Name: מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: למד כיצד למדוד טרנסלוקציה של פפטידים לתוך שלפוחיות ליפידיות חד-שכבתיות גדולות באמצעות שיטת FRET. שיטה זו מאפשרת לזהות פפטידים החודרים ממברנות ביעילות ולחקור קינטיקת מעבר דרך הליפיד בילייר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות אלינור פלמינג ג&#39;סיקה חן לדיונים מועילים. המימון ניתן על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIH-NIAID) פרס R15AI079685 לבין תאגיד מחקר קוטרל פרס קולג&#39; למדע. תמיכה סטודנט נוסף סופק על ידי הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן סטנלי.

1. הכנת גדולה שלפוחית ​​ליפידים Unilamellar (&#39;לאב&#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &#39;לאב&#39; לשמש קרום התא מחקה עבור assay 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphatidylcholine מערבבים (POPC, 760.10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl phosphatidylethanolamine (DNS-האפיפיור, 994.350 g / mol) (ליפידים אוואנטי פולאר) מומס כלורופורם ב 50 : יחס 45:5. כפי assay כל דורש הכנה נפרדת של &#39;לאב&#39; הן ניסיוניות ושליטה, שני בקבוקונים עוגת השומנים צריכים להיות מוכנים. 0.376 מ&quot;ג של השומנים הכוללת (0.188 מ&quot;ג POPC, POPG 0.169 מ&quot;ג, ו - 0.019 מ&quot;ג DNS-האפיפיור) הוא בדרך כלל מספיקים כדי להפוך שלפוחית ​​מספיק משפט אחד טרנסלוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנדף כלורופורם באמצעות זרם גז N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש העוגה השומנים 9-14 שעות ייבוש ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 המניות mM HEPES חיץ פתרון (10 HEPES מ&quot;מ, 238.3 g / mol, 45 mM NaCl, 58.44 g / mol, 1 mM EDTA, 372.24 g / mol pH 7.4). חיץ HEPES הוא רחובored ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 0.4 mM חזירי טריפסין (23.3 ק&quot;ג / mol) ב חיץ 10 mM HEPES מוכן לעיל. טריפסין מאוחסן ב -20 ° C ו, הלכה למעשה שלנו, בדרך כלל לא עוברות יותר מ 2 מחזורים להקפיא להפשיר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 4.0 mM באומן בירק, מעכבי טריפסין (8 ק&quot;ג / mol) ב 10 פתרון HEPES חוצץ מ&quot;מ חנות ב -20 ° C. בשימוש שלנו, מניות זה מתחדש מדי חודש ובדרך כלל אינו עובר יותר מ 3 הקפאה / הפשרה מחזורים לפני זה הוא עשה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניסוי מחדש שלפוחית ​​multilamellar (MLVs) בשנת פתרון 0.2 מ&quot;מ טריפסין ידי הוספת נפח זהה של מניות 0.4 mM טריפסין ו 10 פתרון HEPES mM חיץ העוגה השומנים יבשים. עבור מדגם אחד של 0.376 מ&quot;ג שומנים בסך הכל, תערובת של 150 μL של פתרון טריפסין ו 150 μL של חיץ HEPES מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה מחדש MLVs בתמיסה עם 0.2 מ&quot;מ ו - 2.0 mM טריפסין באומן בירק, מעכבי טריפסין ידי הוספת נפח שווה 0.4 מ&quot;מ טריפסין המניות 4.0 mM מעכב טריפסין על עוגות השומנים יבשים. עבור מדגם אחד של 0.376 מ&quot;ג שומנים בסך הכל, תערובת של 150 μL של פתרון טריפסין ו 150 μL של מעכבי טריפסין מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MLV פתרונות בקבוקוני זכוכית צינור microcentrifuge 1.7 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא MLV פתרונות 5 הקפאה / הפשרה מחזורים בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השומנים extruder (ליפידים אוואנטי פולאר) על ידי הצבת שני תומך לסנן לחלח במאגר HEPES על כל פיסת טפלון extruder. המקום קרום לעקוב nuclepore חרוט עם נקבוביות 0.1 מיקרומטר (Whatman, United Kingdom) בין שתי חתיכות טפלון extruder, והמקום חתיכות extruder בתוך המכל מכבש מתכת. מניחים את הסופגניות על spacer את שני החלקים extruder לפני הידוק העליון של מתכת המכל extruder ומעמידים אותו לבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את נפח חלל בתוך מכבש עם 500 μL חיץ 10 mM HEPES באמצעות מזרק 250 זכוכית μL למנוע אובדן של מדגם שלפוחית. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כל מדגם MLV לתוך מכבש ולדחוף את המדגם דרך הממברנה לפחות 21 פעמים כדי להבטיח שלפוחית ​​בגודל אחיד unilamellar. &#39;לאב&#39; מתקבלים שחול הבאים פתרון MLV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;לאב&#39; חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך 48 שעות. </li></ol> 2. כימות LUV ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LUV הריכוז היה לכמת ידי קביעת תוכן זרחן הכולל במדגם 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8.9 NH 2 SO 4 במים לאחסן nanopure ו בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן w 2.5% / v אמוניום molybdate VI (588.04 g / mol) פתרון במים nanopure. הכן 10% w / v חומצה אסקורבית (176.1 g / mol) פתרון במים nanopure. הגנו על חומצה אסקורבית פתרון מחשיפה לאור על ידי כיסוי הצינור בנייר. חנות הן פתרונות 4 ° C עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.65 פוספט mM חיץ פתרון (פוספט נתרן monobasic נטול מים, 120 ג&#39;/ mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן six תקן tuBes. תקני אמור להכיל 0.0 μL, 50 μL (0.0325 μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles), או 350 μL (0.228 μmoles) של פתרון זרחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LUV דוגמיות בשלושה עותקים. כל שפופרת מדגם אמור להכיל כ 0.1 μmoles של &#39;לאב&#39;. ניסיוני ושליטה LUV ריכוזים יש למדוד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את כל מלחי זרחן מיובש אבקת באומן בירק, מעכב, שליטה LUV ריק חייב להיות מוכן. ריק אמור להכיל באותו נפח של 0.2 mM trypsin/2.0 פתרון מעכב mM באומן בירק, כפי הוצב לשלוט LUV צינור דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 450 μL של 8.9 NH 2 SO 4 לתוך כל המדגם, רגיל, צינורות ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים דגימות, סטנדרטים, ואת החסר במשך 25 דקות ב 175-210 מעלות בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל צינורות ולאפשר להם להתקרר. הוספת 150 μL של 30% H 2 O 2 לכל אחד tuBes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים דגימות, סטנדרטים, ואת החסר במשך 30 דקות ב 175-210 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דגימות, סטנדרטים, ואת החסר מהאש. אם כל הפתרונות הם עדיין לא חסר צבע, להוסיף 50 μL H 2 O 2 לכל צינורות חום במשך 15 דקות נוספות ב 175-210 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.9 מ&quot;ל nanopure H 2 O, 0.5 מ&quot;ל molybdate אמוניום פתרון 0.5 מ&quot;ל חומצה אסקורבית פתרון צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את כל צינורות 5-7 דקות באמבט מים רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת תקן כל המדגם ב 820 ננומטר באמצעות 8453 Agilent UV-Visible ספקטרופוטומטר. שפופרת המכילה זרחן 0.0 mmoles צריך לשמש ריק עבור כל סטנדרטים ניסיוני LUV דגימות. צינור המכיל 0.2 מ&quot;מ trypsin/2.0 mM באומן בירק, פתרון מעכב צריך לשמש ריק לשליטה LUV המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ליניארי לעומת ספיגת זרחן עקומת התוכן יכול להיות מיוצר להשתמש כדי לחשב את סך phosphorus תוכן LUV ריכוז של הדגימות. </li></ol> 3. הכנת פתרונות פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטיד nanopure H 2 O. פפטידים המשמשים assay זה כמתואר חייב להכיל ערך אחד שאריות טריפטופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת פתרון הפפטיד ב 282 ננומטר בשלושה עותקים. חישוב ריכוז הפפטיד באמצעות מקדם הכחדה טוחנת עבור טריפטופן של 5700 M -1 cm -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפפטיד מדולל במים nanopure לריכוז סופי של 30 מיקרומטר. חנות ב -20 ° C </li></ol> 4. טרנסלוקציה כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות הניסוי והבקרה 1.7 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. הוסף את &#39;לאב&#39; מספיק כל פתרון עבור ריכוז סופי של 250 מיקרומטר. הוסף מספיק באומן בירק, פתרון מעכב כך מעכב כי הוא ריכוז סופי 10X יותר ריכוז טריפסין. הוסף מספיק 10 HEPES חיץ mM להביא את נפח הפתרון הסופי μL 450. </li> &lt;li&gt; 50 פלייס פתרון μL הפפטיד לתוך תא מיקרו fluorometer קוורץ Starna. היחס בין &#39;לאב&#39; ו - פפטיד הוא גבוה מספיק כדי להבטיח כי