Name: השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למד שיטת שמרים-Two-Hybrid משופצת לזיהוי אינטראקציות חלבונים עם Progranulin. הפרוטוקול המשופץ מפחית תוצאות חיוביות שגויות ומשפר את אמינות הסקרים הגנטיים באופן משמעותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר NIH K01AR053210, R01AR061484 ו מענק מהקרן הלאומית פסוריאזיס.

<ol><li>He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li>
<li>Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatory+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin.</a> J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).</li>
<li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proepithelin+to+epithelins%3A+roles+of+SLPI+and+elastase+in+host+defense+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair.</a> Cell. 111, 867-878 (2002).</li>
<li>Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+inflammation%2C+impaired+host+defense%2C+and+neuropathology+in+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice.</a> J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).</li>
<li>Van Damme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+functions+as+a+neurotrophic+factor+to+regulate+neurite+outgrowth+and+enhance+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Progranulin functions as a neurotrophic factor to regulate neurite outgrowth and enhance neuronal survival.</a> J. Cell. Biol. 181, 37-41 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li>
<li>Cruts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li>
<li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li>
<li>Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin+epithelin+precursor%3A+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1%2F2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+%28GEP%29+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+in+the+pathogenesis+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Clin.+Pract.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis.</a> Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).</li>
<li>Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waxman%2C+S.G.+Fibroblast+growth+factor+homologous+factor+1B+binds+to+the+C+terminus+of+the+tetrodotoxin-resistant+sodium+channel+rNav1.9a+%28NaN%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN).</a> J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-7%3A+a+metalloproteinase+that+directly+binds+to+and+degrades+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein.</a> FASEB. J. 20, 988-990 (2006).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+Factor+Progranulin+Binds+to+TNF+Receptors+and+Is+Therapeutic+Against+Inflammatory+Arthritis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li>
<li>Wu, H., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+Resolves+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progranulin Resolves Inflammation.</a> Science. 332, 427-428 (2011).</li>
<li>Hollenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15, 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74, 205-214 (1993).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שני היברידית ההקרנה שמרים הוכיחה להיות כלי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון 16, 17. לעומת גישות אחרות לזיהוי חלבונים מחייב שותפים, כגון שיתוף טיהור חלבון שבבי ביוכימיים, שמרים שני מערכת היברידית היא גישה גנטי רגיש, שניתן להשתמש בהם להקרנה מספרים גבוהים מאוד של קידוד רצפים בניסוי פשוט יחסית; ב בנוסף, הוא מזהה את באינטראקציה vivo ואינו זקוק לטיהור חלבונים מורכבים. של שמרים כמובן שני מערכת היברידית יש מגבלות, למשל, היעדר שלאחר translational התאמות הנדרשות, המתקפל לא מספיק ו / ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ProQuest שני היברידית מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD בינוני צמיחה </td><td> Clontech </td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD בינוני אגר </td><td> Clontech </td><td> 630410 </td></tr><tr><td> מאגר מינימלי SD אגר </td><td> Clontech </td><td> 630412 </td></tr><tr><td> Leu-DO מוסף </td><td> Clontech </td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp DO מוסף </td><td> Clontech </td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura DO מוסף </td><td> Clontech </td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3-אמינו-1-,2,4 triazole (3AT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> מרק לוריא (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X-Gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> סלמון sonicated זרע DNA </td><td> Stratagene </td><td> 201190 </td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Kanamycin סולפט </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> יעילות Subcloning ™ DH5α ™ תאים המוסמכת </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® בסיס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> ליתיום אצטט </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ED </td></tr><tr><td> Nitrocellulose ממברנה </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10 ס&quot;מ צלחת פטרי </td><td> ITI מדעי </td><td> CT-903 </td></tr><tr><td> אינקובטור (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

השתנה שמרים-two-hybrid system כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה progranulin

