Name: יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: חקור שחזור יחידת מנוע פונקציונלית בתרבית משותפת של תאי שריר אנושיים עם נתחי חוט שדרה מעוברי חולדה. שיטה זו מאפשרת עיצוב שריר ומחקר תהליכי עצבוב בתאי שריר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה שלנו נתמך על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNF), יוזמת שווייץ Systems Biology (SystemsX.ch), ניוון שרירים האגודה ארה&quot;ב (MDA), את Francaise האגודה contre לס Myopathies (AFM), מיטוכונדריאלי הברית מחלות קרן (UMDF), Gebert-רוף קרן תכנית מחלות נדירות (פוי), החברה השוויצרית למחקר של מחלות שריר (SSEM / FSRMM), החיים השוויצרי &quot;Jubiläumsstiftung für und Volksgesundheit medizinische Forschung&quot;, מחקר רוש קרן האוניברסיטה באזל.

1. הכנת תרבית תאים ראשונית האדם שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תא תרבויות האדם שריר על פי טכניקה explantation מחדש, explantation 4. ראשית, להסיר רקמת השריר הלא מהתאים. לאחר מכן, להטביע 1 3 מ&quot;מ explants שרירים מקרש של פלזמה, אשר מאפשר fibroblasts לצאת מן explants את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants המוטבע מועברים על גבי צלחת פלזמה ג&#39;לטין מצופה ולתת להם לגדול במצע גידול רגיל (MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 10% עוברית שור בסרום [FBS], 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין, 10 ng / ml גדילה אנושי גורם אפידרמיס [EGF], 12.5 ng / ml הגורם האנושי גידול פיברובלסטים [FGF]) בשכבה. התאים העולות explants בתנאים האלה לתאי שריר. תאים אלה ימשיכו לגדול בשכבה לאחר הסרת explants את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים aneurally על 0.1 ג&#39;לטין מצופים צלחות% במצע הגידול הרגיל. התאים יכולים להיותבתרבית aneurally ו מוגבר לפי הצורך. עדיף להשתמש בתאי שריר במעבר בין 3 ל 8 כדי לבצע את שיתוף תרבויות. זה קריטי כדי innervate myotubes צעירים, לאחר מועד זה, שותף תרבויות יש סיכון גבוה של אי. יתר על כן, myotubes לא צריך להיות גדול מדי, סמיך מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני העצבוב מתוכנן, צלחת לתאי השריר על 35 מ&quot;מ תרבות מנות רקמות (או 6 צלחות גם) בצפיפות של 500,000 תאים לכל צלחת במצע גידול רגיל. בצפיפות זה, התאים נמצאים confluency הנכון כדי להפעיל את היתוך למחרת, ואת העצבוב לאחר יום לאחר מכן. שימוש באותם תנאים, myotubes הם בשלב הנכון העצבוב אופטימלית התכווצות סיב לאחר מכן ומכאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מדיום הגידול הרגיל עם המדיום היתוך מורכב MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 5% FBS, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין 1% של פניצילין / סטרפטומיצין. </li></ol> 2. Isolati<html> על של Explants עובריים עכברוש טבורי עמוד השדרה ההליך כולו על מנת לבודד את explants בעמוד השדרה מתבצע תחת מיקרוסקופ דו עינית, על תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, Gibco / Invitrogen נ&quot;צ 14170) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני כי עוברי עכברים הם בין ED 13 ו - 14 כשלב התפתחות שונה היה לסכן את כל התהליך. להקריב את האישה ההרה עם CO 2 ולאסוף את שרשרת העובר שלם בינוני HBSS. לבודד את כל העובר ואת לערוף להם המתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חוט השדרה העובר משאר הגוף בריא ושלם ולהסיר השריר שמסביב רקמת חיבור. להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הגב ganglions שורש (DRGs) המחוברים בחוט השדרה על מנת להבטיח עצבוב פונקציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל פרוסה חוט השדרה transversally באופן explant מכיל לפחות 2 DRG קשור אליו (explants של 1 מ&quot;מ 3). </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3. העצבוב של אדם לתאי שריר עם עובריים Explants עכברוש חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני היתוך לתרבות תא שריר, משאיר שכבה דקה של המדיום על monolayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את explants בזהירות על שכבת השריר התא, חמש explants במרווחים קבועים זה מזה בכל צלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לאט לאט, טיפה בינוני חכם, היתוך explant על כל אחד. יש צורך להוסיף בינונית לתאי השריר כדי לשרוד, אבל לא יותר מדי כדי לאפשר את explants לדבוק הראשון ליצור קשר עם התאים. אם המדיום הוא לא הוסיף כראוי (יותר מדי חזק או בינוני יותר מדי), explants את יצוף ויהיה אינם innervate לתאי השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants מתחילים לדבוק, למעלה בינוני היתוך 2 מ&quot;ל לכל צלחת 35 מ&quot;מ, ולשים את הכלים בזהירות רבה לתוך אינקובטור. </li></ol> 4. תחזוקה של עצבים שרירים Heterologous שיתופי תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום היתוך פעמיים בשבוע. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. נציג תוצאות ברגע יומיים לאחר עצבוב, ניתן לראות את neurites העולה מתוך explant כל קשרים עם לתאי השריר, המיוצגים על ידי כפתור כמו מבנים (איור 1). כבר 4-6 ימים לאחר עצבוב, כמה סיבים בודדים יתחיל להתכווץ. הצירים להימשך חודשים רבים, שמר פשוט על ידי שינוי תרבות בינונית פעמיים בשבוע. אחרי בערך 2 שבועות, explant חוט השדרה עצמו מתנוון, אבל העצבוב נשמרת. זה נורמלי. שכבה דקה של מרכיב העצב נשאר על פני השטח של שכבת תא השריר. זו רשת העצבים מספיק כדי לשמור את הפונקציונליות של יחידת המנוע. אם explants צפים במדיום יום לאחר עצבוב, הם לעולם לא תדבק. זה קורה כאשר שכבת תא שריר הואלא confluent מספיק, או כאשר אמצעי נוסף גם פחות או יותר. לפעמים, את שומרת explant אבל לא neurites תצא. סביר להניח עקב חוסר של DRG המצורפת אליו. במקרה זה, כמו גם, עצבוב לא יוקם. לתפעל את הכלים בזהירות רבה בשבוע הראשון, כמו explants את עדיין יכולה לנתק בקלות. להחליף את המדיה היתוך, מוסיפים את הנוזל ירידה מבחינת במהירות מינימלית, כדי למנוע ניתוק התא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> באיור 1. חוט השדרה, שרירים explants תא שיתוף תרבויות מיום 1 עד יום 15.

