Name: שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: חקור הבדלי ביטוי חלבונים מגדריים בשרירי השלד באמצעות אלקטרופורזה בשני ממדים וספקטרומטריית מסה. השיטה מאפשרת זיהוי של כ-800 חלבונים מדגימות של 10 מ"ג רקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים Yutian גן לשימוש באיור 3. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע 0420971; המכללה סמית Blakeslee, Wilens וקרנות הולמס; לבין הווארד יוז רפואי במכון.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Cell.</a> Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).</li>
<li>Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repeated+bout+effect+and+heat+shock+proteins%3A+intra-muscular+HSP27+and+HSP70+expression+following+two+bouts+of+eccentric+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans.</a> Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).</li>
<li>McHugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+repeated+bout+effect%3A+the+protective+effect+against+muscle+damage+from+a+single+bout+of+eccentric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Med.+Sci.+Sports%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise.</a> Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).</li>
<li>Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Dimorphism+in+the+Exercise-Na%C3%AFve+Murine+Skeletal+Muscle+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Molec.+Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome.</a> Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).</li>
<li>Lopez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+in+proteome+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.</a> J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+creatine+kinase+activity+and+body+composition+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum creatine kinase activity and body composition in males and females.</a> Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).</li>
<li>Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+isoenzyme+profiles+after+exercise+in+the+rat%3A+sex-linked+differences+in+leakage+of+CK-MM%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM.</a> Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).</li>
<li>Kendall, B., Eston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+muscle+damage+and+the+potential+protective+role+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen.</a> Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).</li>
<li>Tiidus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+oestrogen+influence+skeletal+muscle+damage%2C+inflammation%2C+and+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair?</a> Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

LC / MS proteomics השיטה המוצגת כאן הוא פרוטוקול אמין ביותר לשחזור לניתוח מהיר של הרמה הראשונה של proteome שרירי השלד. זה מאפשר השוואה אמצעי סביר הספציפיות המינים. שפע חלבונים נמוכה ידרוש חלוקה של המדגם שרירים כדי להסיר כמה שיותר את החלבונים כויץ ככל האפשר, ובכך להגדיל את שפע חלבונים נמוך. חייטות פרופיל proteome יכול להיות מושלם עם רצועות שונות בטווח pH IPG ו חלופי צבע ג&#39;ל אחוז אם תרצה בכך. הכתמים ניאון רגיש עוד קיים, אך אנו ממליצים כי כל מעבדה לקבוע את הליניאריות של כתמים אלה במערכת שלך. לצורך ניתוח קפדני יותר של ביטוי החלבון מערכת DIGE (דו מימדי ב-ג&#39;ל אלקטרופורזה המערכת, GE Healthcare מדעי החיים) יכול לשמש אך זה אינו מוסיף לרמת המורכבות למתודולוגיה. יתר על כן, פרוטוקול המתואר במסמך ניתן להשתמש עם ani ביותרmal הרקמות אשר כבר רצף הגנום, כמו גם רצף דה נובו של חלבון מכל מקור שהוא, כל עוד זה ניתן לפתור על ג&#39;ל דו מימדי, שכן שברי האנזימטית חופפים ניתן להפיק באמצעות אנזימים טוהר גבוהה בנוסף כדי טריפסין. דוגמאות ממקורות רקמות אחרות עשויות לדרוש שינויים המתודולוגיה מיצוי, במיוחד אם מחפשים חלבונים בממברנה ו הידרופובי, לעומת זאת, היו לנו תוצאות טובות באמצעות פרוטוקול זה עם לב, כבד, כליות ורקמות במוח. אחרים שלאחר translational שינויים עשויים להיות מזוהים על ידי שינוי בבסיס הנתונים מסה ספקטרום קריטריון החיפוש. לסיכום, הצגנו פרוטוקול ראשוני מפורט סביר לניתוח פרופיל proteome.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin עמודות </td><td> מתכלים </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> מונוליטי Pepswift עמודה (100um x 5 ס&quot;מ) </td><td> מתכלים </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> קריטריון מראש יצוק 10.5% -14% טריס HCl-SDS polyacrylamide ג&#39;לים </td><td> מתכלים </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip רצועות IPG </td><td> מתכלים </td><td> BioRad </td><td> משתנה ה-pH טווחי </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> מגיב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> אצטון </td><td> מגיב </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> מגיב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td>garose </td><td> מגיב </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> כיסוי פתרון </td></tr><tr><td> אמוניום ביקרבונט </td><td> מגיב </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> מגיב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholytes </td><td> מגיב </td><td> BioRad </td><td></td><td> משתנה ה-pH טווחי </td></tr><tr><td> בחורים </td><td> מגיב </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie כחול R-250 </td><td> מגיב </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> מגיב </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> מגיב </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> גליצין </td><td> מגיב </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> מגיב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> מגיב </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecyl נתרן גופרתי </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> טריס [2-carboexyethyl] phosphine </td><td> מגיב </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין Endoproteinase, TPCK מטופלים, MS כיתה </td><td> מגיב </td><td> לנקב </td><td> 90055 </td><td> שונה </td></tr><tr><td> דשן </td><td> מגיב </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> מים </td><td> מגיב </td><td> Burdick &amp; ג&#39;קסון </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap מרוכז </td><td> Tool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest חותך נקודה </td><td> כלי </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP מקס יון ספקטרומטר מסה מלכודת </td><td> כלי </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ממונע העלי </td><td> כלי </td><td> Kontes קורפ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוליפרופילן בחישה </td><td> כלי </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מוטות </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פושט צורה ולובש צורה תא IEF </td><td> כלי </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> כלי </td><td> ברנסון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> המודד פלוס HPLC מערכת </td><td> כלי </td><td> ThermoFisher מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc הדמיה מערכת </td><td> כלי </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שרירי השלד מין dimorphism מ proteomics

