע להובלת חומרים מזינים וחמצן. לחלופין, הידרוג'לים סינתטיים המבוססים על poly(ethylene glycol) (PEG) אינם מתפרקים, ניתנים לפונקציונליזציה בקלות, זמינים בדרגת טהרה גבוהה, בעלי גודל נקבוביות שניתן לשלוט בו, והם בעלי תאימות ביולוגית גבוהה ביותר6,7,8. כיתרון נוסף, ניתן להיווצר הידרוג'לי PEG במהירות בתגובת צליבה פוטו-כימית (photo-crosslinking) פשוטה שאינה דורשת שימוש בטמפרטורות שאינן פיזיולוגיות6,7. הליך כזה מתואר כאן. בתגובת הצליבה, פירוק ב-UV של הפוטו-איניציאטור, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), מייצר רדיקלים חופשיים שתוקפים את קשרי הפחמן-פחמן הכפולים של הויניל ב-PEG עם dimethacrylate (PEGDM), ובכך גורמים לצליבה בקצוות השרשרת. ניתן להשיג צליבה בתוך 10 דקות. הוכח כי הידרוג'לי PEG שנבנו באופן זה תומכים בתאים באופן חיובי7,9, והריכוז הנמוך של הפוטו-איניציאטור והחשיפה הקצרה לקרינת UV אינם פוגעים בחיוניות ובבתפקוד של הרקמה המעטופה10. בעוד שאנו מבצעים methacrylate ל-PEG שלנו בשיטה המתוארת להלן, ניתן לרכוש PEGDM באופן ישיר מספקים כגון Sigma.
תוצאה מובנית של אנקפסולציה היא בידוד התאים מרשת כלי דם. לכן, אספקת רכיבי תזונה, ובמיוחד חמצן, פסיתה ומוגבלת על ידי דיפוזיה. זמינות חמצן מופחתת זו עשויה להשפיע במיוחד על תאי β, שתפקוד הפרשת האינסולין שלהם תלוי מאוד בחמצן11-13. הרכב הקפסולה והגיאומטריה שלה ישפיעו גם הם על קצבי הדיפוזיה ומרחקי הדיפוזיה של החמצן. לכן, אנו מתארים גם טכניקה לזיהוי תאים היפוקסיים בתוך קפסולות ה-PEG שלנו. הדבקת התאים באדנווירוס רקומביננטי מאפשרת יצירת אות פלואורסצנטי כאשר מסלולי הגורם המושרה להיפוקסיה (HIF) התאיים מופעלים14. מכיוון ש-HIFs הם הרגולטורים העיקריים של התגובה השעתוקית להיפוקסיה, הם מהווים סמן מטרה אידיאלי לזיהוי איתות היפוקסי15. גישה זו מאפשרת זיהוי קל ומהיר של תאים היפוקסיים. בקצרה, האדנווירוס מכיל את הרצף לחלבון פלואורסצנטי אדום (Ds Red DR מבית Clontech) תחת בקרתו של טרימר של רכיב מגיב להיפוקסיה (HRE). ייצוב של HIF-1 בתנאי חמצן נמוכים יניע את השעתוק של החלבון הפלואורסצנטי (איור 1). פרטים נוספים על בניית נגיף זה פורסמו בעבר15. הנגיף מאוחסן ב-10% glycerol בטמפרטורה של -80° C כמנות רבות של 150 μL במבחנות צנטריפוגה של 1.5 mL בריכוז של 3.4 x 1010 pfu/mL.
מחקרים קודמים במעבדה שלנו הראו כי תאי MIN6 המעטפים כאגרגטים שומרים על חיוניותם לאורך 4 שבועות של תרבית ב-20% חמצן. אגרגטים של MIN6 שגודלו ב-2% או 1% חמצן הראו סימנים של תאים נמקרוטיים (עדיין כ-85-90% חיוניים) בצביעה ב-ethidium bromide, וכן שינויים מורפולוגיים ביחס לתאים ב-20% חמצן. הצורה הכדורית החלקה של האגרגטים שנראתה ב-20% אבדה, והאגרגטים נראו יותר כקבוצות תאים לא מאורגנות. בעוד שעקה של רמות חמצן נמוכות אינה גורמת לירידה ניכרת בחיוניות, היא משפיעה בבירור על האגרגציה והתפקוד של MIN6 כפי שנמדד על ידי הפרשת אינסולין מגרת-גלוקוז15. ניתוח Western blot של תאים מעטפים ב-20% ו-1% חמצן הראה גם עלייה משמעותית ב-HIF-1α עבור תאים שגודלו בתנאי חמצן נמוכים, מה שמתואם עם הביטוי של חלבון DsRed DR.

שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.

איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

בסוכרת מסוג 1, הרס אוטואימוני של תאי בטא ($\beta$-cells) בלבלב מוביל לאובדן ייצור האינסולין ולמצב שעלול להיות קטלני...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר את התגובה התאית להיפוקסיה באגריגטים של תאים המעטופים ב-PEG. בשלב הראשון, תאים מפוזרים מודבקים בנגיף הסימון ולאחר מכן תורגבשו על שייקר כדי לאפשר היווצרות של אגריגטים. לאחר מכן, PEG לינארי עובר פונקציונליזציה וה-PEG DM rimer עובר טהרה.לאחר מכן, מקפסלים את מקבצי התאים בתוך הידרוג'ל PEG DM. לבסוף, מתרבלים את ההידרוג'לים בתנאי חמצן שונים תוך ניטור פלואורסצנטי של אות סמן ההיפוקסיה. בסופו של דבר, ניתן להדמיאן את המיקום וההיקף של פעילות ה-hypoxia inducible factor בתוך מקבצי תאים חיים מקופסלים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פשוטה.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי הכליאה התאית והמסירה של טיפולים מבוססי תאים, כגון היכן מתרחשת היפוקסיה בתוך תרביות תלת-ממדיות, וכיצד היא משפיעה על הישרדות התאים ותפקודם? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על גישות של רפואה רגנרטיבית וטיפול בחסרים הורמונליים, כגון סוכרת, בשל ההשפעה המשמעותית של היפוקסיה ברקמות מצוברות וכלואות. הוכח כי פעילות של hypoxia inducible factor one נמצאת במתאם עם ירידה משמעותית בהפרשת אינסולין מתאי בטא, דבר שהניע ניסיונות להפריד איים של לבלב ראשוניים ולהרכיבם מחדש לאיים פסאודו-לבלב.צברים בעלי קוטר מופחת. המרקר שלנו יכול להעיד על פעילות של hypoxia inducible factor עם צברים ברמה התאית בתוך כל חומר עטיפה שהתרחב. PEG נבחר כחומר לקפסולה בשל תכונות ההעברה המועדפות שלו, התאימות התאית שלו והקלות שבה ניתן לבצע בו שינויים פונקציונליים.לאחר שוקל שני גרמים של PEG במבחנה מזכוכית בנפח 40 מיליליטר עם כ-308 מיקרוליטר של meth, acrylic, anhydride, סגור את המבחנה בצורה רפויה באמצעות פקק פלסטיק קשיח. חמם את המבחנה במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך שתי דקות במיקרוגל ביתי סטנדרטי. לאחר מכן, בעזרת כפפות עמידות לחום, ערבב את המבחנה היטב ב-vortex וחמם את התמיסה במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות נוספות.המתינו זמן קצר עד שהמבחנה תתקרר מספיק כדי שניתן יהיה לטפל בה, ולאחר מכן הסירו את הפקק תוך כדי סיבוב של המבחנה. ערבבו באיטיות פנימה methylene chloride, תוך ביצוע vortex לדגימה במידת הצורך, עד שהתמיסה נראית צלולה והומוגנית. לאחר מכן, הוסיפו את התמיסה בטיפות ל-200 milliliters של dathyl ether קר תחת ערבוב כדי להשקיע את ה-PEG dm.לאחר מכן, אספו את ה-PEG DM באמצעות סינון בוואקום והניחו לו להתייבש. לאחר שה-PEG DM התייבש, המיסו אותו בכ-100 עד 150 מיליליטר של מים דה-יוניים. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לתמיסה כנגד מים דה-יוניים למשך חמישה ימים בצינור דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (MWCO) של 1000 Daltons לאחר הדיאליזה.העבירו את התמיסה למכלים מתאימים והקפיאו אותם בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה. לאחר מכן, בצעו ליופיליזציה לתמיסה למשך ארבעה ימים כדי להפיק אבקת PEG DM לבנה ומסונת לשחרור התאים מפני השטח של בקבוק התרבית שעבר טיפול. ראשית, שאבו את המצע, שטפו את התאים עם HBSS נטול סידן ומגנזיום בטמפרטורה של 37°C, ושאבו את ה-HBSS.כעת הוסיפו 2 mL של תמיסת Trypsin ו-EDTA בטמפרטורה של 37 °C, והניחו לתאים להדגר ב-37 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, נקשו בחוזקה על דופן הבקבוק כדי לשחרר את התאים. הוסיפו לבקבוק 8 mL של מצע גידול בטמפרטורה של 37 °C ובצעו פיפטור נמרץ של תגלי התאים למעלה ולמטה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות.לאחר העברת תמיסת התאים למבחנה צנטריפוגית סטרילית של 15 מיליליטר, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של התאים להדבקה. הוסיפו את הנפח הדרוש של תלי התאים כדי להגיע ל-400,000 תאים לבאר לבארי של פלטת תרבית תלי של שש בארות; העבירו מנה של 50 מיקרוליטר של HBSS לכל באר של תאים להדבקה למבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.8 מיליליטר. לאחר מכן, טפטפו בזהירות את הכמות המתאימה של תלי הנגיף לתוך ה-HBSS שהוכן.