מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

לכמת את העברת הפפטידים דרך ממбраנות של וזיקולות. וזיקולות ליפידיות המסומנות פלואורסצנטית נוצרות עם טריפסין encapsulated. מעכב טריפסין מתווסף כדי לעכב את הפעילות של כל טריפסין אקסוגני, ובכך להשאיר טריפסין פעיל בלומן של הוזיקולה.

רק כאשר מוסיפים פפטידים מסומנים פלואורסצנטית לוזיקולות, התגים הפלואורסצנטיים שלהם פועלים כתורמי FRET ומעוררים את המולקולות הפלואורסצנטיות שעל הוזיקולה. עם זאת, כאשר חלבונים חוצים את ממברנה, הם מעוכליים על ידי טריפסין ואות ה-FRET אובד. ניתוח ספקטרומטרי חושף את מידת התעתקות הפפטידים, הנראית כירידה ב-FRET בין הוזיקולות לפפטיד לאורך זמן.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כולל טכניקות אחרות של שלפוחיות ליפידיות ושיטות למדידת חדירת פפטידים לתאים, הוא שהיא מספקת מידע על קינטיקה של חדירה לממברנה, והיא אינה דורשת הוספה של סימון פלואורסצנטי לפפטידים אם הם מכילים טריפטופן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתכנון והנדסה של פפטידים פעילים בממברנה, כגון אילו מאפיינים נחוצים למעבר יעיל דרך הממברנה. השלב הראשון של הליך זה הוא הכנת שלפוחיות ליפידיות גדולות בלתי-עומסות (UUVs) כדי לשמש כדמיון לממברנת תא עבור הבדיקה.

התחילו בשילוב של פוספטידילכולין, פוספטידילגליצרול וחמישה דימטיל אמינו נפתלן. פוספטידיל אתנולמין סולפו-פיל בתוך כלורופורם. ביחס של 50 ל-45 ל-5, 0.376 מיליגרם של ליפיד כולל מספיקים בדרך כלל להכנת כמות מספקת של וזיקולות עבור ניסוי בודד או בקרת ניסוי.

הכינו מבחנה אחת כדגימה ניסיונית ואחת כביקורת; האדפו את הכלורופורם באמצעות זרם גז חנקן. השומנים המיובשים שנותרו לאחר שלב זה מכונים "עוגות שומן" (lipid cakes). ייבשו את עוגות השומן למשך 9 עד 14 שעות בתוך דסיקטור ואקום.

בשלב הבא, הכינו תמיסת מלאי של HEI בריכוז 10 millimolar, תמיסת מלאי של porcine trypsin בריכוז 0.4 millimolar ותמיסת מלאי של Bowman Burke trypsin inhibitor בריכוז 4.0 millimolar; פרטי ההכנה מופיעים במסמך המצורף. הוסיפו נפח שווה של תמיסת מלאי tripsin בריכוז 0.4 millimolar ותמיסת באפר HEI בריכוז 10 millimolar לעוגות הליפידים המיובשות. לאחר מכן, ערבלו את המבחנה ב-vortex כדי להשיג רקוסטוציה (reconstitution) של הוסיקולות הרב-שכבתיות (multilamellar vesicles) או mvs. כדי לבצע רקוסטוציה ל-mvs של הביקורת, הוסיפו נפח שווה של תמיסת מלאי tripsin בריכוז 0.4 millimolar ומעכב tripsin בריכוז 4.0 millimolar לעוגת הליפידים המיובשת וערבלו ב-vortex כפי שנעשה קודם לכן.

לאחר שחזירת ה-mvs, העבירו את תמיסאות ה-MLV מבעיליות זכוכית למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter. לאחר מכן, העבירו את תמיסאות ה-MLV חמישה מחזורי הקפאה-הפשרה, לסירוגין בין חנקן נוזלי למסבך מים בטמפרטורה של 30 degree Celsius. לאחר מכן, הכינו אקסטרודר ליפידים על ידי הרטבת שני תומכי סינון ב-Heiss Buffer.

לאחר מכן, הנח כל אחד מהם על חלק לחשוב של מסרט טפלון, והנח ממברנת Nucleopore עם נקבים שחוררו במיקרו-חריטה ברוחב 0.1 micron בין שני חלקי מסרט הטפלון. כעת, הנח את חלקי המסרט בתוך מכל מסרט ממתכת, והנח ספייסר בצורת דונאט מעל שני חלקי המסרט. הדק את החלק העליון המתכתי של מכל המסרט ולאחר מכן הנח אותו במחזיק באמצעות מזרק זכוכית בנפח 250 microliter.

