Name: הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: חקור ניתוח ביטוי של תתי סוגי היסטון H1 באמצעות PCR בזמן אמת וכרומטוגרפיה HPLC. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של mRNA וחלבונים בתאי יונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק GM085261 ואת הקואליציה סרטן גאורגיה פרס נכבדים Scholar (כדי YF).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

קבוצה של מבחני שהוצג לאפשר ניתוח מקיף של רמות הביטוי של יונקים תת היסטון מקשר. מתוכנן כראוי qRT-PCR מבחני לספק מדידות רגישות גבוהה ומדויקת של הודעות רנ&quot;א של כל הגנים יונקים היסטון H1. חלק חשוב של qRT-PCR מבחני עבור מקשר גנים תת היסטון הוא הכנת cDNA באמצעות צבע יסוד על בסיס אקראי שעתוק לאחור. ה-mRNA של גנים היסטון ביותר, כולל גנים H1 ביותר, אינם מכילים עוד מרובה הזנב מוצגים mRNAs סלולריים אחרים. לכן השיטה המסורתית שעתוק לאחור עם oligo-DT primers לא יהיה יעיל לייצר cDNAs H1. ני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> RNase זאפ </td><td> יישומי Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Absolute אתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR ירוק </td><td> ביו רד </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> ערכת RNeasy מיני </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> אני Deoxyribonuclease </td><td> סיגמא </td><td> המגבר-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-PCR גם צלחת </td><td> ביו רד </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> אטמים דבק &#39;ב&#39; Microseal </td><td> ביו רד </td><td> MSB-1001 </tד&gt; </tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> פוספט נתרן dibasic heptahydrate (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי (NaCl) </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> נתרן dihydrogen heptahydrate פוספט (לאא 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> מעכב השלם מיני proteinase קוקטייל Tablet </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי (KCl) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl aminomethane] </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (MgCl2) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> חומצה גופרתית (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> ברדפורד Assay חלבון </td><td> ביו רד </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic חומצה (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

הביטוי ניתוח linker-היסטון תת סוגים יונקים

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

היסטון H1 מקשר נקשר החלקיקים ליבת הנוקלאוזום ו-DNA מקשר, בהנחיית מתקפל של הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 הוא חיוני להתפתחות היונקים 1 ומווסת ביטוי גנים ספציפיים in vivo 2-4. בין חלבונים היסטון השמורים באבולוציה, משפחת ההיסטונים H1 מקשר הוא קבוצה הטרוגנית ביותר. ישנם 11 תת H1 ביונקים אשר מוסדר באופן דיפרנציאלי במהלך הפיתוח בסוגי תאים שונים. אלה כוללים תת H1 5 סומטי H1s (H1a אלקטרוני), H1 החלפת 0, 4 תאים נבט תת ספציפיים H1, ואת H1x 5. נוכחות של מספר רב של תת H1 שונים בזיקה DNA מחייב יכולת הדחיסה הכרומטין 6-9 מספק רמה נוספת של אפנון של תפקוד הכרומטין. לכן, ניתוח ביטוי כמותי של תת H1 בודדים, הן של ה-mRNA וחלבונים, יש צורך להבין טוב יותר את הרגולציה של גבוההכרומטין מנת מבנה ותפקוד. כאן אנו מתארים סדרה של מבחני המיועדים לניתוח רמות הביטוי של תת H1 בודדים (איור 1). ביטוי mRNA של גנים שונים H1 חלופה נמדדת על ידי מערכת של רגישות גבוהה וכמותית שעתוק-PCR (qRT-PCR) מבחני הפוכה, אשר מהיר יותר, מדויק יותר ודורשים דגימות הרבה פחות לעומת הגישה החלופית של ניתוח כתם הצפון. שלא כמו רוב הודעות ה-mRNA אחרים הסלולר, mRNAs עבור גנים היסטון ביותר, כולל רוב הגנים H1, חסר זנב ארוך פולה, אבל מכילים מבנה גזע לולאה על האזור מתורגמת &#39;3 (UTR) 10. לכן, cDNAs מוכנים מ-RNA הכל על ידי שעתוק לאחור באמצעות פריימרים אקראיים במקום oligo-DT primers. זמן אמת מבחני ה-PCR עם פריימרים ספציפיים כל תת H1 (טבלה 1) מבוצעות כדי להשיג מדידה כמותית מאוד של רמות ה-mRNA של תת H1 הפרטs. הביטוי של גנים משק מנותחים כפקדי עבור נורמליזציה. השפע היחסי של החלבונים של כל תת H1 ו ההיסטונים הליבה מתקבל דרך הפוכה כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי שלב (RP-HPLC) ניתוח של ההיסטונים הכל המופקים בתאי יונקים 11-13. שיטת HPLC ותנאי elution המתואר כאן נותנים הפרדות אופטימלי של תת H1 עכבר. על ידי לכימות פרופיל HPLC, אנו מחשבים את חלקם היחסי של תת H1 הפרט בתוך המשפחה H1, כמו גם לקבוע את H1 יחס הנוקלאוזום בתאים.