כעת הוסיפו לכל באער את הנפח המתאים של נגיף מדולל כדי להשיג את ה-MOI הרצוי, ולאחר מכן הוסיפו מצע לכל באער עד להבאת הנפח הכולל ל-1.7 milliliters. לבסוף, הניחו את הפלטה על שייקר אורביטלי בתוך האינקובטור, כוון את השייקר להגדרה נמוכה של כ-100 RPM כך שהמצע ישטוף בעדינות את הבאער, והניחו לתאים להצטבר במשך 24 עד 36 שעות. התחילו בחיתוך של הקצה המהודק ממזרק פלסטיק של one milliliter והניחו אותו כשהקצה הפתוח פונה כלפי מעלה במעמד, כדי ליצור כלי שבו ייווצר ההידרוג'ל.בשלב הבא, העבירו בעזרת פפטה 20 µL של תמיסת PEG DM פוטו-אקטיבית אל הקצה הפתוח של המזרק, על גבי הבוכנה, תוך וידוא שהנפח מכסה את כל שטח פני הבוכנה. כווננו את הבוכנה במרווחים קטנים כדי להשיג משטח נוזל שטוח. כעת, החזירו את הפפטה למעמד והניחו את המעמד תחת מנורת UV למשך כשמונה דקות כדי לאפשר קשירה צולבת (cross-linking) של ההידרוג'ל.במהלך זמן זה, העבירו באמצעות פיפט נפח המכיל את מספר התאים והאגרגטים הרצוי לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.8 milliliter. סגרו את השפופרת ולאחר מכן צנטריפוגו את התאים והאגרגטים למשך חמש דקות במהירות של 130 gs. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-פיפט, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע התאים שבתחתית השפופרת.ככל שראש המדיה מתקרב למשקע, השתמש בקצה פ pipette עדין יותר של 10 microliter. פזר את מקבצי התאים באופן אחיד בתוך תמיסת המקדים של הג'ל, תוך וידאי שכל התאים עטופים במלואם. זהו החלק המורכב ביותר בפרוצדורה זו. בעת ביצוע שלב זה, הקפד לערבב ולהעביר את המשקע בעדינות.כעת, השהו בעדינות את משקע התאים ב-20 microliters של תמיסת ה-PEG DM הפוטואקטיבית. בעזרת טיפ פפטה רחב, העבירו את תליית התאים למזרק, מעל לחלק ההידרוג'ל המצולב, וחשפו את המזרק לשמונה דקות נוספות של אור UV כדי להשלים את בניית ההידרוג'ל. בסיום התהליך, התאים צריכים להיות encapsulated לחלוטין בתוך ההידרוג'ל הגלילי.לבסוף, הוסיפו 1 mL של HBSS לבאר אחת של פלטת 24 בארות ו-1 mL של מצע גידול לבאר אחרת. לאחר מכן, פלטו את ההידרוג'ל מהמזרק אל תוך ה-HBSS לשטיפה קצרה של הג'ל. העבירו את הג'ל למצע הגידול והדגירו את הפלטה בתנאים הרצויים.בכל נקודה במהלך התרבית, ניתן לדגום את התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר תחילת האיתות ההיפוקסי; יש להניח את פלטת 24 הבארות עלבמת המיקרוסקופ, תוך מרכוז הבאר עם ההידרוג'ל תחת העדשה. האיתות ספציפי מספיק כדי לזהות תאי איתות בודדים, אך הרזולוציה עשויה להיות לא מספקת לקביעת הלוקליזציה התוך-תאית של האיתות. בתאי איתות, האיתות נצפה בדרך כלל באופן אחיד בכל רחבי הציטופלזמה.איור זה מציג דוגמה מייצגת של אגרגטים של minx המעטופים בתוך הידרוג'ל PEG בתוך תא הג'ל. האגרגטים צריכים להיות סגורים לחלוטין בתוך המטריצה ומפוזרים באופן הומוגני כדי לאפשר הובלה טובה יותר של חומרי הזנה, כפי שנראה כאן. שימו לב כי הג'ל מקושר-הצלב הוא מוצק לאורכו ומקבל את צורת הכלי שבו בוצעה התגובה.באיור זה מוצג סיגנל פלואורסצנטי מייצג של היפוקסיה בתאי min six מצוברים בתוך הידרוג'ל PEG DM; התאים הוכנסו לקפסולציה ולאחר מכן הוכנסו לדגירה ב-20% oxygen למשך 44 שעות. התאים המוצגים משמאל אינם מראים סיגנל של היפוקסיה, בעוד שתאים שעברו קפסולציה ולאחר מכן דגירה ב-2% oxygen למשך 44 שעות, כפי שמוצג מימין, מראים סיגנל ברור ונרחב. ניתן לעקוב אחר היפוקסיה גם בסוגי תאים אחרים.איור זה מציג סיגנל היפוקסיה מייצג באגרגטים של תאי גזע מזנכימליים עטופים. כפי שניתן לראות באיור השמאלי ביותר, הסיגנל הפלואורסצנטי אינו ניתן לזיהוי לאחר 12 שעות ב-2% oxygen, לאחר מכן, כפי שניתן לראות באיור המרכזי, הוא בולט יותר לאחר 24 שעות ב-2% oxygen. ולבסוף, כפי שניתן לראות מימין, הוא מבוטא מאוד לאחר 96 שעות ב-2% oxygen בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות נוספות כגון Eliza, ניתוח של חלבונים מופרשים ובדיקות חיות תאים כדי לקשר בין איתות היפוקסי לבין הפנוטיפ של התא. באמצעות פיתוח זה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחומי הנדסת הרקמות והמסירה הטיפולית מבוססת-תאים לחקור את פונקציית ההישרדות וההדDifferentiation של תאים בתוך פיגומים וחומרי אנקפסולציה.