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), הידוע גם בשם מבשר epithelin granulin (GEP), הוא גורם-593 חומצות אמיניות צמיחה autocrine. PGRN ידוע לשחק תפקיד קריטי במגוון של תהליכים פיזיולוגיים ומחלות, כולל העובר מוקדם, ריפוי פצעים 1, דלקת 2, 3, ו מארח הגנה 4. PGRN גם פונקציות כגורם neurotrophic 5, מוטציות בגן PGRN שגורם לאובדן חלקי של דמנציה לגרום חלבון PGRN frontotemporal 6, 7. מחקרים אחרונים שלנו הביאו לבידודה של PGRN כמו וסת חשוב של התפתחות סחוס השפלה 8-11. למרות PGRN, גילה כמעט לפני שני עשורים, משחק תפקידים מכריעים מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים, מאמץ לנצל את הפעולות של PGRN ולהבין את המנגנונים המעורבים כבר הקשו באופן משמעותי על ידי חוסר היכולת שלנו לזהות את הקולטן שלו מחייב (ים). כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו מודיfied שמרים שני היברידית (MY2H) המבוססת על המערכת הנפוצה ביותר GAL4 2-היברידית מבוססת. בהשוואה למסך רגיל שמרים שני היברידית, MY2H דרמטי מקצרת את תהליך המסך מפחית את מספר שיבוטים חיובי כוזב. בנוסף, גישה זו היא לשחזור אמין, ויש לנו בהצלחה המועסקים במערכת זו לבודד את החלבונים המחייב של פיתיונות שונים, כולל יון ערוץ 12, תאי חלבון מטריקס 10, 13, 14 ו - גורם גדילה. במאמר זה, אנו מתארים את הליך הניסוי MY2H בפירוט באמצעות PGRN כדוגמה שהוביל לזיהוי TNFR2 כמו הקולטן first PGRN הקשורים ידוע 14, 15.

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

פרוגרנולין (PGRN), הידוע גם כ-granulin epithelin precursor (GEP), הוא גורם גדילה אוטוקרי המורכב מ-593 חומצות אמינו. ידוע כי PGRN ממלא תפקיד קריטי ...