אנו מתארים סדרה של מבחני לנתח את רמות הביטוי של ההיסטונים מקשר H1. ה-mRNA של גנים בודדים H1 נמדדים באופן כמותי על ידי שעתוק אקראי מבוסס הפוך פריימר ואחריו בזמן אמת PCR, ואילו חלבון כימות של ההיסטונים H1 מושגת על ידי ניתוח HPLC.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

היסטון מקשר H1 נקשר לחלקיק הליבה של הנוקלאוזום ול-DNA המקשר, ובכך מסייע לקיפול הכרומטין למבנה מסדר גבוה יותר. H1 חיוני...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנתח את רמות הביטוי של תת-סוגי היסטון H1, הן באמצעות ניתוח של רמות ה-mRNA של H1 והן באמצעות מדידת רמות חלבון H1. כדי לבצע את ניתוח ה-mRNA, תחילה מופק RNA כולל מתאים תרביתיים או מרקמות עכבר. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע תמלול הפוך של ה-RNA הכולל באמצעות פריימרים אקראיים, ולאחריו בדיקות quantitative real-time PCR עבור כל אחד מגני תת-הסוגים של H1. ניתוח חלבון היסטון H1 מתחיל בהכנת תמריות היסטון כוללות מרקמות עכבר או מתאים תרביתיים.לאחר מכן יבוצעו הפרדה וכמות של כל תת-סוג של H1 וההיסטון הליבאי H2B באמצעות אנליזת HPLC פאזה הפוכה. לבסוף, PCR כמותי בזמן אמת ואנליזת HPLC פאזה הפוכה יראו את רמות הביטוי של ה-mRNA והחלבונים עבור כל תת-סוג של H1.אנו סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדתו של ד"ר Yuhan FES בבית הספר לביולוגיה של המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. היום נדגים לכם מערך של בדיקות מקיפות לניתוח הביטוי של H ones בתתי-סוגי H one של יונקים. באמצעות בדיקות אלו, תוכלו לקבל מדידה כמותית של רמות הביטוי של mRNA וחלבון בתתי-סוגים שונים של H one.היסטון H1 הוא חלבון המבנה הכרומטיני העיקרי המקל על קיפול כרומטין מסדר גבוה. קיימות גרסאות שונות של היסטון H1 המבטאות עצמן באופן דיפרנציאלי במהלך התמיינות תאים וביטוי התפתחותי. ניתוח פרופיל הביטוי של תתי-סוגים אלו של H1 נחוץ להבנה טובה יותר של הבקרה על מבנה ותפקוד הכרומטין מסדר גבוה. אז בואו נתחיל.לפני הפקת RNA, יש לנגב את כל משטחי העבודה והפיפטים ב-70% ethanol ולטפל בהם בתמיסה לדה-קונטמינציה של RNA. נוהג זה מפחית את הסיכויים לזיהום ב-RNA ולדגרדציה של RNA. בנוסף, יש להשתמש בכפפות לאורך כל הפרוצדורות כדי להתחיל בהפקת RNA מתרבית תאים דבקים, לשאוב את מדיום התרבית ולשטוף את התאים ב-PBS.לאחר מכן, הסיר את ה-PBS מהבארים. נדרש כמות מספקת של ריאגנט triol כדי להשיג RNA באיכות גבוהה. השתמש ב-1 mL של ריאגנט triol כדי להפיק RNA מבאר אחת בלוח של שש בארים, והמשך בהפקת ה-RNA מהתאים על פי מדריך היצרן עבור ריאגנט triol. לאחר הפקת ה-RNA, מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות NanoDrop 1000.