כמעט כל פפטידים שלמים נמצאים בסמיכות קרובה מספיק לקבוצה dansyl לתת סריג האות גם אם אף אחד מהם לא translocated לתוך שלפוחית. זה עולה בקנה אחד עם סריג דומה נצפתה בתנאי בקרה פפטידים לעשות ולא translocate לתוך שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מדגם הניסוי או שליטה לפתרון פפטיד קובט. זה אמור להביא את ריכוז הפפטיד האחרון 3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין 25 דקות בניסוי קינטיקה פלורסנט מיד עם תוספת של הניסוי או שליטה LUV פתרון, לוקח קריאה הקרינה לפחות פעם אחת לשנייה. הגדר את גל עירור ב 280 ננומטר, אורך הגל פליטה ב 525 ננומטר, ואת הטמפרטורה ל 25 ° C. באמצעות ספקטרופוטומטר Eclipse קארי פלואורסצנטי, אנו קובעים את הרגישות PMT גבוהה. </li></ol><html> 5. יצירת יחס טרנסלוקציה כמותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר הקרינה הראשונית (F o) כמו לקרוא את הקרינה אחרי חמש עשרה שניות של איסוף נתונים. ב ההתקנה המכשיר שלנו, מצאנו כי הראשון חמש עשרה שניות של נתונים שנאספו הקרינה אינם אמינים בשל ערבוב, סגירת חדר המדגם, הפרעות אחרות למערכת בנוסף על המדגם. מחלקים כל קריאה לאחר מכן על ידי F o להשיג הקרינה היחסית (F / F 0) בכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע כל קריאות הקרינה היחסית של הרגע האחרון של הניסוי לקבל הקרינה היחסית הממוצעת הסופית <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> עבור דגימות השליטה על ידי <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> עבור דגימות ניסיוני להשיג ערך לתקן הקרינה הסופית. </li></ol>le &quot;&gt; 6. תוצאות נציג תרשים 2 מציג את התוצאות של assay זה פפטיד נציג שהראה טרנסלוקציה חזקים. האות בניסוי הזה (שחור זכר) מראה ירידה ניכרת סריג האות לאורך זמן. עם זאת, חשוב לשלוט על אובדן פוטנציאלי של סריג האות בשל עיכוב טריפסין שלם או גורמים אחרים שאינם קשורים ליכולת טרנסלוקציה. לשם כך, אנחנו תמיד גם למדוד את סריג האות ו &#39;לאב&#39; בין פפטיד המכיל הן טריפסין ו-באומן בירק מעכב טריפסין (אפור זכר, איור 2). בידיים שלנו, זה כבר חשוב לבצע בקרה על פפטיד כל בכל פעם ניסוי פועלת. זה מאפשר לנו בבירור הנכון עבור כל שינוי אות עקב כל ההבדלים בין שלפוחית ​​ההכנות שומנים או רעש המכשירים, אשר יכול להיות משמעותי עבור אותות ניאון חלשה יחסית שנצפה בדרך כלל בריכוזים אלה. החשיבות של בקרת experiment באמצעות &#39;לאב&#39; המכיל מעכבי טריפסין מסומן על ידי הנתונים שמוצג באיור 3. במקרה זה, את האות פפטיד ירד סכום דומה לזה באיור 2 במדגם הניסוי (זכר שחור). עם זאת, מדגם לשלוט מראה ירידה מהירה יותר של הפפטיד הזה, אז טרנסלוקציה הנקי שלה נמוך יותר. סעיף 5 בפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה לכימות טרנסלוקציה מניסוי זה. יחסי טרנסלוקציה גבוהה מעידים על פפטידים translocate ביעילות, יחס טרנסלוקציה עבור הפפטיד תא חודר שמוצג באיור 2 הוא 1.16, בעוד חלושות פפטידים translocating יש יחס טרנסלוקציה קרוב 1. מניסיוננו, תקן את הטעות במשך שלושה ניסויים עצמאיים הופיע עם ההכנות שלפוחית ​​שונה בטווח של 0.01-0.06. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של translocatassay יון. ניסויית LUV דגימות (א) הם מסוממים עם פלורסנט פופ dansyl (פסים שחורים) ומכילים במארז טריפסין (מספריים). מעכבי טריפסין (עיגול אדום) משמש כדי לעכב טריפסין מחוץ &#39;לאב&#39;. &#39;לאב&#39; חשופים פפטיד (סגול). פפטיד בשיתוף עם LUV ממברנות מניב סריג אות (ירוק) אשר יורדת ככל פפטידים translocting המפגש טריפסין פנימי מעצורים. שני טריפסין ו מעכב טריפסין הם הגלום לשלוט LUV דגימות (ב) כדי למדוד ירידה סריג אות קשור טרנסלוקציה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> באיור 2. נציג נתונים עבור הפפטיד תא חודר. נציג translocating pepide מיקרוביאלית מראה ירידה משמעותית סריג אות לעומת שליטתה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> דמות3. נציג נתונים המדגיש את החשיבות של שליטה. עיכוב מושלמת של מערכת העיכול tryptic של הפפטיד הלא translocating מוביל לירידה סריג האות לאורך זמן הניסוי והן לשלוט LUV פתרונות. בגלל ההבדל בין שליטה ועקבות הניסוי הוא קטן יחסית, מוטציה זו מאופיינת בחולשה פפטיד translocating.

