Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

הדגמה זו נועדה לדמות חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בתאים חיים במטריצה תלת מימדית. ראשית, ליצור קווי תאים יציבים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטית. זרעו תאים אלה למטריצת קולגן תלת מימדית, ולאחר מכן רכשו תמונות זמן-lapse של תאים נודדים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

בסופו של דבר, התוצאות מאירות לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים בתוך תאים נודדים באמצעות הדמיית זמן-lapse וניתוח FP, התבוננות בדינמיקה של חלבונים ולוקליזציה בתלת מימד ובזמן אמת. מציע דרך אחת להתייחס לשאלות יסוד בנדידת תאים. לדוגמה, כיצד מווסתים מגעי דבק על ידי חלבונים ציטופלזמיים?

וגם כיצד מגעים אלה מופרעים על ידי מעכבים ספציפיים. בתרבית צלחת P 35 תאי תרבית בשטף של 80 עד 90% מעבירים את התאים עם הפלסמיד המעניין באמצעות lipo 2000 לפי הוראות היצרן. לאחר מכן הניחו את התאים בחממה.

למחרת, חלקו את התאים לשתי צלחות P אחת 50 פטרי ודגרו למשך הלילה. חדש את המדיה כדי להוסיף 50 מיקרוגרם למיליליטר של G ארבע 18. המשך בתרבית תחת בחירת אנטיביוטיקה למשך שבועיים.

בחן את התרבית עבור מושבות עמידות G ארבע 18. ואז באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. זהה וסמן מושבות חיוביות ל- GFP.

שוטפים את התאים פעמיים עם PBS. לאחר הכביסה השנייה, השאירו שכבה דקה של נוזל כדי למנוע התייבשות של תאים עבור כל מושבה מסומנת. נגב קרוב ככל האפשר סביב הקצה בעזרת צמר גפן מעוקר ופיפטה 10 מיקרוליטר טריפסין על המושבה.

חזור על הפעולה במהירות עבור כל מושבה. לאחר מכן דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס לניתוק תאים. ודא את המראה העגול תחת מיקרוסקופ.

הוסף 10 מיקרוליטר טריפסין לכל מושבה, פיפטה כדי לנתק לחלוטין תאים מהצלחת. לאחר מכן העבירו כל מושבת תאים לבאר אחת של תרבית צלחת של 24 בארות כדי להגביר מושבות יציבות. לאחר מכן, העריכו את ביטוי החלבון של המושבות באמצעות כתם מערבי סטנדרטי ואימונופלואורסצנטי.

הרחב את קווי התאים שנבחרו שינוי פני השטח של הזכוכית. צלחת תחתונה מאפשרת כריכת קולגן אופטימלית. פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת סילויזציה על חלק הזכוכית של כל צלחת P 35 עם פתח של 10 מילימטר.

דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. שאפו את התמיסה ושטפו במים מסוננים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת. מוציאים את המים ומניחים כלים על פלטה חמה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.

מקם את צמרות הכלים מעט מהצלחת כדי לאפשר ייבוש. לאחר שהכלים היבשים התקררו פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת 2% גלוטרלדהיד על חלק הזכוכית של כל מנה. יש לדגור למשך שעה, ולאחר מכן לשטוף עם PB S3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת.

המשך לעקר כלים על ידי חשיפה לאור UV למשך שעה. גלולה ראשונה 100 מיקרוליטר של חלקיקי מעקב פלואורסצנטיים על ידי צנטריפוגה. השליכו את הנוזל והשעו מחדש חלקיקים ב-500 מיקרוליטר מדיה.

בצע חמש כביסות, ולאחר מכן השהה מחדש את החלקיקים ב -30 מיקרוליטר מדיה. לאחר מכן, קצרו את התאים המבטאים GFP באמצעות טריפסין והכינו תרחיף של 2 מיליון תאים למיליליטר לתוך צינור einor פיפטה 240 מיקרוליטר של מצע גידול. הוסף 12.6 מיקרוליטר של ערימה טוחנת אחת, 20 מיקרוליטר מים מסוננים, 50 מיקרוליטר תמיסת תאים ו -10 מיקרוליטר של חלקיקי הפלורסנט.

לבסוף, הוסף 167 מיקרוליטר של קולגן דרמיס בקר, תמיסה אחת לערבב היטב. כעת העבירו 80 מיקרוליטר לחלק הזכוכית של המנה המבודדת המוכנה. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות כדי שהג'ל יתפלמר.

