בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

שלום, שיין, כאן מונטי ממעבדת Bija. היום אראה לכם כיצד להשתמש באלקטרודות סיליקון (silicon probes) לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בצפיפות גבוהה של פעילות יחידות (unit activity) ופוטנציאל שדה מקומי (local field potential) בחולדה ערה ובמצב התנהגותי. אראה לכם כיצד להכין מיקרו-דרייב (micro drive) קטן, לקבע אליו אלקטרודת סיליקון, ולאחר מכן להשתיל את האלקטרודה במוח לצורך הקלטות כרוניות.

תהליך זה הוא פשוט למדי, אך הוא כולל מספר שלבים. לכן, בואו נתחיל. לפנינו אוסף קטן של התקני מיקרו-דרייב (micro drives) עבור חולדות ועכברים, הכוללים העברות של מספר חוטים בודדים, טטרודים ואלקטרודות סיליקון שעיצבנו וייצרנו לאורך השנים.

ניתן לחבר גששים מסיליקון למעגלים מודפסים קשיחים או לכבלי פוליאמיד גמישים. נראה לכם כאן כיצד להצמיד גשש בעל ארבעה שלוחות זה למיקרו-דרייב (micro drive). להכנת הדרייב, נזדקק לפלטת פליז, מקדחים בגודל 55 ו-65, מוביל הברגות (tap), מחבר פינים בשורה אחת (single row pin header), בורג 0 0 90 ואום תואם, מחזיק מקדח ומברג.

השלב הראשון הוא שבירת קטע של שלושה פינים מהמחבר (header). משכו בעדינות את הפין המרכזי החוצה, והרחיבו את החור באמצעות קידוח עם מקדח בגודל 65. לאחר מכן, צרו הברגה באמצעות הטאפ.

גזרו שתי חתיכות מלוח הפליז. שייפו את קצוות הלוח באמצעות מקדחת דרמל, וקדחו חור במרכז שתי החתיכות באמצעות מקדח בגודל 55. הרכיבו את ההנעה באופן זמני כך שלוחות הפליז נוגעים בפינים; הדקו את הברגים בעדינות עד שההרכבה תהיה יציבה.

קצוות הסיכות בולטים החוצה ואז מולחמים ללוחיות הפליז. המיקרו-דרייב כמעט מוכן; שייף קצה בולט של הבורג והלחם אותו לבורג. כעת יש לנו מיקרו-דרייב על-קל 2.

סיבוב עם כיוון השעון ירים את הגשר הפלסטי. ניתן לחבר את גשש הסיליקון להנעה באמצעות שני רכיבים. משקל אלסטומר מגן ממשי.

ערבב את הרכיבים ביחס של 10 ל-1. באמצעות מקל צמר גפן מחודד, מרח את שכבת ההגנה על הקצה העליון של הגשש. הנח לייבוש בתנור שחומם מראש ל-60 °C למשך שעתיים לפחות.

כדי להבטיח שאתרי ההקלטה נקיים משאריות, יש לנקות את הקצוות. הכינו מהילה של דטרגנט contra ביחס של 1:4. השרו את הפרובה בדטרגנט בטמפרטורה של 63 °C למשך שעתיים לפחות.

יש לשטוף את הדטרגנט על ידי טבילה חוזרת ונשנית של הפרובה במים מזוקקים לפני קיבוע הפרובה למערכת ההנעה. יש לבדוק את העכבה של כל אתר הקלטה באמצעות להב תער. חתכו חריצים מרובים בגשר כדי ליצור משטח מחוספס באמצעות שני מיקרו-מניפולטורים.

הגשש מונח מול גשר ההנעה. לאחר מכן, הגשש מקובע לגשר באמצעות דבק תפיסה (grip cement) לפני הניתוח. אלקטרודות הייחוס וההארקה מוכנות.

הלחים קצה אחד של חוט נחושת מבודד למשך כמילימטר אחד. בעזרת מחט, גרד את ראשו של בורג פלדת אל-חלד 0 0 90 והלחם אליו את חוט הנחושת. הקפד למנוע זרימה של בדיל לתוך חריץ הבורג.

גזרו חתיכות טרפזיומיות מרשת נחושת. חתיכות אלו יורכבו כדי להגן על head stage. המכשירים הכירורגיים וההכנה זהים לאלו המשמשים בניתוחים רבים בבעלי חיים קטנים.

שימו לב כי הניתוח המוצג בסרטון זה נועד למטרות הדגמה בלבד, כדי לאפשר נראות וצילום נאותים. מספר שלבי הכנה, אמצעי זהירות כירורגיים והליכים פוסט-אופרטיביים אינם מוצגים כאן. אנא עיינו בהנחיות המתאימות לניתוחים במכרסמים.