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

התכווצות שרירי השלד הגולמי נקבעת בעיקר על ידי מספר קטן יחסית של חלבונים התכווצות, אך רקמה זו גם וישימה להפליא גורמים סביבתיים כגון 1 היפרטרופיה על ידי תרגילי התנגדות וניוון של חוסר שימוש. זה ובכך מפגין שיפוץ והתאמות ללחצים (חום, איסכמיה, מתכות כבדות וכו &#39;.) 2,3. נזק עלול להיגרם לשרירים על ידי כוח השריר מתארך תוך כדי הפעלת, 4 שנקרא כיווץ אקסצנטרי. חלבונים התכווצות ניתן נפגע מאמצים כאלה צריכים לתקן, מושפל ו / או resynthesized; פונקציות אלה אינם חלק של חלבונים התכווצות, אך שפע של חלבונים הרבה פחות אחרים בתא. כדי לקבוע מה משנה של חלבונים מעורב שיפור של סוג זה של נזק, proteome גלובלי חייב להיות שהוקמו לפני תרגיל 5 ואחר כך המשכתי לאחר התרגיל כדי לקבוע את ההפרשביטוי החלבון ובכך לסמן חלבונים מועמד ההתאמות נזק ותיקון שלה. יתר על כן, רוב המחקרים של שרירי השלד נערכו על הזכר של המין ולכן לא יכול להיות נציג של שריר נשית. במאמר זה אנו מציגים שיטה להפקת חלבונים מהשרירים reproducibly זכר ונקבה, ומפריד אותם על ידי אלקטרופורזה דו מימדי ג&#39;ל ואחריו ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית 6. פרוטוקול זה מספק עבור כתמים (חלבונים המזוהים לאחר מכן), כי להראות מובהקות סטטיסטית (p &lt;0.05) כפולה להגדיל או להקטין, להופיע או להיעלם מן המדינה שליטה. אלה נכרת אז מתעכל עם טריפסין ו מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה מצמידים את ספקטרומטר מסה (LC / MS) לזיהוי חלבון (LC / MS / MS) 5. מתודולוגיה זו (איור 1) ניתן להשתמש ברקמות רבות עם קצת שינוי לא (כבד, מוח, לשמועלא וכו &#39;.).

