Name: קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו לקבוע פעילות פגוציטית של נוגדנים ספציפיים לתאי חיסון בדגימות קליניות באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הערכה סטנדרטית ומהירה של תגובות חיסוניות מול מחלות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות במימון NIH 3R01AI080289-02S1, וכן אוניברסיטת הרווארד מרכז האיידס מחקר מלומד אחוות תחת NIH / NIAID 2P30AI060354-07.

1. התרבות תאים Phagocytic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות THP-1 תאים 10 ב RPMI 1640 בתוספת סרום 10% שור העובר כמו השעיה נייח בתוך צלוחיות טי. צפיפות התאים יש לשמור מתחת 0.5x10 6 / mL על מנת לשמור על רמות עקבי הביטוי FcγR וביצועים assay. </li></ol> 2. הכן Antigen Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום של ערכת sulfo-NHS ביוטין מגיב LC צורך biotinylate את אנטיגן המטרה של עניין על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את מגיב biotinylation במים ומיד להוסיף את הסכום מחושב אנטיגן ב חיץ שאינו מכיל אמינים ראשוניים. אפשר התגובה להמשיך במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עודפי ביוטין, unconjugated על ידי חילופי חיץ יחידת Amicon צנטריפוגלי ריכוז של הפסקת המשקל הראוי מולקולרית כדי לשמר את targeאנטיגן לא. הוסף מדגם לתא העליון של יחידת ריכוז להוסיף PBS להביא את הנפח הכולל עד לקו 15 מ&quot;ל למלא. צנטריפוגה XG ב 4000 להביא את עוצמת הקול של כ 1.5-MLS. חוזרים על תהליך זה פעמיים תסיר 99% ביוטין החופשי כדי להבטיח ציפוי מקסימלי של אנטיגן כדי חרוזים. </li></ol> 3. הכינו חרוזים Antigen רווי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 100 μl של 1 מ&quot;מ חרוזי ניאון neutravidin פעמיים 1 מ&quot;ל 0.1% PBS-BSA לאחר שצנח ב microcentrifuge במהירות גבוהה. Resuspend שטף חרוזים ב μl 100 PBS-BSA, ו 10 aliquot לתוך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע ציפוי אנטיגן התנאים להרוות את החרוזים, לשלב 10 ul של ההשעיה חרוז נשטף עם ריכוזים שונים של אנטיגן biotinylated בשני פי שלבים. דגירה לילה ב 4 ° C בצינור microcentrifuge על הכתף. </li></ol> הערה: הרוויה של חרוזים צריכה להיקבע באופן ניסיוני. ניתן להשיגעל ידי זיהוי ציפוי חרוז התנאים phagocytosis תשואה מקסימאלית כאשר החרוזים הם opsonized לאחר מכן עם נוגדנים חד שבטיים שליטה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אנטיגן מאוגד על ידי שטיפה עם 1 מ&quot;ל PBS-BSA ו צנטריפוגה במהירות גבוהה עד חרוזים הם pelleted. הסר PBS-BSA וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend אנטיגן מצופים חרוזים בנפח סופי של 1 מ&quot;ל PBS ב-BSA. חרוזים ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש. </li></ol> 4. הכן דוגמאות נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות נוגדנים קלינית יכולה להיות מטוהרים מן הפלזמה באמצעות ג&#39;ל מלון ערכת IgG טיהור בהתאם להוראות היצרנים. מטוהרים IgG ניתן לאחסן 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> הערה: אמצעי זהירות נאות בדבר הטיפול דגימות האדם חייב תמיד נלקח. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של נוגדנים מטוהרים על ידי ספיגת ב A280, ו לדלל דגימות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להניחive ושליליות נוגדנים חד שבטיים לשלוט על ידי דילול עד 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS. </li></ol> 5. ציפוי הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שטף, רווי אנטיגן פתרון חרוז מוכן ידי vortexing לעיל, והעברת 10 μl היטב לתוך כל צלחת 96 מסביב לתחתית היטב. יש להקפיד להמשיך להתסיס את ההשעיה חרוז על מנת להבטיח מספר שווה של חרוזים פלורסנט מתווספים גם כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריכוזים שונים של נוגדנים עניין גם כל יצירת עקומת מנה תגובה עבור כל נוגדן. ריכוז אופטימלי יהיה שונה בין דגימות בהתאם כייל נוגדנים של ההווה, אלא מגוון של 0.01-100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי תספק כיסוי טוב לאפשר זיהוי של טווח הריכוז של עניין. ודא נוגדנים מתווספים בכמויות לא יותר μl 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים דגירה דגימות נוגדנים עבור 2 שעות 37 ° C כדי לאפשר נוגדנים כדי opsonize את החרוזים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיית THP-1 תאים ב 2.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל, ולהוסיף 200 μl של השעיה זו אחד טוב, עבור סכום כולל של 5 x 10 4 THP-1 תאים בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2, חממה נייח, תאים המאפשר וחרוזים על גלולה באמצעות כוח הכבידה. </li></ol> הערה: אות לרעש יכול להיות משופרת על ידי קביעת חרוז אופטימלי: נוגדן: THP-1 יחס התא מקור אנטיגן לבין נוגדנים נתון. 6. תזרים Cytometric ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 100 μl של supernatant מכל טוב נזהר לא להפריע תא גלולה. Supernatant ניתן לשמור אם הפרשת ציטוקינים קביעות או ניתוחים אחרים הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קיבעון, להוסיף 100 μl של paraformaldehyde 4% טוב כל pipet כדי resuspend ומערבבים תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוקה גבוהה ניתוח תזרים cytometric יכול להתבצע באמצעות LSR BD II מצויד בקורא צלחת HTS.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנה תוכנית לערבב היטב כל שלוש פעמים (100 נפח לערבב μl) ולנתח 30 μl, או לפחות 2000 אירועי תא, של כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים שנאספו ניתן לנתח FlowJo או תוכנה דומה. מדדים שימושי כוללים את אחוז + חרוז, או תאים פלורסנט, אשר מספק מדד של מספר תאים phagocytic הנוכחי, כמו גם את עוצמת הקרינה של תאים phagocytic, אשר מספק מדד של מספר חרוזים phagocytosed. הכפלה של ערכים אלה יוצרת אינטנסיביות משולב ניאון מתכוון, או iMFI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספר הממוצע של חרוזים phagocytosed על ידי כל תא phagocytic