Name: הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: חקור ניתוח ביטוי של תתי סוגי היסטון H1 באמצעות PCR בזמן אמת וכרומטוגרפיה HPLC. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של mRNA וחלבונים בתאי יונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק GM085261 ואת הקואליציה סרטן גאורגיה פרס נכבדים Scholar (כדי YF).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

קבוצה של מבחני שהוצג לאפשר ניתוח מקיף של רמות הביטוי של יונקים תת היסטון מקשר. מתוכנן כראוי qRT-PCR מבחני לספק מדידות רגישות גבוהה ומדויקת של הודעות רנ&quot;א של כל הגנים יונקים היסטון H1. חלק חשוב של qRT-PCR מבחני עבור מקשר גנים תת היסטון הוא הכנת cDNA באמצעות צבע יסוד על בסיס אקראי שעתוק לאחור. ה-mRNA של גנים היסטון ביותר, כולל גנים H1 ביותר, אינם מכילים עוד מרובה הזנב מוצגים mRNAs סלולריים אחרים. לכן השיטה המסורתית שעתוק לאחור עם oligo-DT primers לא יהיה יעיל לייצר cDNAs H1. ני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> RNase זאפ </td><td> יישומי Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Absolute אתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR ירוק </td><td> ביו רד </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> ערכת RNeasy מיני </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> אני Deoxyribonuclease </td><td> סיגמא </td><td> המגבר-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-PCR גם צלחת </td><td> ביו רד </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> אטמים דבק &#39;ב&#39; Microseal </td><td> ביו רד </td><td> MSB-1001 </tד&gt; </tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> פוספט נתרן dibasic heptahydrate (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי (NaCl) </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> נתרן dihydrogen heptahydrate פוספט (לאא 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> מעכב השלם מיני proteinase קוקטייל Tablet </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי (KCl) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl aminomethane] </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (MgCl2) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> חומצה גופרתית (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> ברדפורד Assay חלבון </td><td> ביו רד </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic חומצה (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

הביטוי ניתוח linker-היסטון תת סוגים יונקים

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

היסטון H1 מקשר נקשר החלקיקים ליבת הנוקלאוזום ו-DNA מקשר, בהנחיית מתקפל של הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 הוא חיוני להתפתחות היונקים 1 ומווסת ביטוי גנים ספציפיים in vivo 2-4. בין חלבונים היסטון השמורים באבולוציה, משפחת ההיסטונים H1 מקשר הוא קבוצה הטרוגנית ביותר. ישנם 11 תת H1 ביונקים אשר מוסדר באופן דיפרנציאלי במהלך הפיתוח בסוגי תאים שונים. אלה כוללים תת H1 5 סומטי H1s (H1a אלקטרוני), H1 החלפת 0, 4 תאים נבט תת ספציפיים H1, ואת H1x 5. נוכחות של מספר רב של תת H1 שונים בזיקה DNA מחייב יכולת הדחיסה הכרומטין 6-9 מספק רמה נוספת של אפנון של תפקוד הכרומטין. לכן, ניתוח ביטוי כמותי של תת H1 בודדים, הן של ה-mRNA וחלבונים, יש צורך להבין טוב יותר את הרגולציה של גבוההכרומטין מנת מבנה ותפקוד. כאן אנו מתארים סדרה של מבחני המיועדים לניתוח רמות הביטוי של תת H1 בודדים (איור 1). ביטוי mRNA של גנים שונים H1 חלופה נמדדת על ידי מערכת של רגישות גבוהה וכמותית שעתוק-PCR (qRT-PCR) מבחני הפוכה, אשר מהיר יותר, מדויק יותר ודורשים דגימות הרבה פחות לעומת הגישה החלופית של ניתוח כתם הצפון. שלא כמו רוב הודעות ה-mRNA אחרים הסלולר, mRNAs עבור גנים היסטון ביותר, כולל רוב הגנים H1, חסר זנב ארוך פולה, אבל מכילים מבנה גזע לולאה על האזור מתורגמת &#39;3 (UTR) 10. לכן, cDNAs מוכנים מ-RNA הכל על ידי שעתוק לאחור באמצעות פריימרים אקראיים במקום oligo-DT primers. זמן אמת מבחני ה-PCR עם פריימרים ספציפיים כל תת H1 (טבלה 1) מבוצעות כדי להשיג מדידה כמותית מאוד של רמות ה-mRNA של תת H1 הפרטs. הביטוי של גנים משק מנותחים כפקדי עבור נורמליזציה. השפע היחסי של החלבונים של כל תת H1 ו ההיסטונים הליבה מתקבל דרך הפוכה כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי שלב (RP-HPLC) ניתוח של ההיסטונים הכל המופקים בתאי יונקים 11-13. שיטת HPLC ותנאי elution המתואר כאן נותנים הפרדות אופטימלי של תת H1 עכבר. על ידי לכימות פרופיל HPLC, אנו מחשבים את חלקם היחסי של תת H1 הפרט בתוך המשפחה H1, כמו גם לקבוע את H1 יחס הנוקלאוזום בתאים.