קבוצת ישר קדימה שיטות לבודד לקבוע את זהותו של החלבונים הנפוץ ביותר בא לידי ביטוי בשרירי השלד. אודות 800 נקודות הם להבחין על ג&#39;ל דו מימדי של השריר 10 מ&quot;ג; זה מאפשר להגדרה של ביטוי המגדר חלבון ספציפי. שיטות אלה ייתן תוצאות המקבילה רוב הרקמות.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

התכווצות גסה בשריר שלד נקבעת בעיקר על ידי מספר קטן יחסית של חלבונים מכווצים, עם זאת, רקמה זו היא גם...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את הספציפיות המגדרית של הבדלים בפרופילי הפרוטאום של שריר שלד. דבר זה מושג תחילה על ידי קיצוץ והומוגניזציה יסודית של רקמות שריר דו-ראשי (biceps brachii) מעכברים זכרים ונקבות, במטרה להפיק את מרבית החלבונים. לאחר מכן, הדגימה מועברת לרצועת ג'ל IEF, והחלבונים מופרדים על בסיס נקודת האיזו-אלקטרית שלהם, ולאחר מכן מבוצע SDS page להפרדה במימד השני לפי גודל. בעקבות צביעה והדמיה של הג'לים, מושווים הפרופילים הפרוטאומיים של דגימות שריר מזכרים ומנקבות, ונקודות בעלות הבדלים משמעותיים בשכיחות בין שני המגדרים נגזרות מהג'ל.לבסוף, החלבונים בתוך רכיבי הג'ל (gel plugs) מעוכלים באמצעות טריפסין. הפפטידים המתקבלים מופקים מהג'ל ועוברים אנליזה של ננו-כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטרומטריית מסות לצורך זיהוי. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות ביטוי דיפרנציאלי של חלבונים בשני תנאים ניסיוניים או יותר, באמצעות electrophoresis דו-ממדי של ג'ל ופרוטאומיקה המבוססת על מספקטרומטריית מסות.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ספציפיות מגדרית של השריר, ניתן להחיל אותה גם על תאים, רקמות, איברים או נוזלים אחרים במצבים פיזיולוגיים משתנים. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Kalina Diva, המנהלת הטכנית של ה-Smith College Center for proteomics. לאחר בידוד, ניקוי וקיצוץ של שריר שלד של עכבר ב-45 µL של תחליל מיצוי (extraction buffer) לכל גרם רקמה (עיין בפרוטוקול הכתוב עבור מתכון זה וכל שאר מתכוני התחלילים), הומוגניзиру את הרקמה שבע פעמים למשך 15 שניות בכל פעם בטמפרטורה של 4 °C באמצעות פסטל ממונע, עם קירור של שתי דקות על קרח בין כל הומוגניזציה.סובב את הדגימות בצנטריפוגה ב-15,800 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שמור את הנוזל העליון (supernatant) ומדוד את נפחו. השלך את המשקע כדי להשקיע את החלבונים בשלושה נפחים של קרח.אצטון בדרגת ריאגנט קר לפי נפח העל-נוזל. ערבבו את המבחנות ב-Vortex למשך 15 שניות, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-15,800 Gs למשך 10 שניות ליצירת משקעים. השליכו את העל-נוזל והשביו את המשקעים ואת באפר המיצוי באמצעות פסטל ממונע ומוטי ערבוב מפוליפרופילן; שקיעו את החלבונים פעם שנייה על ידי הוספת שלושה נפחים נוספים של אצטון.לאחר השעיה של המשקע ובופר המיצוי, קבעו את ריכוז החלבון ו/או אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לביצוע מיקוד איזואלקטרי של החלבונים, הוציאו רצועת IPG מוכנה מהמקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס והמתינו להשגת שיווי משקל בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. ערבבו את הדגימה באמצעות וורטקס והעבירו בפיפט 600 עד 800 מיקרוגרם של חלבון בקו ישר לאורך הקצה האחורי של תעלה במגש רהידרציה של הדגימה, תוך השארת רווח של כסנטימטר אחד בכל קצה.בעזרת פינצטה, קלפו את כיסוי הפלסטיק של רצועת ה-IPG, תוך הקפדה לגעת רק בקצות הרצועה ולהימנע מכל מגע עם הג'ל. שימו לב לקצה המסומן כחיובי של הרצועה ומקמו אותו בצד שמאל של המגש. הניחו את רצועת ה-IPG כאשר צד הג'ל פונה כלפי מטה על גבי הדגימה.הימנעו מלכידת בועות מתחת לרצועה. אפשרו לה להתרחזר במשך שעה אחת. כסו את הרצועה ב-2.5 milliliters של שמן מינרלי.כסו את המגש במכסה והניחו לו לעבור הידרטציה מחדש במהלך הלילה. למחרת, בטמפרטורת החדר, מקמו פתיל נייר בשני קצותיו של תעלת המיקוד במגש והרטיבו כל אחד מהם ב-10 µL של מים מזוקקים (millipore water). הוציאו את פס IPG והחזיקו אותו במצב אנכי למשך כ-10 שניות.כדי לנקז את השמן, ספגו את הגב הפלסטי באמצעות נייר Kim wipe. הניחו את פס ה-IPG כאשר צד הג'ל פונה כלפי מטה והקצה הבסיסי פונה שמאלה. במגש המיקוד, כסו את הפס ב-2.5 milliliters של שמן מינרלי.מקם את המגש בתוך תא ה-IEF מסוג protean ותכנת פרוטוקול בעל שלושה שלבים בטמפרטורת תא ברירת מחדל של 20 °C, זרם מקסימלי של 50 µA לרצועה וללא זמן רהידרציה. עם השלמת התוכנית, העבר את הרצועה כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה למגש שיווי משקל של 11 cm. הוסף 4 mL של תמיפת חיזור (reduction buffer) לתעלה ובצע שיווי משקל לרצועה למשך 10 דקות עם ניעור עדין.