איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated
December 16th, 2011
שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר את התגובה התאית להיפוקסיה באגרגטים של תאים עטופים ב-PEG. בשלב הראשון, תאים מפוזרים נדבקים בנגיף הסמן ולאחר מכן מתורבתים על שייקר כדי לאפשר היווצרות אגרגטים. היתד הליניארי הבא מתפקד ומטהר את ה-PEG DM
.לאחר מכן אגרגטים של התאים עטופים בהידרוג'ל PEG DM. לבסוף, ההידרוג'לים מתורבתים בתנאי חמצן שונים תוך ניטור פלואורסצנטי לאות סמן ההיפוקסיה. בסופו של דבר, ניתן לדמיין את המיקום וההיקף של פעילות הגורם המעורר היפוקסיה בתוך אגרגטים עטופים ברי קיימא של תאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פשוטה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באנקפסולציה של התאים ובשדות האספקה הטיפולית מבוססת התאים, כגון היכן מתרחשת היפוקסיה בתרביות תלת מימד, וכיצד היא משפיעה על הישרדות התאים ותפקודם? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על גישות רפואה רגנרטיבית וטיפול בחסרים הורמונליים כגון סוכרת קצבה בגלל ההשפעה העיקרית של היפוקסיה ברקמות מצטברות ועטופות. הוכח כי פעילות גורם אחד המעוררת היפוקסיה קשורה להפרשת אינסולין מופחתת מתאי בטא, מה שמניע ניסיונות לנתק את הלולאות הראשוניות ולהפוך אותן לפסאודו.
אגרגטים בקוטר מופחת. הסמן שלנו יכול להצביע על פעילות גורם השראת היפוקסיה עם אגרגטים ברמה התאית בתוך כל חומר עטיפה משוחרר. PEG נבחר כחומר קפסולה בשל תכונות ההעברה החיוביות שלו, תאימות הציטו והקלות שבה ניתן לשנות אותו פונקציונלית.
לאחר שקילת שני גרם PEG בבקבוקון זכוכית של 40 מיליליטר בכ-308 מיקרוליטר מת', אקריליק, אנהידריד וסגר את הבקבוקון באופן רופף עם מכסה פלסטיק קשיח. מיקרוגל את הבקבוקון גבוה במשך שתי דקות במיקרוגל ביתי רגיל. לאחר מכן, ללבוש כפפות עמידות בחום, מערבל היטב את הבקבוקון ולחמם את התמיסה במיקרוגל למשך חמש דקות נוספות.
הניחו לבקבוקון להתקרר מספיק כדי לטפל בו ואז פתחו אותו תוך כדי סיבוב הבקבוקון. מערבבים לאט פנימה מתילן כלוריד, מערבולת הדגימה לפי הצורך עד שהתמיסה נראית צלולה והומוגנית. לאחר מכן, הוסף את התמיסה טיפתית ל-200 מיליליטר של אתר דתיל קר מעורבב כדי לזרז את ה-PEG dm.
לאחר מכן אסוף את ה-PEG DM על ידי סינון ואקום ואפשר לו להתייבש. לאחר שה-PEG DM התייבש, ממיסים אותו בכ-100 עד 150 מיליליטר מים נטולי יונים. לאחר מכן יש לבצע דיאליזה של התמיסה כנגד מים נטולי יונים למשך חמישה ימים בצינורות דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי של 1000 דלטון לאחר דיאליזה.
הכניסו את התמיסה למיכלים מתאימים והקפיאו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן ליופיל את התמיסה למשך ארבעה ימים כדי ליצור אבקת PEG DM לבנה מטוהרת כדי לשחרר את התאים ממשטח בקבוק התרבית המטופל. ראשית, יש לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים ב-37 מעלות CELs סידן, HBSS נטול מגנזיום ולשאוף את ה-HBSS.
כעת הוסיפו שני מיליליטר של נסיעות של 37 מעלות צלזיוס ותמיסת EDTA, ואפשרו לתאים לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן צנצנו בחוזקה את צד הבקבוק כדי לשחרר את התאים בשמונה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, בינוני לבקבוק ופיפטה במרץ את מתלה התא למעלה ולמטה. מקפידים לא להכניס בועות.
לאחר העברת תמיסת התא לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, ספור את התאים על ידי ציטומטר המו כדי לקבוע את המספר הכולל של התאים שיש להידבק. הוסף את הנפח הדרוש של תרחיף תאים כדי להשיג 400,000 תאים לבאר לבארות של צלחת תרבית מתלה של שש בארות ו-50 מיקרוליטר של HBSS לכל באר תאים כדי להידבק לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.8 מיליליטר. לאחר מכן, פיפטה בזהירות את הכמות המתאימה של תרחיף הנגיף לתוך ה-HBSS המוכן.
