Name: מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: חקור התנהגות פלישה של תאי גידול במטריצה תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מספקת נתונים כמותיים ואיכותיים על פלישת תאים ומאפשרת הבנה מעמיקה של מנגנוני התקדמות הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון למחקר זה הוא מן לחקר הסרטן בבריטניה.

1. תיוג retroviral של תאים עם חלבוני ניאון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Retroviral פלייט אריזה תאים (למשל פיניקס) לעבר 0.25 x 10 6 תאים לכל טוב של 6-היטב המנה ב 10% בסרום שור עוברית (FBS) / DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עם DNA Transfect retroviral 48 שעות לאחר מכן התאים באמצעות Effectene בהתאם להוראות היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבארות פעמיים עם 24 שעות בינוני מאוחר יותר, ולאחר מכן להוסיף 1.5 מ"ל של 10% FBS / DMEM לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף וירוס ארוזים בתרבית רקמה בינוני 48 שעות מאוחר יותר על ידי pipetting והעברת ל 2 צינורות microcentrifuge מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 1600 במשך 5 דקות עד גלולה כל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant לצינור נקי חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים להיות retrovirally transduced הם מצופה החוצה 1.5 x 10 5 תאים לכל גם מנה 6 היטב להציב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את מדיה של תאים המודעהד 1 מ"ל של המניה וירוס בתוספת polybrene 4 μl (2 מ"ג / מ"ל) היטב כל אחד. החלפת צלחות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 5-6 שעות, להוסיף 2 מ"ל 10% FBS / DMEM זה היטב צלחות מוחלפים ב 37 ° C inbubator לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את התקשורת ולאפשר תאים 24 שעות לפני הוספת מדיה סלקטיבית המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות (אשר תלויה בשיעור הצמיחה של תאים, ואת היעילות של התמרה retroviral, אבל בדרך כלל לוקח 4-14 ימים), trypsinize תאים ולמיין עבור תאים באמצעות הקרינה הלא transduced כנקודת התייחסות, לאסוף תאים עם בריכה הקרינה יותר מאשר אי - transduced תאים aliquots להקפיא ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li></ol> 2. Assay הופכי Matrigel הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אט אט להפשיר aliquot של Matrigel מלא (כלומר מכיל גורמי גדילה) על הקרח (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהופשרו, לדלל Matrigel 01:01 בקרח קר PBS (יחד עם כל תוספת אחרתטיפול בריכוז 2x ב PBS לפני דילול; איור 1B). כדי להקל לטפל Matrigel לפני פילמור, כל plasticware (טיפים למשל, צינורות וכו ') צריכים להיות קרים כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס כמו נקבוביות רבות 8 מיקרון 6.5 מ"מ בקוטר ציפוי Transwells כנדרש לתוך הבארות של צלחת 24 רקמות היטב בתרבות, אז בזהירות פיפטה 100 μl של Matrigel מדולל לתוך בארות לעזוב כדי לדגור על ~ 30 דקות בשעה 37 ° C כדי לחזק (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את אחד או יותר fluorescently שכותרתו השעיות התא בין 1-4 x 10 5 תאים לכל מ"ל, בהתאם לקו התא, ממצב טרום טיפול אחד (ה g., SiRNA טיפול תרופתי) בצמיחה הרגיל שלהם בינוני (איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר Matrigel יש הקרושה, להפוך את Transwells ו פיפטה 100 μl של השעיה על התא התחתון כלפי מעלה מול של המסנן (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את Transwells עם הבסיס של רקמת 24 בארצלחת תרבות, ליצור קשר עם כל טיפה של השעיה תא (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת במצב הפוך למשך 4 שעות כדי לאפשר התקשרות התא (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, לפנות את הצלחות בצד ימין למעלה ולשטוף כל Transwell ידי רציפים טובל בינוני 2 x 1 מ"ל סרום חופשי (איור 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את Transwells ב 1 / 3 המכיל גם תרופות או טיפולים נדרשים (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 100 μl של 10% FBS / DMEM פלוס chemoattractant (ה g. EGF במהירות של 25 ng / ml) לתוך Transwell על גבי Matrigel הקרושה / תערובת PBS, להחליף את המכסה דגירה של 3-5 ימים לכל 37 ° C עם 5% CO 2 (איור 2 ג). </li></ol> 3. מכתים ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים להביע את חלבוני ניאון ניתן לדלג על השלבים הבאים לפני מיקרוסקופיה confocal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לא פלורסנט תאים תמונה הפולשים, Matrigel Transwells מקום 24 מנות טריות היטב פיפטה 1 מ"ל של 4 מיקרומטרCalcein AM פתרון כתם על גבי תקע כל Matrigel, שמאפשר לו לשפוך על הכתם מן הצדדים העליון והתחתון. Calcein AM (אסתר acetoxymethyl של calcein) הוא צבע תא חי כי כתמי התאים כולו ירוק לא דורש קיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 שעה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2 האווירה humidified, שבו תאים נקודת מוכתמים לגמרי ומוכן להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחילופין, אי - ניאון התאים הפולשים Matrigel עשויים להיות קבועים ומוכתמת כמתואר להלן ב 3.5-3.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל Transwell לצלחת 24 גם טרי. כיסוי 1 מ"ל של 4% para-formaldehyde/0.2% טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר RNA cytoplasmic עם טיפול 30 דקות באמצעות RNase 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase. לשטוף 2 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה להוסיף 0.01 מ"ג / מ"ל ​​יודיד Propidium (PI) מדולל PBS ולהשאיר בטמפרטורת החדר על דהר.ק. שעה 0.5. לשטוף 3 פעמים עם PBS. בשלב זה, מוכתם לצרכן transwell יכולים להישמר בטמפרטורת החדר בחושך במשך חודש לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות דימות מדויק על ידי מיקרוסקופיה confocal תלויים המשאבים הזמינים. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוכה, Transwell מקום עם כמות קטנה של PBS שיורית על coverslip גדול (להבטיח בועות לא קיימים) על אי - טבילה אובייקטיבי X 20 ו ללכוד קטעי אופטי כל 10-15 מיקרומטר מהחלק התחתון של התקע matrigel. פרוסות אופטי יחיד יכול לשמש כדי לכמת את מידת הפלישה (איור 3A) או לבנות תוך 3 מימדי האובייקטים באמצעות תוכנה מתאימה, כגון Volocity (איור 3B). </li></ol> 4. נציג תוצאות דוגמה סדרה Z-של פרוסות אופטי מוצג איור 3A. במקרה זה, התאים היו מוכתמות Calcein בבוקר את מספר התאים הפולשים מבית המסנן ניתן לראות ירידה עם המרחק. כימות בvasion ניתן לעשות זאת באמצעות ניתוח היחס בין Calcein AM פיקסלים פיקסלים שלילי חיובי במרווח אחד, או באמצעות שיטת קיבוע / מכתים כמפורט לעיל והספירה גרעינים לצרכן חיובית בעמדה זו. אחד היתרונות של Calcein AM מכתים היא 3 מימדי כי שחזורים של הפלישה תא ניתן להרכיב באמצעות תוכנה כגון Volocity, נותן תיאור ויזואלי של מצב של פלישה (איור 3B). אם התאים מסומנים על ידי ביטוי של חלבוני ניאון, אז העמדות של כל תא צבע ניתן דמיינו ב 3 מימדי שחזורים, שנצפו גם מהצד (איור 3 ג) או על ידי ביצוע פרוסות באמצעות שחזור (איור 3D). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים סכמטי של השלבים הכרוכים בהקמת assay הפלישה הפוך. א) Matrigel ECM מופשר על הקרח. ב) Matrigel היא מדוללת 1:01 עם PBS ובו כל טיפולים תרופתיים בריכוז הסופי פעמיים. ג) מוסיף Transwell ממוקמות לתוך צלחות multiwell ו Matrigel pipetted זה לתוך זה. ד) השעיות Cell עשה בריכוז הרצוי. ה) לאחר Matrigel קבע, את הצלחת מתהפכת, מוסר, התאים מצופה על המסנן התחתון של מחדיר Transwell. F) במצב ההפוך, הצלחת multiwall ממוקם היטב מעל מוסיף Transwell, ליצור קשר עם השעיה התא. G) תאים מותר לדבוק המסנן במשך 4 שעות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. המשך בתרשים סכמטי עבור assay הפלישה הפוך. א) לאחר התאים דבק, טובלים כל Transwell לתוך סרום ללא מדיה פעמיים כדי להסיר את התאים רופף. ב) מקום רחצה Transwell לתוך מדיה המכילה גם בתוספת טיפולים הסופי כנדרש. ג) מדיה המכילה chemoattractant (נסיוב למשל 10% שור עוברית) עם טיפולים כנדרש היא שכבתית בזהירות על Matrigel. אף אוזן גרון "&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. תמונות נציג תוצאות assay הפלישה הפוך. א) סעיפים אופטית של תאים מוכתם Calcein AM הפולש Matrigel, נלקחה ב 15 מיקרומטר במרווחים על ידי מיקרוסקופיה confocal. ב) שיקום שיקום 3 מימדי הפלישה תא מתוך ערימה של תמונות confocal-Z סדרה, במבט מהצד. הודפס מתוך התייחסות 10. ג) שחזור תלת ממדי של תאים GFP ו-RFP שכותרתו פלישה Matrigel במבט מהצד. ד) פרוסה אופטי באמצעות שחזור 3 ממדי של תאים GFP ו-RFP שכותרתו. הודפס מתוך התייחסות 10.

