מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מערכת ניסויית זו נועדה לאפיין את תרומתן של חלבונים ספציפיים לתהליך הפלישה. התחל בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית של תאים עם החלבון הפלואורסצנטי הרלוונטי. כמו כן, הכן את המטריצה התלת-ממדית של חלבון matrigel במבטאי transwell, והכן תרחיף תאים בדילול המתאים.

באמצעות מערכת ה-Matrigel transwell, מדדו את תגובת התעתוק למשיך הכימי (chemo attractant) עם התרופות או הטיפולים הנבדקים, ולאחר מכן עברו להדמיה ולניתוח של פלישת התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לקבוע את העוצמה ואת אופן פלישת התאים למטריצה חלבונית תלת-ממדית. יתרונה של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת פלישת Transwell המסורתית, הוא יכולתה לספק נתונים כמותיים ואיכותיים כאחד על פלישת תאים למטריצה חלבונית תלת-ממדית.

עמיתתי, Diane Creighton, תדגים כעת את השיטה: זרעו תאי אריזה רטרו-ויראליים ב-DMEM המכיל 10% FBS למשך 48 שעות. בצעו טרנספקציה לתאים באמצעות DNA רטרו-ויראלי לפי הוראות היצרן. דגרו למשך 24 שעות, שטפו את הבארים פעמיים עם מצע, לאחר מכן הוסיפו 1.5 milliliters של 10% F-P-S-D-M-E-M לכל באר, ודגרו למשך 48 שעות כדי לאסוף את הרטרו-וירוס הארוז.

העבירו את מדיום תרבית הרקמה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר, צנטריגו כדי לשקע תאים וסננו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. אחסנו מלאי רטרו-וירוס זה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כעת, לצורך טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של תאים, הסירו את המדיום מתרבית של לילה ואוסיפו מיליליטר אחד של מלאי רטרו-וירוס בתוספת poly green.

לאחר דגירה של שש שעות, הוסיפו שתי מיליליטר של 10%F-B-S-D-M-E-M לבאר והניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. במהלך הלילה, חדשו את המצע, ולאחר 24 שעות, הוסיפו מצע סלקטיבי מתאים; כאשר התאים מגיעים למצב של confluent, קצרו אותם ובצעו מיון פלורסצנטי תוך שימוש בתאים שאינם transduced כביקורת. אספו תאים עם פלורסצנטיות הגבוהה מזו של תאים שאינם transduced והקפיאו מנות (aliquots) בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לשימוש עתידי.

שיטה זו נשענת על ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה, ומאפשרת לקבוע את תרומתם של תאים בודדים. הפשר את ה-matrigel על קרח ולאחר מכן דלל אותו ביחס של אחד לאחד ב-PBS קר. כעת הכנס את ה-transwells ללא הציפוי לתוך פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות.

לאחר מכן, העבירו בזהירות בעזרת פפטה 100 µL של Matrigel מדולל לתוך הבארות והמתינו להתמצקות בטמפרטורה של 37 °C. במקביל, הכינו את תרחיפי התאים המסומנים פלואורסצנטית במצע גידול רגיל. כאשר ה-Matrigel התמצק, הפכו את ה-transwells והעבירו בפפטה 100 µL של תרחיף התאים אל הצד התחתון של המסנן הפונה כלפי חוץ.

כסו בזהירות את ה-transwells בעזרת בסיסו של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות, כך שייווצר מגע עם כל טיפה של תרחיף התאים. דגרו את הפלטה במצב הפוך למשך ארבע שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים. כעת הפכו את הפלטות למצב זקוף ושטפו כל transwell על ידי טבילה פעמיים ב-1 mL של מצע נטול סרום.

לאחר מכן, מקמי את ה-transwell בבאר שלישית המכילה תרופות או ריאגנטים לטיפול. העבירי בעדינות בעזרת פיפטה 100 µL של מצע הכולל חומר פיתיון כימי (chemo attractant) אל תוך ה-transwell, מעל תערובת ה-matrigel PBS שהתמצקה. דגרי במשך שלושה עד חמישה ימים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide כדי לדמות תאים שאינם פלואורסצנטיים הפולשים לתוך ה-Matrigel.

הניחו את ה-transwells בתוך צלחות 24 בארות חדשות והעבירו בפיפט 1 mL של תמיסת calcium AM בריכוז 4 µM על גבי כל פלאג (plug) של matri gel, כך שהתמיסה תגלוש לצדדים ותצבע מהחלק העליון והתחתון. הדגרירו למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית עם 5% CO2. לאחר מכן, בצעו דימוג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

שיטת צביעת סגנון החיים הראשונה זו מאפשרת ויזואליזציה של מצבי פלישה. העבירו כל transwell ללוח 24 בארות חדש, הוסיפו 1 mL של 4% paraformaldehyde ו-0.2% triton X 100, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה. לאחר שטיפה של שלוש פעמים עם 1 mL PBS, הוסיפו RNase A בריכוז 0.01 mg/mL למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS לצורך ויזואליזציה.

יש לדלל Propidium iodide ב-PBS ולהשאיר בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS. בשלב זה, ניתן לשמור את ה-transwells הצבועים ב-propidium iodide בטמפרטורת החדר בחושך למשך חודש אחד לפחות.

שיטת צביעת התאים השנייה דורשת קיבוע, אך מאפשרת כימות מהיר יותר של הפלישה. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך, הניחו את ה-transwell עם כמות קטנה של PBS שיורי על כיסוי זכוכית גדול, תחת עדשה אובייקטיבית של 20x שאינה מסוג טבילה, ודגמו חתכים אופטיים בכל 10 עד 15 מיקרונים מהבסיס של פלאג ה-matrigel. כמתו את היקף הפלישה באמצעות הפרוסות האופטיות הבודדות. כמו כן, בנו אובייקטים תלת-ממדיים באמצעות תוכנה מתאימה כגון velocity. בסדרה זו של חתכים אופטיים, התאים נצבעו ב-calcium am.

כפי שניתן היה לצפות, מספר התאים הפולשים כלפי מעלה מהמסנן פוחת ככל שהמרחק גדל. ניתן לכמת פלישה זו. שחזורים תלת-ממדיים של פלישת התאים מספקים תיאור חזותי של אופן הפלישה.

אם התאים מסומנים באמצעות ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים, ניתן להמחיש את המיקומים של התאים בכל צבע בשחזורים תלת-ממדיים, כפי שמוצג במבט צידי זה. בנוסף, חיתוכים דרך השחזור יכולים לספק תובנות לגבי מנגנונים מולקולריים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד להשתמש בבדיקת פלישת תאים זו כדי להשיג מידע רב יותר על תהליך הפלישה מכזה שניתן להשיג בשיטות סטנדרטיות.