מלאו את חלל האקסטרודר ב-500 µL של HEPES buffer בריכוז 10 mM כדי למנוע אובדן של דגימת הוסיקולות. העבירו את הדגימה לכלי כימי (beaker) בנפח 10 mL.

לאחר מכן, העמיסו כל דגימת MLV אל תוך האקסטרודר והעבירו את הדגימה דרך הממברנה לפחות 21 פעמים. כדי להבטיח גודל אחיד של וסיקולות Ella לאחר האקסטרוזיה, העבירו את וסיקולות השומן הגדולות של ELLA או את ה-L UUVs למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר. אחסנו את ה-UUVs בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך 48 שעות.

כדי להעריך את ריכוז ה-LUV, נקבע תכולת הפספורוס הכוללת בדגימה. יש להכין את הרכיבים הבאים בהתאם למפרטים בפרוטוקול הכתוב המצורף: 8.9 normal H₂SO₄, תמיסת ammonium molybdate בריכוז 2.5% w/v, חומצה אסקורבית בריכוז 10% w/v, ותמיסת בופר פוספט בריכוז 0.65 millimolar.

הכינו שישה תמיסות סטנדרט של זרחן כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, הכינו בלאנק LUV עם אותו נפח של trypsin בריכוז 0.2 millimolar ותמיסת מעכב Bowman BIR בריכוז 2.0 millimolar כפי שנעשה עבור הביקרות. פעולה זו נועדה לתקן עבור מלחי זרחן מיובשים שעלולים להימצא באבקת מעכב Bowman B.

בשלב הבא, העבירו בעזרת פיפט כ-0.1 micromoles, בדרך כלל כ-25 µL של UUVs, לתוך מבחנות תרבית מזכוכית חד-פעמיות בשלוש חזרות. לאחר מכן, הוסיפו 450 µL של H₂SO₄ בריכוז 8.9 N לכל אחת ממבחנות הדגימה, התקן והבלנק. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות, התקנים והבלנקים לתנור בטמפרטורה של 175 עד 210 °C למשך 25 דקות.

לאחר שחלפו 25 דקות, הוצא את כל המבחנות מהתנור והנח להן להתקרר. הוסף 150 µL של 30%H2O לכל אחת מהמבחנות. לאחר מכן, חמם את הדגימות, התקנים והבקרות למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 175 עד 210 °C.

לאחר 30 דקות, הוציאו את תקני הדגימה ואת הבלנקים מהחימום. אם חלק מהתמיסות עדיין אינן חסרות צבע, הוסיפו 50 µL של H2O לכל המבחנות וחממו למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 175 עד 210 °C. ברגע שהתמיסות חסרות צבע, הוסיפו לכל מבחנה 3.9 mL של nano pure H2O, כ-0.5 mL של תמיסת ammonium moate ו-0.5 mL של תמיסת ascorbic acid.

לאחר מכן, חממו את כל המבחנות למשך חמש עד שבע דקות. באמבט מים רותחים, מדדו את הבליעה של כל תמיסת סטנדרט ושל כל דגימה באורך גל של 820 nanometers באמצעות ספקטרופוטומטר UV-visible מדגם Agilent 8 4 5 3. יש למדוד בנפרד את ריכוזי ה-LUV של קבוצת הניסוי ושל קבוצת הביקורת.

יש להשתמש במבחנה המכילה 0.0 millimoles זרחן כבלאנק עבור כל התמיסות הסטנדרטיות ודגימות ה-LUV הניסיוניות. יש להשתמש במבחנה המכילה 0.2 millimolar טריפסין ו-2.0 millimolar תמיסת מעכב bone and bir כבלאנק עבור דגימת ה-LUV של הבקרה. יש להשתמש בעקומת כיול בבדיקת בליעה ליניארית מול תוכן הזרחן כדי לחשב את סך תוכן הזרחן וריכוז ה-LUV של הדגימות.