לאחר מכן הוסף בזהירות שני מיליליטר של אמצעי גידול. לאזן את תא המיקרוסקופ לטמפרטורת מצב יציב של 37 מעלות צלזיוס לחדש את מדיום התא. כדי לשמור על pH ניטרלי להדמיית DIC החלף את החלק העליון של הכלי למשטח זכוכית עם רצועה דקה של פרפורם.

מכסים את צד המנה כדי למנוע אידוי למטרת טבילת שמן. הנח טיפה אחת של נוזל טבילה על מיקום המטרה. ג'ל הקולגן המכיל את המנה בשלב המיקרוסקופ כך שהמנה יוצרת מגע עם נוזל הטבילה.

מקד את הדגימה וחפש תאים מעניינים לתמונה כדי למזער את סחף השלב. מניחים לתבשיל להתיישב כ- 45 דקות. לפני שתתחיל בצילום ארוך, ציין את הפרמטרים של רכישת תמונה לניסויי הוספת מעכבים.

הכן מדיה משלימה עם תרופה בריכוז עבודה רצוי. יש לחדש את מצע התא כדי לשמור על pH ניטרלי, אך אין לאטום עם פילינג. העבירו את הדגימה למיקרוסקופ והמשיכו בהדמיה בזמן הטיפול התרופתי.

השהה את התמונה, צלם והסר בזהירות את החלק העליון של המנה מבלי להפריע למנה. שאפו את המדיה והכניסו את התרופה המכילה את המדיה לתוך הצלחת. ואז החלף בזהירות את המנה.

הגדרת ה- frap העליונה משתנה בין המערכות. אז עיין בהוראות היצרן. תחילה קבע פרמטרים להדמיית תאים חיים.

להלבנת תמונות. בדוק את הפרמטרים הללו על תאי תרגול כדי להשיג עוצמת לייזר מספקת כדי להלבין את האות הפלואורסצנטי מבלי לפגוע בתא. לאחר מכן, התחל ללכוד תמונה על דגימה שנרכשת לפחות חמש פריימים.

ואז פוטו-אקונומיקה את האזור המבוקש. המשך לצלם לאורך זמן ההתאוששות. מדוד את עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של האזור המולבן לפני ואחרי פוטוהלבנה לאורך זמן, באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי.

התאם את עקומת השחזור למשוואה המעריכית. השג את הפרמטרים עבור עוצמת המחצית והסופית מעקומת ההתאמה האקספוננציאלית. לאחר מכן חשב את השבר הנייד על ידי לקיחת היחס בין עוצמת הקרינה הסופית לראשונית.

תמונות תאים חיים תלת-ממדיות אלה מציגות תאי אפיתל בריאים המבטאים אקטין GFP. לאחר ארבעה ימים של תרבית, תאים אלה יצרו ציסטה במטריצת קולגן תלת מימדית. חלק מהתאים נדדו לאורך פני הציסטה בעוד שאחרים נדדו בתוך החלק הפנימי של הציסטה.

עיוות מטריצה כתוצאה מכוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים נודדים, מנותח באמצעות תזוזה של חלקיקי עוקב המוטבעים במטריצה שמסביב. ההשפעה של עיכוב RO קינאז על כוח המתיחה מוצגת כאן. תנועות חלקיקי העוקב מוצגות כתמונת הקרנה מקסימלית של נקודות זמן שונות וכל נקודת זמן היא פסאודו-צבעונית.

לחלופין, התמונות של חלקיק עוקב בודד מוצגות כמונטאז' כדי להראות את התנועה של חלקיק העוקב. עם הזמן, חלקיק העוקב הזה נע לכיוון והרחק מהקצה הנגרר של התא הנודד לפני ואחרי התוספת של Y 2 7 6 3 2 בהתאמה. ניתוח ה-frap עוקב אחר תאים המבטאים אקטין GFP כשהם נודדים במטריצה תלת מימדית המצביעה על התאוששות פלואורסצנטית טיפוסית לאחר ניסוי הלבנת פוטו בהגדרות לייזר אופטימליות, עוצמת הקרינה של אזור העניין פוחתת באופן ניכר בהשוואה לרמת הרקע תוך שמירה על תאים בריאים ולא פגומים.

גרף זה מציג את ההתאמה של עקומת ההתאוששות לפונקציה מעריכית. לאחר השליטה, זריעת התאים במטריצה יכולה להימשך שעה. אל תשכח שעבודה עם שלושה אמינו פרופיל טרימתיל יכולה להיות מסוכנת ביותר.

אז נקוט באמצעי זהירות כמו עבודה במכסה המנוע הכימי. זכור גם לשמור על תנאים סטריליים בעת עבודה עם תאים במטריצה תלת מימדית.