יכול להיות מחושב על ידי חלוקת iMFI על ידי הקרינה ממוצע של 1 חרוז. </li></ol> 7. נציג תוצאות צריכה להיות הבחנה ברורה של דגימות נוגדנים מן הנבדקים מושפעים מעושה. איור 1 א מציג את היסטוגרמות FACS המדגם נוגדן של נגה-HIVtive (זכר שחור) נושא HIV חיובי (זכר אפור), מדגים את phagocytosis גדל מונע על ידי נוכחות של אנטיגן ספציפי נוגדנים. רגישות אופטימלית של assay תלויה הרוויה של חרוזים עם אנטיגן biotinylated. איור 1B מציגה את phagocytosis נצפתה כאשר חרוזים מצופים עם כמויות שונות של אנטיגן היו opsonized עם 3 נוגדנים חד שבטיים מלאה (כולל נוגדנים בלתי מחייב, משולשים), וקובע 2μg אנטיגן / μl חרוזים כמו ריכוז להרוות עבור אנטיגן זה. עקומת מנה תגובה מוצגת באיור 2, מדגים את קיבולת ההפרש של דגימות נוגדנים הנושא לגרום phagocytosis על פני טווח נוגדן ריכוז של 0.05-5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. Phagocytosis זה ההפרש עשוי להיות מונע על ידי אחד ההבדלים titer או נכסים Fc תחום כגון תת IgG המדינה glycosylation. כאשר THP-1 התאים לימאגד ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש עדות ברורה phagocytosis חרוז. איור 3 מציג שתי 63x עדיין תמונות של THP-1 תאים לאחר הדגרה עם נוגדן opsonized (ירוק) ולא opsonized (אדום) חרוזים, מפגין את חוסר ספיגת phagocytic בהעדר נוגדנים. כאשר לשגות מיקרוסקופיה זמן מתבצע, את ספיגת נוגדנים ספציפיים phagocytic של חרוזי ניאון מדהימה יותר (סרט 1, הגדלה 20x). עבודות קודמות אישרה הפנמה של חרוזים הקשורים התאים, וניסויים עם מונוציטים העיקרי הסכימו היטב assay זה תפוקה גבוהה (מידע לא מוצג) עם עשרות phagocytic (ערכי iMFI). <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. בקרת איכות Assay. 1A, cytometry זרימה היסטוגרמות של phagocytosis למדגם נוגדן מהנושא HIV שלילי (זכר שחור) נושא HIV חיובי (זכר אפור).1B: קביעה ניסויית של תנאים אופטימליים ציפוי חרוז עבור אנטיגן מדגם. Antigen ספציפית נוגדנים חד שבטיים (עיגול, מרובע) להפגין phagocytosis מקסימלי של חרוזים מצופים מיקרוגרם&gt; 2 אנטיגן / μl של חרוזים, ואילו נוגדן שליטה (משולש) מדגים שום פעילות phagocytic. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. מנה תגובה phagocytosis Curve. נוגדן דגימות קליניות מ-HIV חיובי (מטופל, מטופלים, ו מפגין שליטה שכפול נגיפי בהעדר טיפול אנטי retroviral) ו-HIV phagocytosis נושאים שלילי הכונן של gp120 (המעטפה HIV) חרוזים מצופים דיפרנציאלי. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="איור 3"/> באיור 3. הפנמה יעילה. מיקרוסקופית מאשרת את ההפנמה של נוגדנים opsonized חרוזים (ירוק), ואילו אי - opsonized חרוזים להישאר סולution (63x הגדלה). סרט 1. זמן לשגות מיקרוסקופיה של phagocytosis נוגדן מונחה בוצעה במשך 14 שעות, מאפשרת הדמיה של פעילות phagocytic של THP-1 תאים מנוצל assay תפוקה גבוהה. חרוזים הניאון הירוק נוגדן opsonized, חרוזי ניאון אדום לספק שליטה שלילית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a>