הסיר את בופר ההרדוקציה והוסף ארבעה מיליליטר של בופר אלקיליזציה לתעלה, והשג equilibrium של הרצועה תוך써 ניעור למשך 10 דקות נוספות. שטוף את רצועת ה-IPG על ידי טבילה קצרה בבופר הרצה של 1X SDS. לאחר מכן, הנח את הרצועה כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה על לוח הגב של criterion בגודל 11 סנטימטר.הכינו מראש ג'ל פוליאקרילאמיד Tris-H-C-L-S-D-S בריכוז של 10.5% עד 14% והדחילו אותו בעדינות כך שיהיה במגע מלא עם ג'ל ה-SDS. ודאו שאין בועות כלואות בין שני משטחי הג'ל. כסו את פס ה-IPG במיליליטר אחד של תמיסת agarose מותכת והמתינו חמש דקות להתגבשותה.לאחר מכן, טענו 5 µL של סמן חלבון לבאר הבודדת. הריצו את הג'ל בבופר SDS במתח של 200 V בטמפרטורת החדר, או ב-4 °C. כאשר חזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל, הוציאו אותו מהתבנית הפלסטית וצבעו אותו למשך לילה על ידי ניעור עדין ב-Coomassie Brilliant Blue.נער את הג'ל בתמיסת הסרת צבע 1 פעמיים למשך שלוש שעות בכל פעם, ואת תמיסת הסרת צבע 2 למשך הלילה. שמור את הג'ל ב-7% acetic acid לצורך אנליזה. לאחר דימות הג'ל, בצע אנליזה השוואתית של תבניות הכתמים בין הג'לים וגזור את הכתמים הרלוונטיים. הוסף 200 µL של תמיסת הסרת צבע לסדדי הג'ל, בצע וורטקס והדגר את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך써 ניעור.לאחר מכן, הסירו בזהירות את התמיסה, השליכו אותה וחזרו על הפעולה. הוסיפו 30 µL של באפר מחזר (reducing buffer) שהוכן טרי למבחנות המכילות את נתחי הג'ל והד기로 אותן בטמפרטורה של 60 °C למשך 10 דקות. המתינו עד לקירור הדגימות.לאחר מכן, יש להסיר ולהשליך את התמיפה. הוסף 30 µL של Alkylation buffer והדגה את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, לאחר מכן הסר והשלך את ה-alkylation buffer. שטוף את רפידי הג'ל על ידי הוספת 200 µL של תמיסת detaining לכל מבחנה והדגה את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.הסיר והשלך את תמיסת הדה-סטיינינג (detaining solution) וחזור על השטיפה. לאחר מכן, הוסף 50 µL של אצטוניטריל לפלגי הג'ל והדגש אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר להם להתכווץ עד ליובש. לאחר מכן, הסר בזהירות את האצטוניטריל וחזור על הפעולה עבור חלקי הג'ל.הן צריכות להיראות לבנות וקטנות. יש להניח לחתיכות הג'ל להתייבש במרכז (concentrator) במשך 10 דקות. יש להנפח את חתיכות הג'ל על ידי הוספה של 10 µL של תמיסת tripsin פעילה.דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסיפו 25 µL של תמיסת עיכור (digestion buffer) למבחנות. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך לילה עם ניעור, בצעו סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות וסבבו אותן בצנטריפוגה לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה.כדי להפיק פפטידים נוספים, הוסף 10 µL של 0.1% formic acid לפלגים והדגרה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור, ולאחר מכן בצע סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות. אסוף את העלייה וCombine אותה עם העלייה שנשמרה קודם לכן. לאחר מכן ניתן לבצע דסאלטציה לחלבונים ולהכינם למספקטרומטריית מסה המשולבת עם HPLC. שריר שלט skeleton שלא עבר אימון, מזכרים ומנקבות, הופק והופרד למפה דו-ממדית.לאחר הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של השלב הראשון בפרוטאום ההשוואתי של השריר, זוהו כ-800 נקודות חלבון בכל דגימה, כפי שניתן לראות כאן. כאשר משתמשים במפת הפרוטאום של הזכר כקו בסיס, ניכר כי קיימות נקודות רבות ששכיחותן משתנה בפרוטאום של הנקבה; נקודות שהשכיחות שלהן עלתה פי שניים או יותר בנקבות מסומנות במעגל אדום, ואלו ששכיחותן ירדה פי שניים או יותר מסומנות במעגל כחול. זהותן של נקודות החלבון שהשתנו ביותר מפי שניים (עלייה או ירידה) והן בעלות מובהקות סטטיסטית עבור N של חמישה עכברים, נקבעה באמצעות ניתוח רצף חומצות אמינו בשיטת כרומטוגרפיה נוזלית המשולבת עם ספקטרומטריית מסות.בגרף זה, ציר ה-x מייצג עכברים נקבות לפני פעילות גופנית, וציר ה-y מייצג קבוצת נקודת זמן של שעה אפס לאחר סבב בודד של פעילות. התוצאות מראות כי נקבות מציגות ירידה משמעותית במטבוליזם של אנרגיית סוכר, באנזימים, ובאיזופורמות של אנזים creatine kinase, המהווה מערכת אספקת אנרגיה שונה בשרירים. הן בני אדם והן בעלי חיים מראים רמות גבוהות יותר של CK בסרום אצל זכרים במצב מנוחה ואחרי פעילות גופנית, אך רמות CK בסרום אינןו בהכרח נמצאות במתאם עם כמות ה-myofibrillar.דימורפיזם מגדרי זה בשפע התאי של CK בשריר ה-miren biceps brachii הוא ממצא חדש שעשוי להסביר את רמות ה-CK השונות פיזיולוגית בסרום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון quantitative immuno blotting, על מנת לאמת את התוצאות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה של אופן ההכנה וההפרדה של דגימות לצורך פרופיל פרוטאומי דיפרנציאלי.