כעת הוסף את הנפח המתאים של הנגיף המדולל לכל באר כדי להשיג את ה-MOI הרצוי, ולאחר מכן הוסף מדיום לכל באר כדי להביא את הנפח הכולל ל-1.7 מיליליטר. לבסוף, הנח את הצלחת על שייקר אורביטלי בתוך החממה, הצב את השייקר על הגדרה נמוכה כ -100 סל"ד כך שהמדיום נשטף בעדינות סביב הבאר ויאפשר לתאים להצטבר במשך 24 עד 36 שעות. התחל בחיתוך הקצה המחודד ממזרק פלסטיק של מיליליטר אחד והנחתו פתוחה בסופו של דבר במתלה ליצירת כלי בו ייווצר ההידרוג'ל.
לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת PEG DM פוטו אקטיבית לקצה הפתוח של המזרק על הבוכנה, וודא שהנפח מכסה את כל משטח הבוכנה. כוונן את הבוכנה במרווחים קטנים כדי להשיג משטח נוזל שטוח. כעת הנח את הפיפטה בחזרה לתוך המתלה ומקם את המתלה מתחת למנורת UV למשך כשמונה דקות כדי לאפשר קישור צולב של הידרוג'ל.
במהלך תקופה זו נפח פיפטה המכיל את מספר התאים והאגרגטים הרצוי לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.8 מיליליטר. מכסה את הצינור ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים והאגרגטים למשך חמש דקות ב -130 גרם. לאחר מכן בעזרת מיקרו פיפטר, הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא בקצה הצינור.
כאשר ראש המדיה מתקרב לגלולה, השתמש בקצה פיפטה עדין יותר של 10 מיקרוליטר פיזר באופן שווה את אגרגטי התאים בכל תמיסת מבשר הג'ל תוך הקפדה מלאה על עטיפה מלאה. זה החלק המסובך ביותר בהליך זה. בעת ביצוע שלב זה, הקפד להחזיר ולהעביר את הכדור בעדינות.
כעת, השעו בעדינות את גלולת התא ב-20 מיקרוליטר של תמיסת PEG DM הפוטו-אקטיבית. בעזרת קצה פיפטה רחב והוסף את תרחיף התא למזרק על גבי חלק ההידרוג'ל הצולב, חשוף את המזרק לשמונה דקות נוספות של אור UV כדי להשלים את בניית ההידרוג'ל. בסיום, התאים צריכים להיות עטופים במלואם בתוך ההידרוג'ל הגלילי.
לבסוף, הוסף מיליליטר אחד של HBSS לבאר אחת של צלחת של 24 בארות ומיליליטר אחד של מדיה לאחרת. ובכן, לאחר מכן הוציאו את ההידרוג'ל מהמזרק לתוך ה-HBSS כדי לשטוף את הג'ל בקצרה. מעבירים את הג'ל למדיה ומתרביים את הצלחת בתנאים הרצויים.
בכל נקודה במהלך התרבית, ניתן לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר התחלת מקום האיתות ההיפוקסי, צלחת 24 הבארות על שלב המיקרוסקופ, מרכז את הבאר עם ההידרוג'ל מתחת למטרה. האות ספציפי מספיק כדי לזהות תאי איתות בודדים, אך הרזולוציה עשויה להיות לא מספקת לקביעת לוקליזציה של אותות תוך תאיים. בתאי איתות, האות נצפה בדרך כלל באופן אחיד בכל הציטופלזמה.
איור זה מציג דוגמה מייצגת של אגרגטים מינקס עטופים בהידרוג'ל PEG בתוך תא הג'ל. אגרגטים צריכים להיות סגורים במלואם במטריצה ומפוזרים בצורה הומוגנית כדי לאפשר הובלת חומרים מזינים טובה יותר כפי שניתן לראות כאן. שימו לב כיצד הג'ל הצולב מוצק לכל אורכו ולובש את צורת הכלי בו בוצעה התגובה.
באיור זה מוצג איתות היפוקסיה פלואורסצנטי מייצג במינימום שישה תאים מצטברים בהידרוג'ל PEG DM מוצגים תאים שהיו עטופים ולאחר מכן הוכנסו לדגירה ב-20% חמצן למשך 44 שעות. בתמונה משמאל אינם מציגים איתות היפוקסיה בעוד שתאים שהיו עטופים ואז הודגרו ב-2% חמצן למשך 44 שעות. כפי שמוצג בתצוגה הימנית, ניתן לעקוב אחר היפוקסיה של אותות ברורים בכל מקום גם בסוגי תאים אחרים.
איור זה מציג איתות היפוקסי מייצג באגרגטים של תאי גזע מזנכימליים עטופים. כפי שניתן לראות באיור השמאלי ביותר, אות פלואורסצנטי אינו ניתן לזיהוי לאחר 12 שעות ב-2% חמצן, ואז כפי שניתן לראות באיור המרכזי ניכר יותר לאחר 24 שעות ו-2% חמצן. ולבסוף, כפי שניתן לראות מימין מתבטא מאוד לאחר 96 שעות ו-2% חמצן בעקבות הליך זה.
ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלייזה, ניתוח חלבונים מופרשים ובדיקות כדאיות תאים על מנת לתאם איתות היפוקסי עם פנוטיפ תאים. עם פיתוח זה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחומי הנדסת רקמות ואספקה טיפולית מבוססת תאים לחקור את תפקוד ההישרדות והתמיינות של תאים בתוך פיגומים וחומרי אנקפסולציה.
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה לכליאה צילומית של תאים בתוך הידרוג'ל PEG צולב, המאפשרת מעקב אחר איתות היפוקסי בצבירים של אינסולינומות עכבריות הכלואות. הטכניקה מאפשרת בדיקה סדרתית של תאים בתוך פיגום הידרוג'ל ומתאמת איתות היפוקסי עם שינויים בפנוטיפ התא.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- כליאה של תאים
- איתות היפוקסיה
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- היפוקסיה משפיעה על הישרדות ותפקוד התאים בתרביות תלת-ממדיות.
- PEG נבחר בשל תכונות ההעברה החיוביות והתאימות הציטית שלו.
- הבנת ההיפוקסיה חיונית לטיפולים הממוקדים בחסרים הורמונליים.
- פעילות גורם ההיפוקסיה הניתנת להשריה מתואמת עם הפרשת האינסולין מתאי בטא.
מטרת המחקר
- כדי לפקח על תגובות התאים להיפוקסיה בצבירים הכלואים ב-PEG.
- כדי להמחיש את פעילות גורם ההיפוקסיה הניתנת להשריה בתוך צבירים של תאים חיים.
- כדי לחקור את ההשלכות למסירת טיפולים מבוססי תאים.
שיטות ששימשו
- זיהום של תאים מפוזרים עם נגיף מסומן פלואורסצנטי.
- גידול תאים ליצירת צבירים על שייקר.
- פונקציונליזציה וטיהור של PEG ליניארי.
- כליאה של צבירים של תאים בהידרוג'ל PEG DM.
תוצאות עיקריות
- כליאה מוצלחת של תאים בתוך ההידרוג'ל.
- מעקב פלואורסצנטי אחר אות מסמן ההיפוקסיה בתנאי חמצן משתנים.
- המחשה של פעילות גורם ההיפוקסיה הניתנת להשריה ברמת התא.
- תובנות לגבי ההשפעה של ההיפוקסיה על הישרדות ותפקוד התאים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי חשוב לחקר ההיפוקסיה בתרביות תלת-ממדיות.
- יש לה יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית וטיפול בסוכרת.
- מחקר נוסף יכול לשפר את ההבנה של טיפולים מבוססי תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Monitoring hypoxic signaling in encapsulated cell aggregates addresses a critical challenge in cell-based therapies: ensuring functional viability of transplanted tissues under diffusion-limited conditions. This method enables early detection of oxygen deprivation impacts on insulin-producing cells, supporting predictive confidence in therapeutic efficacy. By correlating HIF-1α activity with functional readouts, it aids in de-risking encapsulation strategies for diabetes and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking hypoxia-inducible factor activation to functional decline in insulin secretion.
- Operational Value: Provides a quantifiable fluorescent readout for pathway clarification in encapsulated beta-cell models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying oxygen thresholds that compromise cell function prior to in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with encapsulated aggregates for reproducible oxygen-gradient screening.
- Quantitative Output: Enables spatial and temporal mapping of hypoxic signaling via fluorescence microscopy.
- Platform Utility: Facilitates assay standardization across oxygen conditions to evaluate encapsulation material performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the avascular microenvironment encountered by encapsulated pancreatic islets in type 1 diabetes therapy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase hypoxia assessment to preclinical validation of graft survival and function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs material selection and geometric design to mitigate hypoxia-induced functional loss in therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypoxia assessment after aggregate formation and prior to functional screening, supporting lead identification of encapsulation formulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen-dependent pathways in encapsulated beta-cell aggregates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hydrogels for evaluating compound or material effects under controlled hypoxia.
- Analytics: Provides HIF-1α-driven fluorescence as a quantitative biomarker for comparing oxygen conditions and encapsulation efficacy.
- Translational Research: Connects in vitro hypoxia signaling to preclinical outcomes by correlating marker activity with insulin secretion data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for evaluating encapsulation materials across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in hypoxia-mediated functional decline.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined encapsulation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying hypoxia-related risks early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of encapsulation strategies based on functional preservation under low oxygen.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and hydrogel fabrication.
- Depends on UV crosslinking infrastructure and fluorescent microscopy capabilities.
- Necessitates standardization of oxygen-controlled culture systems for cross-team comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the hypoxia reporter to primary or stem cell-derived aggregates.
- Practical limitations include signal resolution constraints for subcellular localization and dependency on viral transduction efficiency.