אנו מתארים סדרה של מבחני לנתח את רמות הביטוי של ההיסטונים מקשר H1. ה-mRNA של גנים בודדים H1 נמדדים באופן כמותי על ידי שעתוק אקראי מבוסס הפוך פריימר ואחריו בזמן אמת PCR, ואילו חלבון כימות של ההיסטונים H1 מושגת על ידי ניתוח HPLC.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

היסטון מקשר H1 נקשר לחלקיק הליבה של הנוקלאוזום ול-DNA המקשר, ובכך מסייע לקיפול הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 חיוני...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנתח את רמות הביטוי של תת-סוגי היסטון H1, הן באמצעות ניתוח של רמות ה-mRNA של H1 והן באמצעות מדידת רמות חלבון H1. כדי לבצע את ניתוח ה-mRNA, תחילה מופק RNA כולל מתאים תרביתיים או מרקמות עכבר. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע תמלול הפוך של ה-RNA הכולל באמצעות פריימרים אקראיים, ולאחריו בדיקות quantitative real-time PCR עבור כל אחד מגני תת-הסוגים של H1. ניתוח חלבון היסטון H1 מתחיל בהכנת תמריות היסטון כוללות מרקמות עכבר או מתאים תרביתיים.לאחר מכן יבוצעו הפרדה וכמות של כל תת-סוג של H1 וההיסטון הליבאי H2B באמצעות אנליזת HPLC פאזה הפוכה. לבסוף, PCR כמותי בזמן אמת ואנליזת HPLC פאזה הפוכה יראו את רמות הביטוי של ה-mRNA והחלבונים עבור כל תת-סוג של H1.אנו סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדתו של ד"ר Yuhan FES בבית הספר לביולוגיה של המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. היום נדגים לכם מערך של בדיקות מקיפות לניתוח הביטוי של H ones בתתי-סוגי H one של יונקים. באמצעות בדיקות אלו, תוכלו לקבל מדידה כמותית של רמות הביטוי של mRNA וחלבון בתתי-סוגים שונים של H one.היסטון H1 הוא חלבון המבנה הכרומטיני העיקרי המקל על קיפול כרומטין מסדר גבוה. קיימות גרסאות שונות של היסטון H1 המבטאות עצמן באופן דיפרנציאלי במהלך התמיינות תאים וביטוי התפתחותי. ניתוח פרופיל הביטוי של תתי-סוגים אלו של H1 נחוץ להבנה

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

שיטה זו מתארת אסטרטגיה פשוטה ומהירה לאפיון וחקירה של פרוטאופורמים של היסטון.

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU

חקור ניתוח ביטוי של תתי סוגי היסטון H1 באמצעות PCR בזמן אמת וכרומטוגרפיה HPLC. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של mRNA וחלבונים בתאי יונקים.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

גלה סרטונים נוספים