Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

הדגמה זו שואפת לדמיין חלבונים מסומנים פלואורסצנטית בתאים חיים במטריקה תלת-ממדית. ראשית, ייצרו שלבי תאים יציבים המבטאים חלבונים מסומנים פלואורסצנטית. זרעו תאים אלה לתוך מטריקת קולגן תלת-ממדית, ולאחר מכן רכשו תמונות Time-lapse של תאים נודדים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי.

בסופו של דבר, התוצאות שופכות אור על לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים בתוך תאים נודדים באמצעות דימוי בזמן אמת (time-lapse imaging) וניתוח חלבונים פלואורסצנטיים (FP), ומאפשרות צפייה בדינמיקה ובלוקליזציה של חלבונים בתלת-ממד ובזמן אמת. גישה זו מציעה דרך אחת למתן מענה לשאלות יסוד בנוד-תאים. לדוגמה, כיצד מוסדרים מגעים דביקים על ידי חלבונים ציטופלזמיים?

וגם כיצד מגעים אלו מושפעים מעכבים ספציפיים. בתרבית בצלחת P 35, כאשר התאים נמצאים ב-80 עד 90% confluence, טרנספקט את התאים עם הפלסמיד הרלוונטי באמצעות lipo 2000 בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, העבר את התאים לאינקובטור.

ביום למחרת, פזרו את התאים לשתי צלחות פטרי P one 50 והדגירו למשך הלילה. חדושו את המצע כדי להוסיף 50 micrograms per milliliter של G four 18. המשיכו את התרבית תחת סלקציה של אנטיביוטיקה למשך שבועיים.

בחן את התרבית לאיתור מושבות העמידות ל-G four 18. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, זהה וסמן מושבות חיוביות ל-GFP.

שטפו את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר השטיפה השנייה, השאירו שכבה דקה של נוזל כדי למנוע מהתאים להתייבש בכל מושבה מסומנת. נגבו במידת האפשר קרוב ככל האפשר לשולי המושבה בעזרת מקל צמר גפן סטרילי, והעבירו בפיפטה 10 µL של trypsin אל תוך המושבה.

חזרו על הפעולה במהירות עבור כל מושבה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת ב-37 °C כדי להשיג ניתוק של התאים. ודאו שהתאים בעלי מראה עגול תחת המיקרוסקופ.

הוסף 10 µL של trypsin לכל מושבה, ובצע פיפטינג כדי לנתק את התאים מהצלחת באופן מלא. לאחר מכן, העבר כל מושבת תאים לבאר בודדת בצלחת תרבית של 24 בארות להגברה של מושבות יציבות. לאחר מכן, הערך את ביטוי החלבון של המושבות באמצעות western blot סטנדרטי ואימונופלורסצנציה.

הרחב את שינוי פני השטח של קווי תאים נבחרים על הזכוכית. תחתית הצלחת מאפשרת קישור קולגן אופטימלי. טפטף 300 µL של תמיסת סילולציה על חלק הזכוכית של כל צלחת P 35 עם פתח של 10 mm.

דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שאבו את התמיסה ושטפו במים מסוננים שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. הסירו את המים והניחו את הצלחות על פלטה מחממת בטמפרטורה של 50 °C למשך 1.5 שעות.

מקמו את מכסי הצלחות כך שיהיו מעט מורחקים מהצלחת כדי לאפשר ייבוש. לאחר שהצלחות היבשות התקררו, טפטפו 300 µL של תמיסת glutaraldehyde בריכוז 2% על החלק הזכוכיתי של כל צלחת. הדגירו למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו עם PBS 3 פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.

המשיכו לעקר את הצלחונות באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת. ראשית, השקיעו 100 µL של חלקיקי סמן פלואורסצנטיים על ידי סנטריפוגה. השליכו את הנוזל ותלו את החלקיקים מחדש ב-500 µL של מצע גידול.

בצעו חמישה שטיפות, ולאחר מכן השהו שוב את החלקיקים ב-30 µL של מצע גידול. לאחר מכן, אספו את התאים המבטאים GFP באמצעות trypsin והכינו תרחיף של 2 מיליון תאים למילליטר בתוך מבחנת epinephrine. פפטו 240 µL של מצע גידול. הוסיפו 12.6 µL של HEPES בריכוז 1 M, 20 µL של מים מסוננים, 50 µL של תמיסת תאים ו-10 µL של החלקיקים הפלואורסצנטיים.

לבסוף, הוסיפו 167 µL של קולגן מהדרמיס של בקר, תמיסה אחת, וערבבו את התמיסה ביסודיות. כעת העבירו 80 µL אל החלק הזכוכיתי של הצלחת הסיליקונית שהוכנה. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 50 דקות כדי לאפשר לג'ל להתפולימר.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות 2 mL של מצע גידול. המתינו עד שתא המיקרוסקופ יגיע לטמפרטורה יציבה של 37 °C והשלימו את מצע התאים. כדי לשמור על pH ניטרלי לצורך דימות ב-DIC, החליפו את מכסה הצלחת במכסה זכוכית עם פס דק של פאראפילם.

