השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

מערכת MY two H זו משפרת את פרוטוקול השמרים דו-היברידי (yeast two hybrid) הקונבנציונלי במטרה להפחית באופן משמעותי את מספר התוצאות החיוביות השגויות. ראשית, בצעו טרנספורמציה בקנה מידה קטן של פלסמיד הפיתיון (bait plasmid) לתוך שמרים. לאחר תיקוף של מבנה הפיתיון באמצעות סריקת מעכב תחרותי, בצעו סריקה של ספריית ה-cDNA על מצעי minus four.

המשיכו לאימות של השבטים החיוביים באמצעות XGL ובדיקות תגובה. לאחר מכן, זהו את החלבונים האינטראקטיביים הפוטנציאליים באמצעות ריצוף DNA ואנליזה ביו-אינפורמטית. בסופו של דבר, מערכת שמרים דו-היברידית משופרת זו מגבירה באופן משמעותי את היעילות ואת סיכויי ההצלחה של תהליך הסריקה.

מערכת השמרים הדו-היברידית (yeast two hybrid) הקונבנציונלית ידועה ביצירת תוצאות חיוביות שגויות. סרטון זה מציג פרוצדורת סריקה שונה המשופרת משמעותית לזיהוי אינטראקציות בין שני חלבונים. בואו נתחיל.

הדביקו 50 מיליליטר של YPD עם תרבית לילה של 5 מיליליטר של MAV 2 0 3. גדלו במשך שתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 30 °C. לאחר מכן, קצרו את השמרים באמצעות סרCטריפוגציה; לאחר שטיפה אחת, השעיקו את המשקעים בשני מיליליטר של תמיסה אחת והדגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

הכינו את תערובת ה-DNA לטרנספורמציה. הוסיפו 100 microliters של תאי שמרים וערבבו היטב. לאחר מכן הוסיפו 700 microliters מתמיסה שתיים וערבבו היטב.

ראשית, דגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצעו הלם חום. כעת קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה ותוהו את המשקע ב-200 µL של מים מזוקקים בסטרליזציה (autoclaved distilled water). פרסו דילולות סדרתיות של התוך על מצעי SD LU ודגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. שלב זה מאשר כי הפלסמיד הפיתיון (bait plasmid) מפעיל שעתוק, וכי הפעלה עצמית זו ניתנת לנטרול על ידי מעכבים, כגון 3-AT, שהוא מעכב תחרותי של תוצר הגן hiss3.

ראשית, העבירו את פלסמיד הפיתיון (bait plasmid) לשמרים מסוג MAV 2 0 3. פרסו את התגובה על מצעי SD LU והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. על מנת לסנן מושבות להפעלה עצמית מושרית על ידי three at, השתמשו בקיסמי שיניים שעברו עיקור באוטוקלאב כדי להעביר מושבות מכל טרנספורמציה למצעי SD LU hiss המכילים ריכוזים עולים של three at, והדגירו את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.

יש לסנן זני פיתיון הגדלים על צלחות המכילות 100 millimolar 3-AT כלא מתאימים לשימוש בסריקת ה-two hybrid עבור re. עבור הפיתיונות הנותרים, יש לבחור את ריכוז ה-3-AT הנמוך ביותר המעכב את צמיחת התאים לצורך שימוש בסריקת ספריית CD NA; יש לתלות מספר מושבות מבודדות של שמרים המכילות את פלסמיד הפיתיון ב-100 µL של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. יש לפרוס אותן על שתי צלחות SD LU בקוטר 10 cm.

דגרו את שתי הצלחות בטמפרטורה של 30 °C. גרדו ותלו את התאים באופן מלא ב-10 milliliters. עקרו באוטוקלאב מים מזוקקים והחדירו את התרבית ל-500 milliliters של מצע YPD נוזלי.

יש לאמת את צפיפות התאים באמצעות ספקטרומטריה, פוטומטריה ותרבית בטמפרטורה של 30 °C. המשך לקציר התאים באמצעות סרטיפוגציה. שטוף פעם אחת ב-100 milliliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב, ופעם אחת ב-50 milliliters של תמיסה אחת.

לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-2.5 milliliters של תמיסה אחת. כעת הוסף DNA של זרע סלמון גזוז ומנוון, וכן את ספריית ה-CD NA, תוך ערבוב עדין באמצעות פיפטור. לאחר מכן הוסף 15 milliliters של תמיסה שתיים המכילה 40% polyethylene glycol.

ערבבו בעדינות וחלקו מנות של 700 µL לתוך 25 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL שעברו אוטוקלאב. הדגרירו למשך 30 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 30 °C, לאחר מכן בצעו הלם תרמי של 15 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 42 °C.

קצור את התאים באמצעות סרכזגציה ותלה מחדש בעדינות כל משקע ב-400 microliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. פזר כל תערובת טרנספורמציה על פני שתי צלחות ברירה והדגר למשך חמישה עד 10 ימים ב-30 degrees Celsius כהערכת ביקורת של יעילות הטרנספורמציה של צלחת התגובה. דילולים סדרתיים של תגובה אחת.

לאחר דגירה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 30 °C, קבעו את מספר המושבות הכולל. העבירו את המושבות לצלחת YPD ודגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך לילה. לאחר מכן, הניחו ממברנת ניטרוצלולוזה עגולה ישירות על צלחת ה-YPD, תוך הבטחה שאין בועות אוויר.

לאחר דקה, בדקו שכל המושבות הועברו לממברנות. הניחו את הממברנה כאשר צד המושבות פונה כלפי מעלה בסירת רדיד אלומיניום, והניחו אותה על פני חנקן נוזלי למשך 20 שניות. לאחר מכן, טבלו אותה בחנקן הנוזלי למשך מספר דקות.

כעת הוציאו את הממברנה כדי להפשיר אותה. בינתיים, הכינו צלחת פטרי עם שכבת תמיסת XCA טרייה על נייר Aman. לאחר מכן, טבלו בזהירות את הממברנה המופשרת והדגירו בטמפרטורה של 37 °C.

עד להופעת מושבות כחולות. תגובת הטרף, השבטים והפיתיון המובנים בשמרים יכולה לסייע בביטול תוצאות חיוביות שגויות. ראשית, בודדו את ה-plasmid DNA מזני השמרים שעשויים להכיל חלבונים בעלי אינטראקציה.

בצע טרנספורמציה של DNA לתוך חיידקי e coli DH5α ובחר את המושבות באמצעות גידול על מצעי LB ampicillin. סרוק את הטרנספורמנטים באמצעות אנליזה של אנזימי הגבלה. כעת בצע קו-טרנספורמציה של פלסמידי ה-prey וה-bait לתוך שמרים MAV203, פרוס אותם על מצעי SC LU trip והדגר למשך שניים עד שלושה ימים בטמפרטורה של 30 °C.

בחר שלוש מושבות שונות לביצוע רצף בדיקת ה-xal, הפקת ה-plasmid DNA מהשבטים החיוביים וזיהוי גנים באמצעות ביו-אינפורמטיקה. בניסוי זה, גורם הגדילה Progranulin שימש כפיתיון לסריקת ספריית cDNA של מוח, וזוהו 54 שבטים חיוביים.

מועמדים בודדים בודדו מתוך 2.5 מיליון. התרשמים (Transformants) נסרקו באמצעות הפיתיון pro granulin. ניתוחים נוספים באמצעות בדיגת ex skull הצביעו על 23 מועמדים חיוביים של שיבוטים עבור הפיתיון pro granulin.

באופן מעניין, ניתוחים ביו-אינפורמטיים של נתוני ריצוף זיהו את TNF R two. ואכן, ניסויים פונקציונליים נוספים אישרו את progranulin כליגנד חדש של קולטני TNF. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע סריקת היבריד שופעה זו עם בסיס העניין שלכם.

אל תשכחו לעבוד עם כפפות, מכיוון שחלק מהאזורים שבהם נעשה שימוש הם מסוכנים. בהצלחה בניסויים שלכם.