להכנת תמיסות הפפטידים, המיסו את הפפטיד ב-Oppu H2O; הפפטידים המשמשים במדידה זו חייבים להכיל שארית טריפטופן אחת. מדדו את הבליעה של תמיסת הפפטיד ב-282 ננומטר בשלוש חזרות. חשבו את ריכוז הפפטיד באמצעות מקדם הספיגה המולרי של טריפטופן, שהוא 5,700.

דללו את הפפטיד ב-nanopure water לריכוז סופי של 30 µM; אחסנו בטמפרטורה של 20°C- . כדי לכמת את התעבורה (translocation), הכינו דגימות ניסוי ובקרה באנבוני מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 mL. הוסיפו לכל תמיסה כמות מספיקה של UUVs כדי להגיע לריכוז סופי של 250 µM.

הוסיפו כמות מספקת של תמיסת מעכב Bowman BIR כך שריכוז המעכב הסופי יהיה גבוה פי 10 מריכוז ה-tryin. הוסיפו כמות מספקת של באפר HEIS בריכוז 10 millimolar כדי להביא את נפח התמיסה הסופי ל-450 microliters. העבירו 50 microliters של תמיסת הפפטיד לתא פלואורימטר מסוג stana micro chords והניחו אותו בספקטרופוטומטר התוכנה.

ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי לביצוע ניסוי קינטיקה פלואורסצנטית במשך 25 דקות, שבו נמדדת קריאת פלואורסצנציה לפחות פעם אחת בשנייה, עם אורך גל עירור של 280 ננומטר ואורך גל פליטה של 525 ננומטר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. כאשר רגישות ה-PMT מכוונת לערך גבוה, הוסיפו את דגימת הניסוי או את דגימת הביקורת לתמיסת הפפטיד ב-qve. פעולה זו תביא את ריכוז הפפטיד הסופי ל-3 מיקרומולר; התחילו מיד בניסוי הקינטיקה הפלואורסצנטית.

לאחר הרצת דגימות הניסוי והביקורת, חשבו את יחסי התעתוק כפי שמתואר במסמך הנלווה. היחס בין ה-dansyl לבין הפפטיד גבוה מספיק כדי להבטיח שכמעט כל הפפטידים השלמים נמצאים בקרבה מספיקה לקבוצת dansyl כדי להפיק אות FRET, גם אם אף אחד מהם לא תעתק אל תוך הוסיקולה. דבר זה עקבי עם ה-FRET הדומה שנצפה בתנאי ביקורת עבור פפטידים שמתעתקים ופפטידים שאינם מתעתקים אל תוך וסיקולות.

בדיקות טרנסלוקציה (Translocation assays) בוצעו כפי שמתואר בסרטון זה. איור זה מציג תוצאות של פפטיד מייצג שהראה טרנסלוקציה חזקה. האות בניסוי זה, המיוצג על ידי העקומה השחורה, מראה ירידה ניכרת באות ה-fret.

עם הזמן, יחסי טרנסלוקציה גבוהים יותר מעידים על פפטידים בעלי יעילות טרנסלוקציה גבוהה. יחס הטרנסלוקציה עבור הפפטידים החודרים לתאים המוצגים כאן הוא 1.19; לפפטידים שאינם עוברים טרנסלוקציה יש יחסי טרנסלוקציה הקרובים יותר לאחד, וזאת כדי לשלוט באובדן פוטנציאלי של אות FRET עקב עיכור חלקי של טריפסין, עיכוב או גורמים אחרים שאינם קשורים ליכולת הטרנסלוקציה. נמדד אות ה-FRET בין הפפטיד לבין UUVs המכילים הן טריפסין והן את מעכב הטריפסין Bowman BRK.

דבר זה מוצג כעקבה בצבע אפור. חשיבותו של ניסוי הביקורת המשתמש ב-UUVs המכילים מעכב טריפסין מודגשת על ידי הנתונים המוצגים כאן. במקרה זה, אות הפפטיד פחת במידה דומה לזו שבאיור הקודם במדגם הניסויי המיוצג על ידי העקבה השחורה.

עם זאת, דגימת הבקרה מראה ירידה מהירה יותר עבור פפטיד זה, ולכן התעתקוהו נטו נמוכה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת שלפוחיות שומניות ומדידת התעתוק של פפטידים המכילים טריפטופאן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל באיסוף הנתונים מיד לאחר ערבוב הפפטיד והשלפוחיות.