<ol><li>Olson, M. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in cancer cell motility.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).</li>
<li>Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+factors+that+sustain+glioma+invasion+and+paracrine+biology+in+the+brain+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hallmarks+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hallmarks of Cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Croft, D. R., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+conversion+between+rounded+and+elongated+modes+of+cancer+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement.</a> Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).</li>
<li>Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).</li>
<li>Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos-transformation+activates+genes+associated+with+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Fos-transformation activates genes associated with invasion.</a> Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).</li>
<li>Scott, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מבחני Matrigel הפלישה מסורתי הוקמו עם תאים להציב על גבי שכבה של חלבון תאי מטריקס עם תנועתיות chemoattractant-Induced לכיוון ועל דרך פילטר בתחתית. הפולשנות היה הבקיע כפונקציה של כמה תאים אפשר לסמוך על החלק התחתון של המסנן. אמנם למעשה יש הבדל קטן עם assay &quot;הפוך&quot; הפלישה שתוארו לעיל, קיים מידע רב יותר על תהליך הפלישה כי ניתן לקבוע על ידי הדמיה תאים פולשים, כאשר הם עוברים דרך מעלה Matrigel. לדוגמה, בנוסף להיות מסוגל לדמיין את התאים שכותרתו שונה לבחון המובילות לעומת בעקבות הפל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> DMEM (Medium השתנה Dulbecco של הנשרים) </td><td> GIBCO </td><td> 21969 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> PAA </td><td> ת 15-101 </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> GIBCO </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;מ L-גלוטמין (100x) </td><td> GIBCO </td><td> 25050-032 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> AL-118 </td></tr><tr><td> Lipofectamine מגיב 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> Transwells 6.5mm, 8.0 מיקרומטר גודל הנקבוביות </td><td> קורנינג </td><td> 3422 </td></tr><tr><td> השלם Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Calcein AM </td><td> Invitrogen </td><td> C1430 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 19101 </td></tr><tr><td> Propidium יודיד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> Confocal microcope </td><td> לייקה </td><td> SP2MP </td></tr></tbody></table>

מידול והדמיה 3-dimensional cell קיבוציים invasion

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

המאפיין המגדיר של ממאירות סרטן הפלישה גרורות 1. בכמה סוגי סרטן (ה g. Glioma 2), פלישה מקומית לתוך הרקמה הבריאה המקיפה אותה היא שורש של מחלות ומוות. עבור סוגי סרטן אחרים (ה g. השד, סרטן ריאות, וכו &#39;.), הוא תהליך של גרורות, שבו תאים סרטניים לנוע ממקום הגידול הראשוני מסה, ליישב אתרי דיסטלי, ובסופו של דבר לתרום כשל איברים, שבסופו של דבר מוביל לתחלואה תמותה 3. ההערכה היא כי הפלישה גרורות אחראים ל -90% ממקרי המוות מסרטן 4. כתוצאה מכך, חלה עניין רב בזיהוי תהליכים מולקולריים המתווכים חלבון קריטית של הפלישה גרורות לצורך אבחון וטיפול בשיפור 5. האתגר העומד בפני החוקרים הוא לפתח סרטן מבחני הפלישה כי די דומה למצב in vivoכדי לאפשר דוגמנות מחלה מדויק 6. דו מימדי תנועתיות מבחני סלולריים הם רק אינפורמטיבי על היבט אחד של הפלישה אינם מביאים בחשבון שיפוץ תאי חלבון מטריקס (ECM) אשר גם הוא אלמנט קריטי. לאחרונה, מחקרים מעודן ההבנה שלנו של הפלישה תא הגידול גילה כי תאים בודדים יכול לנוע על ידי מצבי מוארך או מעוגל 7. בנוסף, חלה הערכה גדולה יותר של התרומה של הפלישה קיבוצי, שבו תאים לפלוש בקווצות, סדינים אשכולות, בעיקר גידולים מובחנים מאוד כי לשמור על המאפיינים אפיתל, להתפשטות סרטן 8. אנו מציגים שיטה מעודן 9 לבחינת תרומתם של חלבונים מועמד לפלישה קולקטיבית 10. בפרט, על ידי הנדסה בריכות נפרדות של תאים לבטא את חלבוני ניאון שונים, אפשר מולקולרי לנתח את הפעילויות proteins הנדרשים בתאים המובילים לעומת אלו הנדרשים בתאים הבאים. השימוש RNAi מספק את הכלי מולקולרית בניסוי לפרק את התהליכים הכרוכים הפלישה תא יחיד, כמו גם עמדות שונות של חדירה קולקטיבית. בהליך זה, תערובות של תאים fluorescently שכותרתו הם מצופה בתחתית להוסיף Transwell מילא בעבר עם חלבון ECM Matrigel, אז מותר לפלוש &quot;כלפי מעלה&quot; דרך המסנן לתוך Matrigel. שחזור של סדרת Z-ערימות התמונה, מתקבל על ידי הדמיה confocal, תוך ייצוג תלת מימדי המאפשר הדמיה של קולקטיבי גדילי הפולש וניתוח של ייצוג של תאים fluorescently שכותרתו מובילים לעומת העמדות הבאות.