<ol><li>Cartron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+activity+of+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+and+polymorphism+in+IgG+Fc+receptor+FcgammaRIIIa+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene.</a> Blood. 99, 754-758 (2002).</li>
<li>Ahmad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+correlation+between+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity-mediating+anti-HIV-1+antibodies+and+prognostic+predictors+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection.</a> J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).</li>
<li>Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells.</a> J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).</li>
<li>Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th%09%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Th	.</a> Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors+and+their+role+in+immune+regulation+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity.</a> J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).</li>
<li>Jefferis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%3A+isotype+and+glycoform+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).</li>
<li>Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viruses+and+mononuclear+phagocytes.+I.+Infection+enhancement+by+non-neutralizing+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody.</a> J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).</li>
<li>Subramaniam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+absence+of+serum+IgM+enhances+the+susceptibility+of+mice+to+pulmonary+challenge+with+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans.</a> J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1.</a> Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ward, E. S., Ghetie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effector+functions+of+immunoglobulins%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy.</a> Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).</li>
<li>Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+antitumor+effects+of+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies.</a> Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors%3A+their+diverse+functions+in+immunity+and+immune+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders.</a> Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).</li>
<li>Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoform-dependent+conformational+alteration+of+the+Fc+region+of+human+immunoglobulin+G1+as+revealed+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).</li>
<li>Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+the+IgG+Fc+glycan%3A+the+anti-inflammatory+activity+of+sialylated+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Fcs.+J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG.</a> Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agalactosylated+IgG+antibodies+depend+on+cellular+Fc+receptors+for+in+vivo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).</li>
<li>Marchette, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+immune+status+on+dengue+2+virus+replication+in+cultured+leukocytes+from+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children.</a> Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).</li>
<li>Fust, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+and+enhancing+antibodies+measured+in+complement-restored+serum+samples+from+HIV-1-infected+individuals+correlate+with+immunosuppression+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease.</a> AIDS. 8, 603-609 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay המתואר כאן מאפשר תפוקה גבוהה ניתוח של הפעילות phagocytic של דגימות נוגדנים קליני על ידי ניצול קו תא monocytic מנוצל זמן ללמוד תהליכים phagocytic 10 ועל סמך הצלחת לזרום אוטומטית cytometry. Assay זה יתרון על פני אחרים ביכולתה בדיוק לאפיין אנטיגן ספציפי לערמונית תת נוגדנים, מה שמאפשר לא רק למחקר הבדלים phagocytosis מונע על ידי נוגדנים ספציפיים למחלה של נושאים שונים, אלא גם מחקר ספציפיות אנטיגן מרובים בתוך אותו נושא. בגלל גיוס נוגדן של תאים מפעיל מולדת, כולל מונוציטים ותאים אחרים מציגים אנטיגן חזק משפיע על התוצאה 11-13 מחלה, והוא משתנה בהתאם לגיאומטריה נוגדן ביולוגי, תת IgG ו glycosylation ב Asparagine297 של תחום Fc 14-16, שיטה זו מספקת עבור הערכה של מנגנון נוגדן קריטי פעולה. יתר על כן, בגלל נוגדנים Mediphagocytosis ated מנוצלת על ידי פתוגנים מסוימים במהלך זיהום 7,17,18, assay זה טומן בחובו הבטחה בהערכת תהליך של שיפור נוגדנים תלויי, מדגיש את האופי הכפול של phagocytosis כמו מגן בפוטנציה, כמו גם פוטנציאל מזיק פעילות הנוגדנים. Assay המתואר יכול להיות מנוצל כדי לנתח נוגדנים דגימות קליניות של אוכלוסיות חולים, אלא גם של vaccinees, וניתן להתאים לנצל בסרום ולא מטוהרים IgG. בנוסף, הפרשת ציטוקינים בתגובה phagocytosis ניתן לנתח מן supernatant התרבות, את ההשפעה של FCR מסוים ניתן לקבוע באמצעות FCR-חסימת נוגדנים, מה שמאפשר לא רק הבדלי העוצמה phagocytic שייקבע, אך הזרם איתות אירועים, עם תובנה לתוך מנגנון, ועשויים לסייע לפתור ולשפר הבנה של מנגנון זה החיסונית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo Micro-NHS-LC-Biotinylation Kit </td><td> Thermo Scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם קרום Ultracel 50 </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> גודל יחידת סינון עשויים להשתנות בהתאם לגודל אנטיגן </td></tr><tr><td> FluoSpheres NeutrAvidin שכותרתו microspheres, 1.0 מיקרומטר, צהוב, ירוק ניאון (505/515) </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> היצרנים לייצר את המוצר הזה, בצבעים שונים </td></tr><tr><td> מלון ג&#39;ל IgG טיהור Kit </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> יש להקפיד לבדוק את טוהר דגימות Ab על ידי SDS-page. </td></tr></tbody></table>