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

בסרטון זה אנו מדגימים את הטכניקה למדידת אינטראקציות טרנס-תאיות בין מולקולות היצמדות תאים סינפטיים באמצעות בדיקת צבירת תאי HEK. בבדיקה זו, מספר שווה של תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים קדם-סינפטית רצויה וחלבון פלואורסצנטי מעורבבים עם תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים פוסט-סינפטית וחלבון פלואורסצנטי נוסף. האינטראקציה בין מולקולות ההיצמדות התא מאלצת את התאים להצטבר, דבר שניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת צבירת תאים לזיהוי אינטראקציות טרנס בין מולקולות היצמדות תאים

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

הפרוטוקול הנוכחי מפתח טכניקה מבוססת תמונה למדידת צפיפות תאים אזורית מהירה, לא הרסנית ונטולת תוויות בתוך אגרגטים של גידולים תלת-ממדיים. הממצאים חשפו שיפוע של צפיפות תאים, עם צפיפות תאים גבוהה יותר באזורי ליבה מאשר שכבות חיצוניות באגרגטים מתפתחים ומוות בעיקר של תאים היקפיים באגרגטים HER2+ שטופלו בטרסטוזומאב.

הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

חקור מעקב אחר איתות היפוקסי בתאים מצורפים בציטוקומפטיביות PEG hydrogel באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת ניטור סדרתי של תגובות תאיות לחמצן נמוך בתרביות תלת-ממדיות.

איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

גלה סרטונים נוספים