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר את<em&gt; In vivo</em&gt; המצב מאשר דו מימדי מבחני תנועתיות. באמצעות פלישה מטריצה ​​מבחני בשילוב עם הדמיה confocal של תאים fluorescently שכותרתו, מידע מפורט על דרכי הפלישה התרומות נפרדות של מוביל לעומת התאים הבאים ניתן להשיג.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מאפיין מכריע של זליגות סרטנית הוא פלישה וגרורות 1. בסוגים מסוימים של סרטן (למשל, גליומה 2), פלישה מקומית לרקמות בריאות סביבות...

מערכת ניסויית זו נועדה לאפיין את תרומתם של חלבונים ספציפיים לתהליך הפלישה. התחילו בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית של תאים עם החלבון הפלואורסצנטי הרלוונטי. כמו כן, צרו מטריצה תלת-ממדית של חלבון matrigel במסנני transwell, והכינו תרחיף תאים בדילול המתאים.בעזרת מערכת ה-Matrigel transwell, מדדו את תגובת המעבר (transmigration) למשיכה כימית בנוכחות תרופות או טיפולים נבדקים, ולאחר מכן עברו לוויזואליזציה וניתוח של פלישת התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לקבוע את העוצמה ואת אופן פלישת התאים אל תוך מטריצת חלבון תלת-ממדית. יתרונה של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת פלישת Transwell המסורתית, הוא יכולתה לספק נתונים כמותיים ואיכותיים כאחד על פלישת תאים לתוך מטריצת חלבון תלת-ממדית.עמיתתי למחקר, Diane Creighton, תדגים כעת את השיטה: יש לגדל תאי אריזה רטרו-ויראליים ב-DMEM המכיל 10%FBS למשך 48 שעות. בצע טרנספקציה לתאים באמצעות DNA רטרו-ויראלי בהתאם להוראות היצרן. הדגר למשך 24 שעות, שטוף את הבארים פעמיים עם מצע גידול, לאחר מכן הוסף 1.5 milliliters של 10%F-P-S-D-M-E-M לכל באר, והדגר למשך 48 שעות כדי לאסוף את ה-Retrovirus הארוז.העבירו את מצע תרבית הרקמה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר, צנטריפוגו כדי לשקע את התאים ואספו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. אחסנו מלאי רטרו-וירוס זה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כעת, כדי לבצע טרנסדוקציה רטרו-וירוסית לתאים, הסירו את המצע מתרבית שגדלה בן לילה והוסיפו מיליליטר אחד של מלאי רטרו-וירוס בתוספת poly green.לאחר דגירה של שש שעות, הוסיפו שתי מיליליטר של 10%F-B-S-D-M-E-M לבאר והניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. במהלך הלילה, חדשו את המצע, ולאחר 24 שעות, הוסיפו מצע סלקטיבי מתאים. כאשר התאים יגיעו למצב של התלכדות (confluent), קצרו את התאים ומיינו אותם לפי פלואורסצנציה, תוך שימוש בתאים שאינם טרנסדוקים כביקורת. אספו תאים עם פלואורסצנציה הגבוהה מזו של התאים שאינם טרנסדוקים והקפיאו מנות (aliquots) בטמפרטורה של 80- °C לשימוש עתידי.שיטה זו מתבססת על ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה, ומאפשרת לקבוע את התרומה של תאים בודדים. הפסק את הפשרת ה-Matrigel על קרח, ולאחר מכן דלל אותו ביחס של 1:1 ב-PBS קר מאוד. כעת, הכנס את ה-transwells שאינם מצופים לתוך פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות.לאחר מכן, העבירו בזהירות באמצעות פיפטה 100 µL של Matrigel מדולל לתוך הבארים והקשיחו בטמפרטורה של 37 °C. במקביל, הכינו את תרחיפי התאים המסומנים פלואורסצנטית במצע growth medium רגיל. לאחר שה-Matrigel התקשח, הפכו את ה-transwells והעבירו בפיפטה 100 µL של תרחף התאים אל הצד התחתון של המסנן הפונה כלפי חוץ.