מערכת MY two H זו משפרת את פרוטוקול השמרים דו-היברידי (yeast two hybrid) הקונבנציונלי במטרה להפחית באופן משמעותי את מספר התוצאות החיוביות השגויות. ראשית, בצעו טרנספורמציה בקנה מידה קטן של פלסמיד הפיתיון (bait plasmid) לתוך שמרים. לאחר תיקוף של מבנה הפיתיון באמצעות סריקת מעכב תחרותי, בצעו סריקה של ספריית ה-cDNA על מצעי minus four.המשיכו לאימות של השבטים החיוביים באמצעות XGL ובדיקות תגובה. לאחר מכן, זהו את החלבונים האינטראקטיביים הפוטנציאליים באמצעות ריצוף DNA ואנליזה ביו-אינפורמטית. בסופו של דבר, מערכת שמרים דו-היברידית משופרת זו מגבירה באופן משמעותי את היעילות ואת סיכויי ההצלחה של תהליך הסריקה.מערכת השמרים הדו-היברידית (yeast two hybrid) הקונבנציונלית ידועה ביצירת תוצאות חיוביות שגויות. סרטון זה מציג פרוצדורת סריקה שונה המשופרת משמעותית לזיהוי אינטראקציות בין שני חלבונים. בואו נתחיל.הדביקו 50 מיליליטר של YPD עם תרבית לילה של 5 מיליליטר של MAV 2 0 3. גדלו במשך שתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 30 °C. לאחר מכן, קצרו את השמרים באמצעות סרCטריפוגציה; לאחר שטיפה אחת, השעיקו את המשקעים בשני מיליליטר של תמיסה אחת והדגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.הכינו את תערובת ה-DNA לטרנספורמציה. הוסיפו 100 microliters של תאי שמרים וערבבו היטב. לאחר מכן הוסיפו 700 microliters מתמיסה שתיים וערבבו היטב.ראשית, דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצעו הלם חום. כעת קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה ותוהו את המשקע ב-200 µL של מים מזוקקים בסטרליזציה (autoclaved distilled water). פרסו דילולות סדרתיות של התוך על מצעי SD LU ודגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. שלב זה מאשר כי הפלסמיד הפיתיון (bait plasmid) מפעיל שעתוק, וכי הפעלה עצמית זו ניתנת לנטרול על ידי מעכבים, כגון 3-AT, שהוא מעכב תחרותי של תוצר הגן hiss3.ראשית, העבירו את פלסמיד הפיתיון (bait plasmid) לשמרים מסוג MAV 2 0 3. פרסו את התגובה על מצעי SD LU והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. על מנת לסנן מושבות להפעלה עצמית מושרית על ידי three at, השתמשו בקיסמי שיניים שעברו עיקור באוטוקלאב כדי להעביר מושבות מכל טרנספורמציה למצעי SD LU hiss המכילים ריכוזים עולים של three at, והדגירו את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.יש לסנן זני פיתיון הגדלים על צלחות המכילות 100 millimolar 3-AT כלא מתאימים לשימוש בסריקת ה-two hybrid עבור re. עבור הפיתיונות הנותרים, יש לבחור את ריכוז ה-3-AT הנמוך ביותר המעכב את צמיחת התאים לצורך שימוש בסריקת ספריית CD NA; יש לתלות מספר מושבות מבודדות של שמרים המכילות את פלסמיד הפיתיון ב-100 µL של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. יש לפרוס אותן על שתי צלחות SD LU בקוטר 10 cm.דגרו את שתי הצלחות בטמפרטורה של 30 °C. גרדו ותלו את התאים באופן מלא ב-10 milliliters. עקרו באוטוקלאב מים מזוקקים והחדירו את התרבית ל-500 milliliters של מצע YPD נוזלי.יש לאמת את צפיפות התאים באמצעות ספקטרומטריה, פוטומטריה ותרבית בטמפרטורה של 30 °C. המשך לקציר התאים באמצעות סרטיפוגציה. שטוף פעם אחת ב-100 milliliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב, ופעם אחת ב-50 milliliters של תמיסה אחת.לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-2.5 milliliters של תמיסה אחת. כעת הוסף DNA של זרע סלמון גזוז ומנוון, וכן את ספריית ה-CD NA, תוך ערבוב עדין באמצעות פיפטור. לאחר מכן הוסף 15 milliliters של תמיסה שתיים המכילה 40% polyethylene glycol.ערבבו בעדינות וחלקו מנות של 700 µL לתוך 25 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL שעברו אוטוקלאב. הדגרירו למשך 30 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 30 °C, לאחר מכן בצעו הלם תרמי של 15 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 42 °C.קצור את התאים באמצעות סרכזגציה ותלה מחדש בעדינות כל משקע ב-400 microliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. פזר כל תערובת טרנספורמציה על פני שתי צלחות ברירה והדגר למשך חמישה עד 10 ימים ב-30 degrees Celsius כהערכת ביקורת של יעילות הטרנספורמציה של צלחת התגובה. דילולים סדרתיים של תגובה אחת.לאחר דגירה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 30 °C, קבעו את מספר המושבות הכולל. העבירו את המושבות לצלחת YPD ודגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך לילה. לאחר מכן, הניחו ממברנת ניטרוצלולוזה עגולה ישירות על צלחת ה-YPD, תוך הבטחה שאין בועות אוויר.לאחר דקה, בדקו שכל המושבות הועברו לממברנות. הניחו את הממברנה כאשר צד המושבות פונה כלפי מעלה בסירת רדיד אלומיניום, והניחו אותה על פני חנקן נוזלי למשך 20 שניות. לאחר מכן, טבלו אותה בחנקן הנוזלי למשך מספר דקות.כעת הוציאו את הממברנה כדי להפשיר אותה. בינתיים, הכינו צלחת פטרי עם שכבת תמיסת XCA טרייה על נייר Aman. לאחר מכן, טבלו בזהירות את הממברנה המופשרת והדגירו בטמפרטורה של 37 °C.עד להופעת מושבות כחולות. תגובת הטרף, השבטים והפיתיון המובנים בשמרים יכולה לסייע בביטול תוצאות חיוביות שגויות. ראשית, בודדו את ה-plasmid DNA מזני השמרים שעשויים להכיל חלבונים בעלי אינטראקציה.בצע טרנספורמציה של DNA לתוך חיידקי e coli DH5α ובחר את המושבות באמצעות גידול על מצעי LB ampicillin. סרוק את הטרנספורמנטים באמצעות אנליזה של אנזימי הגבלה. כעת בצע קו-טרנספורמציה של פלסמידי ה-prey וה-bait לתוך שמרים MAV203, פרוס אותם על מצעי SC LU trip והדגר למשך שניים עד שלושה ימים בטמפרטורה של 30 °C.בחר שלוש מושבות שונות לביצוע רצף בדיקת ה-xal, הפקת ה-plasmid DNA מהשבטים החיוביים וזיהוי גנים באמצעות ביו-אינפורמטיקה. בניסוי זה, גורם הגדילה Progranulin שימש כפיתיון לסריקת ספריית cDNA של מוח, וזוהו 54 שבטים חיוביים.מועמדים בודדים בודדו מתוך 2.5 מיליון. התרשמים (Transformants) נסרקו באמצעות הפיתיון pro granulin. ניתוחים נוספים באמצעות בדיגת ex skull הצביעו על 23 מועמדים חיוביים של שיבוטים עבור הפיתיון pro granulin.באופן מעניין, ניתוחים ביו-אינפורמטיים של נתוני ריצוף זיהו את TNF R two. ואכן, ניסויים פונקציונליים נוספים אישרו את progranulin כליגנד חדש של קולטני TNF. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע סריקת היבריד שופעה זו עם בסיס העניין שלכם.אל תשכחו לעבוד עם כפפות, מכיוון שחלק מהאזורים שבהם נעשה שימוש הם מסוכנים. בהצלחה בניסויים שלכם.