קביעת פעילות phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

נוגדן מונחה phagocytosis מושרה באמצעות מעורבות של רצפטורים Fc על phagocytes מקצועי, יכולים לתרום גם אישור כמו גם הפתולוגיה של המחלה. בעוד את המאפיינים של תחומים משתנה של נוגדנים כבר מזמן נחשב קריטי בתפקוד vivo, את היכולת של הנוגדנים לגייס תאים חיסוניים מולדים דרך תחומים Fc שלהם הפך יותר ויותר מוערך כגורם מרכזי יעילותם, הן ההגדרה של רקומביננטי נוגדנים חד שבטיים לטיפול, כמו גם במהלך זיהום טבעי או חיסון 1-3. חשוב לציין, למרות המינוח שלה מושלם מתמיד, את תחום הנוגדנים Fc אין פונקציה קבועה, והיא מווסתת במידה רבה על ידי תת IgG (IgG1-4) ו glycosylation ב Asparagine 297 4-6. לכן, שיטה זו ללמוד ההבדלים תפקודית של אנטיגן ספציפי הנוגדנים בדגימות קליניות יאפשר המתאם של הסיר phagocyticential של נוגדנים הרגישות המדינה, מחלת דלקת, התקדמות, או התוצאה הקלינית. יתר על כן, פונקציה זו מפעיל חשוב במיוחד לאור היכולת מתועד של נוגדנים כדי לשפר את זיהום על ידי מתן גישה פתוגנים לתאי המארח דרך phagocytosis קולטן מונחה Fc 7. בנוסף, יש כמה עדויות לכך ספיגת phagocytic של קומפלקסים החיסונית יכול להשפיע על הקיטוב Th1/Th2 של התגובה החיסונית 8. כאן, אנו מתארים assay נועד לזהות הבדלים phagocytosis-נוגדן המושרה, אשר עלולה להיגרם על ידי תת IgG ההפרש, מבנה glycan ב Asn297, כמו גם את היכולת החיסונית ליצירת קומפלקסים של אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים באופן תפוקה גבוהה . לשם כך, חרוזים פלורסנט 1 מיקרומטר הם מצופים אנטיגן, אז מודגרות עם דגימות נוגדנים קליני, שהניבו פלורסנט אנטיגן ספציפי לערמונית מתחמי החיסונית. אלה antibody-opsonized חרוזים מודגרת אז עם קו התא monocytic להביע FcγRs מרובות, כולל הן מעכבות והפעלה. התפוקה Assay יכול לכלול פעילות phagocytic, הפרשת ציטוקינים, ודפוסי השימוש FcγRs, ו נקבעים באופן אחיד, מה שהופך את מערכת שימושי מאוד עבור ניתוח ההבדלים בתפקוד נוגדנים תלויי זה מפעיל זיהום והן החיסון בתיווך הגנה 9.

אנו מציגים assay תפוקה גבוהה תזרים cytometric כדי לקבוע את פעילות phagocytic של אנטיגן ספציפי של נוגדנים דגימות קליניות, ניצול פלורסנט אנטיגן מצופים חרוזים קו תא monocytic לבטא קולטנים מרובים Fc-מתן השימוש הקולטן קביעות פעילות phagocytic בבית סטנדרטי אופנה לשחזור עבור כל אנטיגן של עניין.

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

פגוציטוזה מונחית נוגדנים מושרית באמצעות קשירה של רצפטורי Fc על פגוציטים מקצועיים, ויכולה לתרום הן לפינוי והן ל...