התנובה הטיפוסית נעה בין 5 ל-15 micrograms של RNA לכל 1 × 10⁶ תאים בתרבית. לפני המעבר לסינתזת CDNA, יש לנתח את איכות ה-RNA באמצעות electrophoresis של GE כדי לשלול זיהום פוטנציאלי של ה-RNA בכמויות מזעריות של DNA גנומי; יש לטפל בדגימות RNA באמצעות RNA free DN לפי הוראות היצרן לצורך תעתוק הפוך של RNA כולל ל-CD NA. השתמשו במערכת superscript 3 לסינתזת הגדיל הראשון בהתאם להוראות היצרן. מאחר ש-mRNA של מרבית הגנים H1 חסר זנבות poly A, קריטי להשתמש ב-random hexamer במקום ב-oligo DT כפריימרים.עבור סינתזת cDNA, לאחר שעתוק הפוך, ניתן להשיג הגברה של ה-cDNA באמצעות Q-R-T-P-C-R, כפי שזו מזוהה על ידי צבע cyber green לפני בדיקת ה-Q-R-T-P-C-R. תוכננו פריימרים קדמיים ואחוריים ל-PCR הספציפיים לכל גן H1 ולגן הייחוס הפנימי, ויעילות הפריימרים נבדקה בשיטת עקום סטנדרטי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. המשיכו להכנת כל תגובת PCR על ידי ערבוב הפריימרים, ה-cDNA ו-CYBERG green super.ערבבו היטב את התגובות בתוך פלטת PCR מסוג micros EAL 96, והשתמשו באטמי דבק micros EAL B כדי להבטיח שהמכסה אטום לפלטה. לאחר מכן, ערבבו את הפלטה האטومة במכשיר vortex וסובבו אותה קצרה (spin down) כדי לרכז את תערובות התגובה. הניחו את הפלטה במערכת My IQ לגילוי qPCR בעת דמי (real-time PCR) בצבע יחיד.הגדירו את תנאי ה-QPCR ובצעו את ההרצה כפי שהודרכה בטקסט לאחר השלב של ההגברה. בחנו את עקומות ההגברה כדי לקבוע את יעילות ה-PCR ואת ערכי סף המחזור או ה-CT. ניתן להגדיר את קו הסף באופן אוטומטי באמצעות גרסה 2.0 של התוכנה של מערכת ה-IQ five optical.מכיוון ש-cyber green מזהה כל DNA דו-גדילי, חיוני לבצע הרצה של עקומת התכה לאחר ה-QPCR כדי להבטיח שהאמפליקון הרצוי הועשיר וזוהה, ולא דימרים של פריימרים או זיהומים. עבור תוכנית ניתוח עקומת ההתכה, מכשיר ה-QPCR יחמם את הדגימות מ-55 °C עד 95 °C במדרגות של 0.5 °C עם איסוף נתונים. מכיוון שהטמפרטורה או ה-TM של DNA דו-גדילי תלויה באורך האמפליקון ובתוכן ה-GC, לאמפליקונים שונים יהיו tms שונים.בחן את עקומות ההמסת הנגזרות של תוצרי ה-QPCR כדי לאשר את טמפרטורת ההמסה הספציפית של האמפליקונים הרצויים, וכן את היעדרם של שיאי אמפליקונים מרעישים, כגון עקומות ההמסה של אמפליקוני PCR של H one A המוצגות כאן עם TM של 86 °C. המשך בניתוח נתוני ה-QPCR באמצעות תוכנת מערכת ה-IQ five optical. נרמל את ערכי הביטוי של גנים של איזופורמי H one אל מול הביטוי של גני housekeeping כדי לקבל רמות ביטוי יחסיות של גני H one.לאחר דיסקציה של האיבר הרלוונטי מעכבר שהורדם, שטפו אותו ב-PBS קר מאוד. בהדגמה זו, הכנת חלקיקי RNA כולל (total RNA) תבוצע על הכבד; לאחר השטיפה, קצצו את הרקמה לחתיכות בעזרת להב תער. העבירו את הרקמה הקצוצה להומוגניזר (Dounce homogenizer) ולאחר מכן הוסיפו למכשיר באפר סוכרוז בנפח של 10 milliliters לגרם רקמה.