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

סרטון זה מדגים את הטכניקה של ביופסיית שריר מלעורית של ה-vastus lateralis האנושי באמצעות קונכוטום Weil-Blakesley.

בן אנוש<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; ביופסיה בשרירי השלד שימוש וייל-בלייסלי Conchotome

MyoD הוא גורם שעתוק מיוגני בעל יכולת חזקה לגרום לטרנסדיפרנציאציה מיוגנית של קווי תאים רבים שאינם שריר מובחנים לחלוטין. המנגנונים האפיגנטיים המעורבים בטרנסדיפרנציאציה זו אינם ידועים ברובם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור זיקה כפולה ואחריה ספקטרומטריית מסה כדי לאפיין באופן ממצה שותפי MyoD.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה משתמש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת כדי לאפשר כימות חסכוני של מסה רזה, כולל שרירי השלד ורקמת הקרביים, רקמת השומן ורקמת השלד בבעלי חיים קטנים. הוא מבחין בין רקמה רזה לרקמת שומן, מה שמציע יתרונות משמעותיים למחקר ביו-רפואי, במיוחד במחקר תרגומי בבעלי חיים קטנים.

כימות שרירי שלד לא פולשני בבעלי חיים קטנים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

חקור הבדלי ביטוי חלבונים מגדריים בשרירי השלד באמצעות אלקטרופורזה בשני ממדים וספקטרומטריית מסה. השיטה מאפשרת זיהוי של כ-800 חלבונים מדגימות של 10 מ"ג רקמה.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

גלה סרטונים נוספים