מטרת הניסוי הבא היא לקבוע את הפעילות הפגוציטית של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בדגימות קליניות בסביבת עיבוד נתונים גבוהה (high throughput). דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי חרו지를 פלואורסצנטיים באנטיגן נבחר, כדי לאפשר לכידה של הפракציה של הנוגדנים הספציפיים לאנטיגן הנוכחים בדגימות נוגדנים קליניות מורכבות. כשלב שני, תאי TH1 מדגירים עם החרו지를 הפלואורסצנטיים המיוננים, ואז פגוציטים את החרו지를 בהתאם למספר ולמאפייני דומיין ה-FC של הנוגדנים הקשורים.בשלב הבא, עוצמת הפלואורסצנציה של תאי ה-THP one נקבעת באמצעות ציטומטריית זרימה בשיטה של לוחות בקיבולת גבוהה (high throughput), וזאת כדי לכמת את הפעילות הפגוציטית של הנוגדנים הנמצאים בדגימה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את יכולתם של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בדגימה להשרות פגוציטוזה, בהתבסס על ספיגה דיפרנציאלית של חרוזי פלואורסצנציה שעברו אופסוניזציה, כתוצאה מתיתור (titer) משתנה של הנוגדנים או מזיהוי משתנה על ידי רצפטורים לנוגדנים המובעים על התאים הפגוציטיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו המשתמשות בתאים פגוציטיים ראשוניים, הם הגברת הקיבולת והשיפור בסטנדרטיזציה.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאימונולוגיה הבסיסית של התגובה החיסונית האדפטיבית, כגון השאלה האם משטרי חיסון שונים השרו נוגדנים בעלי פעילויות שונות. להשלכות של טכניקה זו יש חשיבות עבור הטיפול במחלות זיהומיות, שכן לנוגדנים תרומה מרכזית לגיוס תגובה חיסונית מגנה ואפקטיבית. למרות שהשתמשנו בשיטה זו כדי לספק תובנות לגבי פעילותם של נוגדנים בזיהום HIV מתקדם ובחיסונים, ניתן ליישמה גם במצבים מחלתיים אחרים כגון שפעת, אוטו-אימוניות ודנגי, שבהם נוגדנים מסוג frago עלולים להחמיר את המחלה במקום לספק הגנה.התחילו בדילול האנטיגן בבופר שאינו מכילו אמינים ראשוניים. לאחר מכן, המיסו את ריאגנט ה-sulfa NHS lc, biotin במים. לאחר מכן, הוסיפו מיד את הריאגנט המומס לאנטיגן והמתינו להשלמת התגובה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.מדי פעם, כאשר התגובה הושלמה, העבירו את הדגימה לתא העליון של יחידה לריכוז בצנטריפוגה כדי להסיר עודפי ביוטין לא מצומד באמצעות החלפת בופר. כעת הוסיפו PBS עד להגעה לקו המילוי של 15 milliliter. לבסוף, צנטריפוגו את הדגימה במהירות של 4,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C עד שהנפח יירד לכ-1.5 milliliters.חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי להשיג הסרה כמעט כמותית של ביוטין חופשי. לאחר סבב של 100 µL של חרוזי eut tradin פלואורסצנטיים בגודל מיקרון אחד במיקרו-צנטריפוגה ב-13,000 ×g למשך חמש דקות, השהה מחדש ושטוף את החרוזים ב-1 mL של 0.1% P-B-S-B-S-A בהתאם לאותו הליך צנטריפוגה. לאחר מכן, לאחר השהיה מחדש של החרוזים השטופים ב-100 µL של P-B-S-B-S-A, חלק שוב את החרוזים לתוך 10 מבחנות מיקרו-פוגה.בשלב הבא, ערבבו 10 µL של תרחיף החרוצים השטוף עם ריכוזים משתנים של אנטיגן מביוטינילי בדרגות דילול עוקבות. לאחר מכן, דגרו את תרחיפי החרוצים והאנטיגן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה על גבי רוטטור. למחרת.הסר אנטיגנים שאינם קשורים על ידי שטיפת התמיסות פעמיים עם 1 mL של P-B-S-B-S-A וסבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות גבוהה כפי שבוצע קודם לכן עד להשקת החרוזיים. לבסוף, השהה מחדש את החרוזיים המצופים באנטיגן בנפח סופי של 1 mL של P-B-S-B-S-A לאחר טיהור דגימות הנוגדנים הקליניים מהפלזמה באמצעות ערכה לטיהור IgG מסוג melon gel. בהתאם להוראות היצרן, קבע את ריכוז הנוגדנים המטוהרים על ידי מדידת בליעה ב-280 nm.לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים לריכוז של 1mg/mL ב-PBS, תוך הפרדה של דגימות עבור הנוגדנים המונוקלונליים לשליטה חיובית ושלילית. בשלב הבא, יש להביא את תמיסת החרו지를 הרווים באנטיגן למצב של סספנזיה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן להעביר 10 µL מהתמיסה לכל באער של פלטת 96 באערים בעלת תחתית עגולה; יש להקפיד על ערבוב רציף של סספנזיית החרו지를 כדי להבטיח שמספר שווה של חרו지를 פלואורסצנטיים יתווסף לכל אחד מהבאערים. יש ליצור עקומת תגובה למינון עבור כל נוגדן בקרה על ידי הוספת ריכוזים משתנים של הנוגדנים הנבדקים בנפחים שאינם עולים על 20 µL לכל באער.כעת דגרו את דגימות החרוזים והנוגדנים למשך שעתיים ב-37 °C כדי לאפשר לנוגדנים להיקשר לחרוזים ממש לפני סיום תהליך הכנת החרוזים. דללו דגימה של תאי THP-1 בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים למילליליטר במצע גידול. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL מהתאים לכל דגימה.לבסוף, דגרו את התאים עם החרוזים המצופים בנוגדנים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide באינקובטור סטטי, כדי לאפשר לתאים ולחרוזים לשקוע באמצעות כוח הכבידה. למחרת, הסירו 100 µL של נוזל על (supernatant) מכל באער, תוך הקפדה לא להפריע למשקע התאים. קבעו את התאים ב-100 µL של 4% paraformaldehyde, ולאחר מכן השתמשו בפיפט כדי לתלה מחדש ולערבב את התאים.כעת העמיסו את הפלטה לקורא הפלטות של ה-HTS בציטומטר זרימה בעל תפוקה גבוהה, המאפשר איסוף נתונים אוטומטי. עוצמת הפלואורסצנציה של תא HTHP בודד נלכדת ונרשמת. עוצמת פלואורסצנציה זו משמשת לאחר מכן לקביעת מספר החרו지를 שעברו פגוציטוזה על ידי כל תא, מה שמגדיר את הפעילות הפגוציטית של דגימת הנוגדן הנבדקת.צריכה להיות הבחנה ברורה בין דגימות נוגדנים מנבדקים מושפעים לנבדקים שאינם מושפעים. באיור זה, היסטוגרמות העובדות של דגימת נוגדנים מנבדק שלילי ל-HIV המיוצגת על ידי העקבה השחורה, ומנבדק חיובי ל-HIV המיוצגת על ידי העקבה האפורה, מדגימות את הפגוציטוזה המוגברת המונעת על ידי נוכחותם של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן.הרגישות האופטימלית של בדיקה זו תלויה ברוויית החרו지를 באנטיגן ביוטינילי, כפי שניתן לראות כאן. נקבע כי ריכוז של 2 µg אנטיגן ל-µL חרוזים הוא ריכוז הרוויה עבור אנטיגן זה. עקומת תגובת המינון זו מדגימה את היכולת הדיפרנציאלית של דגימות נוגדנים מהנבדקים להשרות פגוציטוזה בטווח ריכוזי נוגדנים של 0.05 עד 5 µg/mL.פגוציטוזה דיפרנציאלית זו עשויה לנבוע מהבדלים בטר (titer) או מתכונות של דומיין ה-FC, כגון תת-סוג ה-IgG או מצב הגליקוזילציה. כאשר תאי TP one מדויקים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, קיימת ראיה ברורה לפגוציטוזה של חרוזים. תמונה סטטית זו של תאי TP one לאחר דגירה עם חרוזים שעברו אופסוניזציה על ידי נוגדנים בירוק וחרוזים שלא עברו אופסוניזציה באדום, מדגימה את היעדר הספיגה הפגוציטרית בהיעדר נוגדנים, שכן רק החרוזים הירוקים נבלעו על ידי תאי ה-TP one.בעת ביצוע מיקרוסקופיה של צילומי רצף (time-lapse microscopy), הספיגה הפגוציטית של חרוזי פלואורסצנציה באופן ספציפי לנוגדנים היא בולטת אף יותר. חרוזי הפלואורסצנציה הירוקים הנראים כאן הם בעלי יינון של נוגדנים. חרוזי הפלואורסצנציה האדומים משמשים כביקורת שלילית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות נוספות לתפקוד הנוגדנים על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע למאפייני תגובת הנוגדנים לזיהום או לחיסון.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו קובעים את הפעילות הפגוציטית של דגימות נוגדנים באמצעות ציטומטריית זרימה בעלת תפוקה גבוהה. זכרו כי עבודה עם דגימות דם ופלזמה קליניות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת מיגון אישי מתאים והקפדה על נהלי טיפול בטוחים בעת ביצוע פרוצדורה זו.