הניתוח כולו מבוצע תחת הרדמה גזית ובמצב סטרילי. לאחר חתך עורי בקו האמצע, העור והפריאוסטום מוסרים, והגולגולת מנוקה ומיובשת. המיקום והמרחק בין bregma ל-lambda נמדדים, כך שניתן לקבוע ולסמן את קואורדינטות X ו-Y של נקודת ההחדרה לפני פתיחת הגולגולת.

עבור השתלת הפרוב, מספר ברגים מוברגים עד מחציתם אל תוך העצם, הן בחלק העליון והן בצד; כמו כן, חורים מוכנים מעליהם לצורך הכנסת האלקטרודות. שימוש במספר ברגים הוא קריטי להבטחת קיבוע של שלב הראש (head stage) לגולגולת בניסויים כרוניים ארוכי טווח. באמצעות מברשת זעירה, מרח meta upon dentin activator על פני כל שטח הגולגולת.

לאחר מכן שטפו זאת בתמיסת סלין. בשלב הבא, יש למרוח בזהירות שכבה של צמנט דנטלי המכסה את מסלול השלשלת. ארבעת הלשוניות מנחוש מקובעות לאחר מכן לגולגולת זו באמצעות הצמנט.

כעת הגענו לחלק הקריטי ביותר בניתוח: הכנת אתר השתלת הגשש באמצעות מקדח בעל ראש עגול. הקידוח מבוצע במספר שלבים, ובמהלכו משקיים השקיה תכופה של העצם בתמיסת סלין.

את מקappréת העצם מסירים בזהירות ואת פני השטח שוטפים כדי להסיר שאריות (zura). נדרשים שני כלים: וו שהוכן ממחט של חרק וסכין חד להרמה וחיתוך. דימום קל ניתן לפתור באמצעות שטיפה במי מלח (saline).

במקרה של דימום משמעותי או אם הנאו-קורטקס (neocortex) נפגע בכל דרך שהיא, יש לשקול את הפסקת הניתוח והכנת בעל חיים אחר. כעת נשתיל את גשש הסיליקון. יש להחדיר את הגשש לאזור נקי מכלי דם, בעוד שקו הגישה משמש לעצירת דימומים קלים.

הגשש ממוקם כמילימטר אחד מעל היעד המיועד. הפתח נסגר על ידי מריחה של תערובת חמה מומסת של פראפין ושמן מינרלי. בסיס המחובר מוצמד לגולגלת של Cortes באמצעות דבק grip cement.

את החלק המקשר של הפרובה מקבעים באופן דומה לגולגולת. השלב הסופי והקריטי של הניתוח הוא הרכבת לשוניות רשת נחושת לצילינדר מגן סביב הפרובה וההנעה. הצילינדר משמש גם כמסך חשמלי מפני רעשים סביבתיים ומפני ארטיפקטים של גלים איטיים הנוצרים על ידי השפם הטעון.

בבעל חיים פעיל ניתן להתאים את הגובה על ידי חיתוך חומר עודף. החוט מהרפרנס (reference) להארקה מולחם לפינים המתאימים של המחבר. ההארקה מולחמת גם לרשת הנחושת.

כנפי הנחושת מחוברות באמצעות הלחמה ומחוזקות בבטון. תנועת בורג ההנעה נבדקת שוב בסוף הניתוח, בחלקו העליון של שלב הראש באמצעות חתיכה שנגזרה מכפפת גומי לאחר טיפול פוסט-אופרטיבי מתאים. זוהי חיה בריאה ומסייעת שנראית מצוין למחרת.

כדי לאפשר תנועה חופשית של בעל החיים, אנו ממליצים להשתמש בחוט רב-גידי רך במיוחד וקל משקל. הכבל הדקיק דורש איזון מינימלי ומאפשר תנועה ללא הגבלה. איכות ההקלטה נבדקת מדי יום בכלוב הבית.

מיקום אתר ההקלטה נאמד הן על ידי דפוסי הפריקה של היחידה והן על ידי צורת פוטנציאלי השדה המקומיים. הסרטון שלנו מציג השתלה של גשושית סיליקון בודדת, אך ניתן לבצע בקלות הקלטות ממספר אתרים באמצעות מספר גששויות ומכישי התקדמות (drives) לאחר תרגול מסוים. אנו משתמשים גם במכישי התקדמות דומים אך קטנים יותר להשתלת גששויות סיליקון במוח של עכבר.

לבסוף, ניתן לשלב ביעילות הקלטות באמצעות גששים של סיליקון עם גרייה מקומית של אור ברקמה עצבית בניסויים אופטוגנטיים. תודה שצפיתם.