modified-yeast-two-hybrid-system-to-identify-proteins-interacting

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

שיטת הקרנה גבוהה תוכן לצורך זיהוי של רומן איתות קולטנים הטרנסממברני מוסמכים מתוארת. שיטה זו היא נוחה לאוטומציה בקנה מידה גדולה ומאפשרת תחזיות...

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

סרטון זה מדגים את הבדיקה הדו-היברידית של שמרים כדי לזהות אינטראקציות עצמיות ספציפיות של חלבונים. בבדיקה זו, החלבון המעניין מתויג לשני תחומים של גורם שעתוק המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז. כאשר שני החלבונים מתקשרים זה עם זה, הדבר גורם לשעתוק ולתרגום ליצירת האנזים, אשר מזוהה לאחר מכן באמצעות בדיקה ביוכימית.

בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Ketoconazole נקשר ולעוינות pregnane X קולטן הפעלה (PXR). מסכי תפוקת שמרים גבוהים של מוטציות PXR להגדיר אזור ייחודי לketoconazole מחייב. שיטה גנטית המבוסס על שמרים זה מגלה אינטראקציות רצפטור הגרעיני רומן עם ligands שמקשר עם אתרי פני השטח מחייבים.

הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

למד שיטת שמרים-Two-Hybrid משופצת לזיהוי אינטראקציות חלבונים עם Progranulin. הפרוטוקול המשופץ מפחית תוצאות חיוביות שגויות ומשפר את אמינות הסקרים הגנטיים באופן משמעותי.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

גלה סרטונים נוספים