<ol><li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides%3A+how+different+are+they%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li>
<li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li>
<li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-Infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li>
<li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li>
<li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39%2C+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li>
<li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II%3A+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li>
<li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides%3A+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li>
<li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc.%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li>
<li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li>
<li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li>
<li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23%3A+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li>
<li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly%2C+and+why+bother%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li>
<li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers%3A+Proline+as+a+translocation+promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li>
<li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide%2C+magainin+2%2C+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides%3A+a+fluorescence+study+using+Pep-1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li>
<li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorchilin%2C+VP+%22Liposomes%22">Liposomes</a>. , Oxford University Press. New York. (2003).</li>
<li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avanti+Polar+Lipids%2C+Determination+of+Total+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש כדי להעריך את השינוי היחסי בריכוז של פפטידים ומחוצה שלפוחית ​​השומנים. שינויים אלה קשורים ליכולת טרנסלוקציה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות תאים חודר פפטידים עם פוטנציאל כמו וקטורים משלוח סמים. כאשר הריבית בתא חודר פפטידים גדל, זה יהיה מעניין לראות כיצד שיטות למדוד ישירות את האירוע טרנסלוקציה מפותחים משמש באופן כמותי. במעבדה שלנו, מצאנו כי העקביות של assay ניתן לשפר על ידי ניטור בזה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> חזירי טריפסין </td><td> סיגמא </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> באומן בירק, טריפסין / chymotrypsin מעכב </td><td> סיגמא </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> ה-Mini-extruder </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> אמוניום molybdate (פסקה) </td><td> אלפא Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> מי חמצן, פתרון של 30% </td><td> Mallinckrodt כימיקלים </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​unilamellar גדול