determining-the-phagocytic-activity-of-clinical-antibody-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הסרטון מראה בדיקת הרג אופסונופאגוציטית במבחנה באמצעות תרבית משותפת של נויטרופילים אנושיים עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. נוגדנים וחלבונים משלימים מאפשרים אופסוניזציה של החיידקים, ומאפשרים לנויטרופילים לזהות ולהרוג חיידקים, ומראים פעילות אופסונופאגוציטית מוצלחת של נויטרופילים.

הערכת פעילות הרג אופסונופאגוציטית נגד פתוגנים חיידקיים

סרטון זה מדגים בדיקת פאגוציטוזיס מבוססת ציטומטריה של זרימה הכוללת אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום מסומנים ואופסוניים על ידי מונוציטים. ציטומטריית זרימה מזהה פלואורסצנטיות במונוציטים, המאשרת את הזיהוי המוצלח של אריתרוציטים opsonized באמצעות phagocytosis.

בדיקה לכימות פגוציטוזה בתיווך נוגדנים של אריתרוציטים נגועים בטפילים

סרטון זה מציג בדיקת מונוציטים חד-שכבתית המשתמשת במונוציטים ראשוניים מדם היקפי כדי להעריך פגוציטוזה בתיווך קולטן Fcγ עם תאי דם אדומים מסוג פולי D נגד נוגדנים R2R2.

בדיקה לחקר פגוציטוזה מונעת קולטן Fcγ במונוציטים מונושכבות

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP) על ידי פגוציטים של חלב אם. מיקרוספרות עם תווית פלואורסצנטית מצומדות לקומפלקס נוגדנים אנטיגן, משולבות עם תרחיף תאים שבודד מחלב אם כדי לגרום לפאגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים על ידי לויקוציטים פגוציטים. עם תיוג התאים עם נוגדנים נגד אנטיגן לויקוציטים נפוץ (CD45), ציטומטריית זרימה משמשת למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות של לויקוציטים פגוציטיים חיוביים במיקרוספירה המציינת את רמת פעילות ADCP.

בדיקת מבחנה למדידת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים על ידי פגוציטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

pH פגוזומי משפיע על התבגרות הפגוזומים, ייצור מחמצן, הרג פגוזומי וכן הצגת אנטיגן. כאן אנו מתארים שיטה רציומטרית למדידת שינויי pH במהלך הזמן ובנקודת הקצה בפאגוזומים בודדים בפגוציטים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

בדיקת המונוציטים החד-שכבתית (MMA) היא בדיקה במבחנה המשתמשת במונוציטים ראשוניים מבודדים המתקבלים מדם מלא היקפי של יונקים כדי להעריך פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fcγ (FcγR).

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

אנו מתארים גישה של מולקולה אחת למדידות זיקה לאנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריה המונית (MP). הפרוטוקול מבוסס MP הוא מהיר, מדויק, משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ואינו דורש שינוי חלבון.

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

פיתחנו שיפורים ושיטות מעודכנות לבדיקת מונוציטים-חד-שכבתיים (MMA) הקיימת, שבה נעשה שימוש במקרופאגים כדי לעזור לחזות טוב יותר את הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים של כדוריות אדומות ברפואת עירוי ואימונולוגיה. בדיקה זו נקראת בדיקת מונוציטים-מקרופאגים (M-MA).

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

למדו לקבוע פעילות פגוציטית של נוגדנים ספציפיים לתאי חיסון בדגימות קליניות באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הערכה סטנדרטית ומהירה של תגובות חיסוניות מול מחלות שונות.

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

גלה סרטונים נוספים