המשיכו להומוגניזציה של הרקמה באמצעות 10 עד 15 תנועות. לאחר העברת ההומוגנאטים למבחנה של 15 מיליליטר, בצעו סנטריפוגציה של הדגימות ב-500 RPM למשך 30 שניות. לאחר הסנטריפוגציה, העבירו בזהירות את העלייה למבחנה חדשה ובצעו סנטריפוגציה ב-2000 RPM למשך חמש דקות.כדי לשקע את התאים, השביה מחדש את משקע התאים ב-10 milliliters של בופר סוכרוז, בתוספת 0.5%NP 40. העבר את הדגימה למערכת הומוגניזציה ובצע 10 הפיסות במהלך דגירה של 20 דקות. בשלב זה, מתקבלים הגרעינים.יש לבחון את איכות הגרעינים תחת מיקרוסקופ. לאחר שקיעת הגרעינים על ידי צנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך חמש דקות, ניתן להשליך את הנוזל העליון. לאחר מכן, יש לתלה שוב את משקע הגרעינים בשלושה מיליליטר של בופר מלח גבוה עבור כל גרם רקמה.העבירו את הדגימה להומוגנייזר קטן והומוגניזרו באמצעות חמישה עד 10 תנועות. העבירו את התרחיף לשלוש מבחנות Eppendorf. הדגירו את המבחנות על קרח למשך 20 דקות.לאחר הדגרה, בצעו סנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות כדי לשקע את הכרומטין. לאחר השליכה של הנוזל העליון, חלצו היסטונים סהריים על ידי הוספה של 0.8 מיליליטר של חומצה גופרית בריכוז 0.2 normal לכל משקע כרומטין. השתמשו בעשק (pestle) המותאם לפסולת עינוור כדי לטחון את המשקע היטב עד להתפרקותו המלאה.דגרו את הדגימות על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את העליון לשתי מבחנות EOR. הוסיפו לכל מבחנה נפח של 2.5 של אתנול קר מהקרח.שמרו את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך לילה. למחרת, סובבו בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות כדי לשקיע את ההיסטונים הכוללים, והשליכו את הנוזל העליון. לאחר שטיפת המשקוע שלוש פעמים ב-70% ethanol, השאירו את המבחנות פתוחות על השולחן למשך 20 עד 30 דקות לייבוש באוויר והמשיכו מיד לניתוח HPLC. השביו את משקע ההיסטונים בנפח המומלץ של מים מזוקקים פעמיים, בהתאם לקיבולת של עמודת הפאזה ההפוכה ומכשיר ה-HPLC, וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך חמש דקות.כדי להסיר שאריות בלתי מסיסות, הזרק 50 עד 100 מיקרוגרם של חלבון היסטון כולל לעמודת הפאזה ההפוכה של מערכת ה-HPLC, כגון GE ACTA purifier UPC 900. יש להימנע מכמות חלבון עודפת כדי למנוע סתימה של העמודה. הפרקציה השמינית, הלינקר, ההיסטונים וההיסטונים הליבתיים יופרדו באמצעות גרדיאנט עולה של אצטוניטריל כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב; יש לנטר את השטף באורך גל של 214 ננומטר, ולהקליט ולנתח את פרופילי ה-HPLC. ניתן לאסוף את פרקציות החלבון גם באמצעות אספן הפרקציות האוטומטי GE FRAC nine 20 לצורך ניתוח נוסף.מוצגות כאן עקומות הגברה טיפוסיות של תגובות H one A-Q-P-C-R המשתמשות ב-CDNA שהוכן מתאי כבד של עכבר ומתאי גזע עוברי של עכבר. הערכה של גרף ההגברה מראה כי תגובות ה-QPCR בשלוש חזרות עבור כל דגימה הניבו אותות עקביים עם ערכי CT כמעט זהים, דבר המעיד על הדירות גבוהה. היעדר הצטברות של אמפליקונים מתגובות RT minus QPCR מעיד כי זיהום ב-DNA גנומי לא היה קיים או היה מינימלי. תוך שימוש בערכי ה-CT של גנוי H one ושל גני בית (housekeeping genes), חושבו רמות הביטוי היחסיות של ה-RNA עבור כל גן H one.הגרפים המוצגים כאן הם דוגמאות לתוצאות מחושבות עבור הגנים H1A ו-H1.0. רמות הביטוי היחסי של mRNA של H1A גבוהות יותר בתאי גזע עובריים של עכבר בהשוואה לכבד של עכבר, בעוד שביטוי H1.0 גבוה בהרבה בכבד מאשר בתאי הגזע העובריים. ההבדל בביטוי של H1A או H1.0 בתאי גזע עובריים של עכבר לעומת כבד של עכבר בוגר ניכר גם מפרופילי HPLC של חלבוני היסטון.H one zero. חלבון ה-H one הספציפי לדיפרנציאציה מצטבר בכמות גדולה בכבד של עכבר בוגר. בניגוד לכך, חלבון H one zero כמעט ואינו קיים בתאי גזע עובריים של עכבר שאינם מובחלים.מצד שני, H1A מובע במידה גבוהה בתאי גזע עובריים, אך מופיע ברמות נמוכות בכבד של עכבר בוגר, כפי שעולה מכימות של שיאי H1. בפרופיל ה-HPLC, נקבע הפרופורציה היחסית של כל תת-סוג H1 בודד בתוך משפחת H1 בכבד של עכבר בוגר. יתרה מכך, ניתן לחשב את הערכים של תת-סוג H1 בודד לכל נוקלאוזום מתוך היחס בין ערך השיא הנורמל של הבליעה ב-214 nanometers של תת-סוגי H1 המתאימים לבין מחצית מהערך הנורמל של H2B. ערך זה ניתן לחשב באופן דומה עבור סך כל ה-H1 לכל נוקלאוזום.לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע אנליזת Q-R-T-P-C-R של תת-סוג H1 ביום אחד, ומיצוי היסטונים ואנליזת HPRC בתוך שלושה ימים, במידה והדברים מבוצעים כהלכה. בעת ביצוע אנליזת Q-R-T-P-C-R של גנים של היסטון H1, קריטי למנוע דגרדציה של RNA ולסלק זיהום של DNA גנומי, והחשוב ביותר הוא לכלול פריימרים אקראיים בתגובת השעתוק ההפוך. במהלך מיצוי היסטונים ואנליזת HPOC, חשוב להוסיף מעכבי חלבון טריים לתמיסת המיצוי כדי למנוע דגרדציה של חלבונים, וכן יש להקפיד על פירוק מלא של הכרומטין כדי להקל על מיצוי מלא של ההיסטונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח באופן מקיף את הביטוי של תתי-סוגי histo H1 של יונקים, הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון.

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

שיטה זו מתארת אסטרטגיה פשוטה ומהירה לאפיון וחקירה של פרוטאופורמים של היסטון.

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU

חקור ניתוח ביטוי של תתי סוגי היסטון H1 באמצעות PCR בזמן אמת וכרומטוגרפיה HPLC. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של mRNA וחלבונים בתאי יונקים.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

גלה סרטונים נוספים