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

יש עניין פעיל פפטידים בקלות לחצות קרום התא ללא סיוע של קולטני קרום התא 1. רבים מהם מתייחסים כאל תא חודר פפטידים, אשר ציין לעיתים קרובות את הפוטנציאל שלהם בתור משלוח סמים וקטורים 1-3. יתר על כן, יש עניין גובר פפטידים מיקרוביאלית שפועלים דרך הממברנה ללא מנגנוני ממס 4,5, במיוחד אלו לחצות קרומים חיידקיים ללא גרימת תמוגה התא ולהרוג תאים על ידי הפרעה תהליכים תאיים 6,7. למעשה, החוקרים הצביעו יותר ויותר את הקשר בין פפטידים התא חודר מיקרוביאלית 1,8. הבנה של המשרד בתהליך של טרנסלוקציה קרום ואת הקשר בין מבנה הפפטיד ואת יכולתו translocate דורש יעילות, מבחני לשחזור עבור טרנסלוקציה. כמה קבוצות הציעו שיטות למדוד טרנסלוקציה לתוך unilamel גדולהשומנים שלפוחית ​​lar (&#39;לאב&#39;) 13/09. &#39;לאב&#39; כמודלים שימושיים קרום התא של חיידקים האיקריוטים והם משמשים לעתים קרובות במחקרים פלורסנט פפטיד 14,15. כאן, אנו מתארים את היישום שלנו של השיטה שפותחה לראשונה על ידי Matsuzaki ועמיתים לעבודה לשקול פפטידים מיקרוביאלית, כגון magainin ו buforin II 16,17. בנוסף לאספקת פרוטוקול שלנו עבור שיטה זו, אנו גם מציגים גישה פשוטה לניתוח נתונים מכמת היכולת טרנסלוקציה באמצעות assay. היתרונות של assay זה טרנסלוקציה לעומת אחרים כי יש לו את הפוטנציאל לספק מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה ואינו דורש תוספת של תווית ניאון, אשר יכול לשנות תכונות פפטיד 18, אל טריפטופן המכיל פפטידים. בקיצור, היכולת טרנסלוקציה לתוך שלפוחית ​​שומנים בדם נמדדת כפונקציה של העברת אנרגיה תהודה פוסטר (סריג) בין שאריות טריפטופן יליד דansyl phosphatidylethanolamine כאשר חלבונים הקשורים החיצוני LUV הקרום (איור 1). Cell-חודר פפטידים הם ביקע כפי שהם נתקלים טריפסין מעצורים במארז עם &#39;לאב&#39;, המוביל ההתנערות מן הקרום LUV ועל ירידה סריג האות. הירידה סריג האות שנצפה עבור פפטיד translocating הוא גדול משמעותית מזה שנצפה עבור פפטיד זהה כאשר &#39;לאב&#39; מכילים הן טריפסין ו מעכב טריפסין, או כאשר פפטיד זה לא ספונטני לעבור ממברנות שומנים בדם נחשף טריפסין המכילים &#39;לאב&#39;. שינוי זה מספק כימות הקרינה הישירה של טרנסלוקציה פפטיד לאורך זמן.

זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית ​​גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

קיים עניין פעיל בפפטידים החוצים בקלות ממברנות של תאים ללא סיוע של רצפטורים של ממברנת התא1. רבים מאלו מכונה...

לכמת את העברת הפפטידים דרך ממбраנות של וזיקולות. וזיקולות ליפידיות המסומנות פלואורסצנטית נוצרות עם טריפסין encapsulated. מעכב טריפסין מתווסף כדי לעכב את הפעילות של כל טריפסין אקסוגני, ובכך להשאיר טריפסין פעיל בלומן של הוזיקולה.רק כאשר מוסיפים פפטידים מסומנים פלואורסצנטית לוזיקולות, התגים הפלואורסצנטיים שלהם פועלים כתורמי FRET ומעוררים את המולקולות הפלואורסצנטיות שעל הוזיקולה. עם זאת, כאשר חלבונים חוצים את ממברנה, הם מעוכליים על ידי טריפסין ואות ה-FRET אובד. ניתוח ספקטרומטרי חושף את מידת התעתקות הפפטידים, הנראית כירידה ב-FRET בין הוזיקולות לפפטיד לאורך זמן.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כולל טכניקות אחרות של שלפוחיות ליפידיות ושיטות למדידת חדירת פפטידים לתאים, הוא שהיא מספקת מידע על קינטיקה של חדירה לממברנה, והיא אינה דורשת הוספה של סימון פלואורסצנטי לפפטידים אם הם מכילים טריפטופן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתכנון והנדסה של פפטידים פעילים בממברנה, כגון אילו מאפיינים נחוצים למעבר יעיל דרך הממברנה. השלב הראשון של הליך זה הוא הכנת שלפוחיות ליפידיות גדולות בלתי-עומסות (UUVs) כדי לשמש כדמיון לממברנת תא עבור הבדיקה.התחילו בשילוב של פוספטידילכולין, פוספטידילגליצרול וחמישה דימטיל אמינו נפתלן. פוספטידיל אתנולמין סולפו-פיל בתוך כלורופורם. ביחס של 50 ל-45 ל-5,

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה דן בבדיקת דליפת פלואורסצנטיות כדי לחקור את האינטראקציות של פפטידים חודרי תאים עם קרום התא באמצעות חיקויים של קרום התא – שלפוחיות חד-למלריות גדולות, או LUVs, עטופות בצבע פלואורסצנטי ומרווה (quencher).

בדיקת דליפת פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה פפטידית חודרת תאים עם ממברנה

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למד כיצד למדוד טרנסלוקציה של פפטידים לתוך שלפוחיות ליפידיות חד-שכבתיות גדולות באמצעות שיטת FRET. שיטה זו מאפשרת לזהות פפטידים החודרים ממברנות ביעילות ולחקור קינטיקת מעבר דרך הליפיד בילייר.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

גלה סרטונים נוספים

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול