שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את הספציפיות המגדרית של הבדלים בפרופילי הפרוטאום של שריר שלד. דבר זה מושג תחילה על ידי קיצוץ והומוגניזציה יסודית של רקמות שריר דו-ראשי (biceps brachii) מעכברים זכרים ונקבות, במטרה להפיק את מרבית החלבונים. לאחר מכן, הדגימה מועברת לרצועת ג'ל IEF, והחלבונים מופרדים על בסיס נקודת האיזו-אלקטרית שלהם, ולאחר מכן מבוצע SDS page להפרדה במימד השני לפי גודל. בעקבות צביעה והדמיה של הג'לים, מושווים הפרופילים הפרוטאומיים של דגימות שריר מזכרים ומנקבות, ונקודות בעלות הבדלים משמעותיים בשכיחות בין שני המגדרים נגזרות מהג'ל.

לבסוף, החלבונים בתוך רכיבי הג'ל (gel plugs) מעוכלים באמצעות טריפסין. הפפטידים המתקבלים מופקים מהג'ל ועוברים אנליזה של ננו-כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטרומטריית מסות לצורך זיהוי. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות ביטוי דיפרנציאלי של חלבונים בשני תנאים ניסיוניים או יותר, באמצעות electrophoresis דו-ממדי של ג'ל ופרוטאומיקה המבוססת על מספקטרומטריית מסות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ספציפיות מגדרית של השריר, ניתן להחיל אותה גם על תאים, רקמות, איברים או נוזלים אחרים במצבים פיזיולוגיים משתנים. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Kalina Diva, המנהלת הטכנית של ה-Smith College Center for proteomics. לאחר בידוד, ניקוי וקיצוץ של שריר שלד של עכבר ב-45 µL של תחליל מיצוי (extraction buffer) לכל גרם רקמה (עיין בפרוטוקול הכתוב עבור מתכון זה וכל שאר מתכוני התחלילים), הומוגניзиру את הרקמה שבע פעמים למשך 15 שניות בכל פעם בטמפרטורה של 4 °C באמצעות פסטל ממונע, עם קירור של שתי דקות על קרח בין כל הומוגניזציה.

סובב את הדגימות בצנטריפוגה ב-15,800 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שמור את הנוזל העליון (supernatant) ומדוד את נפחו. השלך את המשקע כדי להשקיע את החלבונים בשלושה נפחים של קרח.

אצטון בדרגת ריאגנט קר לפי נפח העל-נוזל. ערבבו את המבחנות ב-Vortex למשך 15 שניות, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-15,800 Gs למשך 10 שניות ליצירת משקעים. השליכו את העל-נוזל והשביו את המשקעים ואת באפר המיצוי באמצעות פסטל ממונע ומוטי ערבוב מפוליפרופילן; שקיעו את החלבונים פעם שנייה על ידי הוספת שלושה נפחים נוספים של אצטון.

לאחר השעיה של המשקע ובופר המיצוי, קבעו את ריכוז החלבון ו/או אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לביצוע מיקוד איזואלקטרי של החלבונים, הוציאו רצועת IPG מוכנה מהמקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס והמתינו להשגת שיווי משקל בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. ערבבו את הדגימה באמצעות וורטקס והעבירו בפיפט 600 עד 800 מיקרוגרם של חלבון בקו ישר לאורך הקצה האחורי של תעלה במגש רהידרציה של הדגימה, תוך השארת רווח של כסנטימטר אחד בכל קצה.

בעזרת פינצטה, קלפו את כיסוי הפלסטיק של רצועת ה-IPG, תוך הקפדה לגעת רק בקצות הרצועה ולהימנע מכל מגע עם הג'ל. שימו לב לקצה המסומן כחיובי של הרצועה ומקמו אותו בצד שמאל של המגש. הניחו את רצועת ה-IPG כאשר צד הג'ל פונה כלפי מטה על גבי הדגימה.

הימנעו מלכידת בועות מתחת לרצועה. אפשרו לה להתרחזר במשך שעה אחת. כסו את הרצועה ב-2.5 milliliters של שמן מינרלי.

כסו את המגש במכסה והניחו לו לעבור הידרטציה מחדש במהלך הלילה. למחרת, בטמפרטורת החדר, מקמו פתיל נייר בשני קצותיו של תעלת המיקוד במגש והרטיבו כל אחד מהם ב-10 µL של מים מזוקקים (millipore water). הוציאו את פס IPG והחזיקו אותו במצב אנכי למשך כ-10 שניות.

כדי לנקז את השמן, ספגו את הגב הפלסטי באמצעות נייר Kim wipe. הניחו את פס ה-IPG כאשר צד הג'ל פונה כלפי מטה והקצה הבסיסי פונה שמאלה. במגש המיקוד, כסו את הפס ב-2.5 milliliters של שמן מינרלי.

מקם את המגש בתוך תא ה-IEF מסוג protean ותכנת פרוטוקול בעל שלושה שלבים בטמפרטורת תא ברירת מחדל של 20 °C, זרם מקסימלי של 50 µA לרצועה וללא זמן רהידרציה. עם השלמת התוכנית, העבר את הרצועה כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה למגש שיווי משקל של 11 cm. הוסף 4 mL של תמיפת חיזור (reduction buffer) לתעלה ובצע שיווי משקל לרצועה למשך 10 דקות עם ניעור עדין.

הסיר את בופר ההרדוקציה והוסף ארבעה מיליליטר של בופר אלקיליזציה לתעלה, והשג equilibrium של הרצועה תוך써 ניעור למשך 10 דקות נוספות. שטוף את רצועת ה-IPG על ידי טבילה קצרה בבופר הרצה של 1X SDS. לאחר מכן, הנח את הרצועה כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה על לוח הגב של criterion בגודל 11 סנטימטר.

הכינו מראש ג'ל פוליאקרילאמיד Tris-H-C-L-S-D-S בריכוז של 10.5% עד 14% והדחילו אותו בעדינות כך שיהיה במגע מלא עם ג'ל ה-SDS. ודאו שאין בועות כלואות בין שני משטחי הג'ל. כסו את פס ה-IPG במיליליטר אחד של תמיסת agarose מותכת והמתינו חמש דקות להתגבשותה.

לאחר מכן, טענו 5 µL של סמן חלבון לבאר הבודדת. הריצו את הג'ל בבופר SDS במתח של 200 V בטמפרטורת החדר, או ב-4 °C. כאשר חזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל, הוציאו אותו מהתבנית הפלסטית וצבעו אותו למשך לילה על ידי ניעור עדין ב-Coomassie Brilliant Blue.

נער את הג'ל בתמיסת הסרת צבע 1 פעמיים למשך שלוש שעות בכל פעם, ואת תמיסת הסרת צבע 2 למשך הלילה. שמור את הג'ל ב-7% acetic acid לצורך אנליזה. לאחר דימות הג'ל, בצע אנליזה השוואתית של תבניות הכתמים בין הג'לים וגזור את הכתמים הרלוונטיים. הוסף 200 µL של תמיסת הסרת צבע לסדדי הג'ל, בצע וורטקס והדגר את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך써 ניעור.

לאחר מכן, הסירו בזהירות את התמיסה, השליכו אותה וחזרו על הפעולה. הוסיפו 30 µL של באפר מחזר (reducing buffer) שהוכן טרי למבחנות המכילות את נתחי הג'ל והד기로 אותן בטמפרטורה של 60 °C למשך 10 דקות. המתינו עד לקירור הדגימות.

לאחר מכן, יש להסיר ולהשליך את התמיפה. הוסף 30 µL של Alkylation buffer והדגה את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, לאחר מכן הסר והשלך את ה-alkylation buffer. שטוף את רפידי הג'ל על ידי הוספת 200 µL של תמיסת detaining לכל מבחנה והדגה את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.

הסיר והשלך את תמיסת הדה-סטיינינג (detaining solution) וחזור על השטיפה. לאחר מכן, הוסף 50 µL של אצטוניטריל לפלגי הג'ל והדגש אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר להם להתכווץ עד ליובש. לאחר מכן, הסר בזהירות את האצטוניטריל וחזור על הפעולה עבור חלקי הג'ל.

הן צריכות להיראות לבנות וקטנות. יש להניח לחתיכות הג'ל להתייבש במרכז (concentrator) במשך 10 דקות. יש להנפח את חתיכות הג'ל על ידי הוספה של 10 µL של תמיסת tripsin פעילה.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסיפו 25 µL של תמיסת עיכור (digestion buffer) למבחנות. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך לילה עם ניעור, בצעו סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות וסבבו אותן בצנטריפוגה לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה.

כדי להפיק פפטידים נוספים, הוסף 10 µL של 0.1% formic acid לפלגים והדגרה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור, ולאחר מכן בצע סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות. אסוף את העלייה וCombine אותה עם העלייה שנשמרה קודם לכן. לאחר מכן ניתן לבצע דסאלטציה לחלבונים ולהכינם למספקטרומטריית מסה המשולבת עם HPLC. שריר שלט skeleton שלא עבר אימון, מזכרים ומנקבות, הופק והופרד למפה דו-ממדית.

לאחר הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של השלב הראשון בפרוטאום ההשוואתי של השריר, זוהו כ-800 נקודות חלבון בכל דגימה, כפי שניתן לראות כאן. כאשר משתמשים במפת הפרוטאום של הזכר כקו בסיס, ניכר כי קיימות נקודות רבות ששכיחותן משתנה בפרוטאום של הנקבה; נקודות שהשכיחות שלהן עלתה פי שניים או יותר בנקבות מסומנות במעגל אדום, ואלו ששכיחותן ירדה פי שניים או יותר מסומנות במעגל כחול. זהותן של נקודות החלבון שהשתנו ביותר מפי שניים (עלייה או ירידה) והן בעלות מובהקות סטטיסטית עבור N של חמישה עכברים, נקבעה באמצעות ניתוח רצף חומצות אמינו בשיטת כרומטוגרפיה נוזלית המשולבת עם ספקטרומטריית מסות.

בגרף זה, ציר ה-x מייצג עכברים נקבות לפני פעילות גופנית, וציר ה-y מייצג קבוצת נקודת זמן של שעה אפס לאחר סבב בודד של פעילות. התוצאות מראות כי נקבות מציגות ירידה משמעותית במטבוליזם של אנרגיית סוכר, באנזימים, ובאיזופורמות של אנזים creatine kinase, המהווה מערכת אספקת אנרגיה שונה בשרירים. הן בני אדם והן בעלי חיים מראים רמות גבוהות יותר של CK בסרום אצל זכרים במצב מנוחה ואחרי פעילות גופנית, אך רמות CK בסרום אינןו בהכרח נמצאות במתאם עם כמות ה-myofibrillar.

דימורפיזם מגדרי זה בשפע התאי של CK בשריר ה-miren biceps brachii הוא ממצא חדש שעשוי להסביר את רמות ה-CK השונות פיזיולוגית בסרום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון quantitative immuno blotting, על מנת לאמת את התוצאות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה של אופן ההכנה וההפרדה של דגימות לצורך פרופיל פרוטאומי דיפרנציאלי.