כסו את דופן הצלחת כדי למנוע התאדות עבור עדשת שקיעה בשמן. הניחו טיפה אחת של נוזל שקיעה במיקום העדשה. הניחו את הצלחת המכילה את ג'ל הקולגן עלבמת המיקרוסקופ כך שהצלחת תיבוא במגע עם נוזל השקיעה.

בצעו מיקוד לדגימה וחפשו תאים רלוונטיים לצילום כדי להפחית את סחף הבמה. המתינו כ-45 דקות להתייצבות הצלחית. לפני תחילת רכישת תמונות ממושכת, הגדירו את הפרמטרים של רכישת התמונות עבור ניסויי הוספת מעכבים.

הכינו מצע תרביות מועשר עם התרופה בריכוז העבודה הרצוי. חדשו את מצע התאים כדי לשמור על pH ניטרלי, אך אל תאטמו בעזרת perfil. העבירו את הדגימה למיקרוסקופ והמשיכו בדימות בזמן הטיפול בתרופה.

עצרו את התמונה, תפסו והסירו בזהירות את מכסה הצלחת מבלי להזיז את הצלחת עצמה. שאבו את המצע והעבירו בעזרת פיפטה את המצע המכיל את התרופה אל תוך הצלחת. לאחר מכן, החזירו בזהירות את המכסה.

הגדרת ה-frap העליונה משתנה בין מערכות שונות. לכן, יש לעיין בהוראות היצרן. ראשית, הגדירו את הפרמטרים עבור דימוי תאים חיים.

עבור פוטו-ביליץ' (photobleaching). יש לבחון פרמטרים אלה על תאי תרגול כדי להגיע להספק לייזר מספק להלבנה של האות הפלואורסצנטי ללא פגיעה בתא. לאחר מכן, התחל בצילום הדגימה תוך רכישת חמישה פריימים לפחות.

לאחר מכן, בצעו פוטו-בליצ' (photobleach) לאזור העניין. המשיכו בצילום לאורך זמן ההתאוששות. מדדו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של האזור שעבר פוטו-בליצ' לפני ואחרי התהליך לאורך זמן.

התאימו את עקומת ההתאוששות למשוואה מעריכית. השגיאו את הפרמטרים של זמן מחצית החיים והעוצמה הסופית מעקומת ההתאמה המעריכית. לאחר מכן, חשבו את הפракציה הניידת על ידי מציאת היחס בין עוצמות הפלואורסצנציה הסופית וההתחלתית.

תמונות תלת-ממדיות אלו של תאים חיים מראות תאי אפיתל בריאים המבטאים GFP actin. לאחר ארבעה ימי תרבית, תאים אלו יצרו ציסטה במטריצת קולגן תלת-ממדית. חלק מהתאים נדדו לאורך פני השטח של הציסטה, בעוד שאחרים נדדו בתוך חלל הציסטה.

עיוות המטריקס כתוצאה מכוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים נודדים, מנותח באמצעות תזוזתם של חלקיקי סמן המוטמעים במטריקס הסובב. השפעתו של עיכוב RO kinase על כוח המתיחה מוצגת כאן. תנועות חלקיקי הסמן מוצגות כתמונת היטל מקסימלי (maximum projection) של נקודות זמן שונות, כאשר כל נקודת זמן צבועה בצבע פסאודו.

לחלופין, התמונות של חלקיק סמן בודד מוצגות כמוןטאז' כדי להראות את תנועת חלקיק הסמן. עם הזמן, חלקיק סמן זה נע לעבר השפה האחורית של התא הנודד ומרחקה, לפני ואחרי הוספת Y 2 7 6 3 2 בהתאמה. ניתוח ה-frap עוקב אחר תאים המבטאים GFP actin בעודם נודדים במטריצה תלת-ממדית, מה שמעיד על התאוששות פלואורסצנציה טיפוסית לאחר ניסוי של הבהרה פוטו-כימית (photo bleaching) בהגדרות לייזר מותאמות; עוצמת הפלואורסצנציה של אזור העניין פוחתת באופן גלוי בהשוואה לרמת הרקע, תוך שמירה על תאים בריאים שאינם פגועים.

גרף זה מציג את התאמת עקומת ההתאוששות לפונקציה מעריכית. לאחר רכישת מיומנות, זריעת התאים במטריקס עשויה להימשך שעה אחת. אין לשכוח כי עבודה עם three amino propyl trimethyl עלולה להיות מסוכנת ביותר.

לכן, נקו adaptability נקישות בטיחות כמו עבודה במכסה כימית. כמו כן, זכרו לשמור על תנאי סטריליות בעת עבודה עם תאים במטריקס תלת-ממדי (3D matrix).