כסו בזהירות את ה-transwells בעזרת הבסיס של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות, כך שיהיה מגע עם כל טיפה של תמיחת התאים. דגרו את הפלטה במצב הפוך למשך ארבע שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים. כעת הפכו את הפלטות חזרה למצבם הרגיל ושטפו כל transwell על ידי טבילה פעמיים במיליליטר אחד של מצע ללא סרום.לאחר מכן, מקם את ה-transwell בבאר שלישית המכילה תרופות או ריאגנטים לטיפול. טפטף בעדינות באמצעות פיפטה 100 µL של מצע המכיל חומר מושך כימי (chemo attractant) אל תוך ה-transwell, מעל תערובת ה-matrigel PBS שהתגבשה. דגרי למשך שלושה עד חמישה ימים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide כדי לדמות תאים שאינם פלואורסצנטיים הפולשים ל-Matrigel.הניחו את ה-transwells בתוך צלחות 24 בארות חדשות והעבירו בפיפטה 1 mL של תמיסת calcium AM בריכוז 4 µM על גבי כל פלג Matrigel, ובכן אפשרו לנוזל להישפך מהצדדים כדי שיצבע מלמעלה ומלמטה. הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית עם 5% CO2. לאחר מכן, בצעו דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.שיטת צביעת סגנון חיים ראשונה זו מאפשרת ויזואליזציה של דרכי פלישה. העבירו כל transwell ללוח 24 באריות חדש, כסו ב-1 mL של 4% paraform aldehyde ו-0.2% triton X 100, והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה. לאחר שטיפה של שלוש פעמים עם 1 mL של PBS, הוסיפו RNAs A למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS לצורך ויזואליזציה בריכוז של 0.01 mg/mL.דללו Propidium iodide ב-PBS והשאירו בטמפרטורת החדר בחשכה למשך 30 דקות. שטפו שלוש פעמים עם PBS. בשלב זה, ניתן לשמור את ה-transwells הצבועים ב-propidium iodide בטמפרטורת החדר בחשכה למשך חודש אחד לפחות.שיטת סמיגת התאים השנייה דורשת קיבוע, אך מאפשרת כימות מהיר יותר של הפלישה. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך, מקמי את ה-transwell עם כמות קטנה של PBS שנותרה על כיסוי זכוכית גדול, מעל עדשה ללא טבילה בעוצמה של 20x, ובצע דגימה של חתכים אופטיים בכל 10 עד 15 מיקרון מהחלק התחתון של פלאג ה-matrigel. כמת את היקף הפלישה באמצעות החתכים האופטיים הבודדים. כמו כן, בנה אובייקטים תלת-ממדיים באמצעות תוכנה מתאימה כגון velocity מתוך סדרת החתכים האופטיים האמורה; התאים נסמגו באמצעות calcium am.כצפוי, מספר התאים הפולשים כלפי מעלה מהמסנן פוחת ככל שהמרחק גדל. ניתן לכמת פלישה זו. שחזורים תלת-ממדיים של פלישת התאים מספקים תיאור ויזואלי של אופן הפלישה.אם תאים סומנו על ידי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים, ניתן להמחיש את המיקומים של תאים בכל צבע בשחזורים תלת-ממדיים, כפי שמוצג במבט צד זה. בנוסף, חתכים דרך השחזור יכולים לספק תובנות לגבי מנגנונים מולקולריים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהBאופן השימוש בבדיקת פלישת תאים זו כדי להשיג מידע רב יותר על תהליך הבריחה מכזה שניתן להשיג בשיטות הסטנדרטיות.

modeling-and-imaging-3-dimensional-collective-cell-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

חקור התנהגות פלישה של תאי גידול במטריצה תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מספקת נתונים כמותיים ואיכותיים על פלישת תאים ומאפשרת הבנה מעמיקה של מנגנוני התקדמות הגידול.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

גלה סרטונים נוספים