<ol><li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li>
<li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord%3A+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li>
<li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li>
<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
<li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li>
<li>Lefebvre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+spinal+muscular+atrophy-determining+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.</a> Cell. 80, 155-165 (1995).</li>
<li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene%2C+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy%2C+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li>
<li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+%28SMN2%29+rescues+embryonic+lethality+in+Smn%28-%2F-%29+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li>
<li>Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+mouse+models+to+understanding+the+pathogenesis+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy.</a> Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).</li>
<li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex%3A+an+overview+of+current+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Standard+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li>
<li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li>
<li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li>
<li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically%3A+relevance+to+inclusion-body+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

כלי במבחנה פיזיולוגי ללמוד התא תפקוד השרירים בהקשר רגיל וגם בזמן מחלה מעניין הגבוה ביותר myologists, כי התא תרבויות שרירים בדרך כלל לא לשחזר את החשיבות של מספר תאים ותא מסוג חיבורים. תוספת של מטוהרים הנוירונים המוטוריים לתאי השריר אינה מספיקה כדי להשיג את יחידת המנוע תפקודית מאז נוכחות של תאים שוואן נדרש העצבוב להיות יעיל 5 וזה לא טופולוגית (הפצה 3D + מיוחד) רלוונטי פרוטוקול המתוארת כאן שימש בהצלחה להקים לתאי השריר מעוצבבים במבחנה תוצאות ההתבגרות NMJ מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31095 </td></tr><tr><td> בינוני 199 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31153 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> שיבוט עוברי Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> סיגמא </td><td> I9278 </td></tr><tr><td> האדם EGF </td><td> סיגמא </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> אדם FGF </td><td> סיGMA </td><td> F0291 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין פתרון </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות explants חוט השדרה לתאי השריר

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

אדם לתאי שריר ראשוניים בתרבית aneurally בשכבה כמעט באופן ספונטני, כי החוזה, בהעדר מרכיב העצב, התמיינות תאים מוגבל גירוי נוירון מוטורי חסר 1. מגבלות אלה לעכב את המחקר במבחנה ב neuromuscular של מחלות רבות בתאי שריר בתרבית. חשוב לציין, מגבלות הניסוי של תאים בתרבית monolayered שרירים ניתן להתגבר על ידי עצבוב התפקודי של myofibers עם explants בעמוד השדרה של שיתוף תרבויות. כאן, אנו מציגים את השלבים השונים הנדרשים על מנת להשיג העצבוב יעיל, תקין של אדם לתאי שריר ראשוניים, המוביל להשלים את התכווצות בידול וסיבים לפי השיטה שפותחה על ידי Askanas 2. כדי לעשות זאת, תא שריר שיתוף תרבותי עם explants בעמוד השדרה של עוברי עכברים בבית ED 13.5, עם הגרעינים השורש הגבי מחוברת עדיין את פרוסות בעמוד השדרה. אחרי כמה ימים, שרירים Fibers להתחיל להתכווץ בסופו של דבר בין מפוספס דרך העצבוב על ידי neurites תפקודית מקרין מן explants בעמוד השדרה כי בהתחברות לתאי השריר. מבנה זה יכול להישמר במשך חודשים רבים, פשוט על ידי דיאלוג על בסיס קבוע בינוני התרבות. יישומים של כלי זה הן רבות שלא יסולא בפז, שכן היא מייצגת מודל פונקציונלי ניתוח רב תחומי של פיתוח שרירים העצבוב האדם. למעשה, שלמה דה נובו ההתקנה צומת neuromuscular מתרחשת בצלחת התרבות, המאפשר מדידה קלה של פרמטרים רבים בכל שלב, בהקשר יסודי פיזיולוגית. רק כדי להזכיר כמה דוגמאות, גנומית ו / או מחקרים proteomic יכול להתבצע ישירות על שיתוף תרבויות. יתר על כן, תופעות לפני ואחרי סינפטי ניתן להעריך במיוחד ובנפרד בצומת neuromuscular, כי שני הרכיבים מגיעים מינים שונים,עכברוש האדם, בהתאמה. עצב, שריר שיתוף תרבות יכולה גם להתבצע עם אדם לתאי שריר מבודד לחולים הסובלים ממחלות שריר או neuromuscular 3, ולכן יכול לשמש ככלי מיון עבור תרופות המועמד. לבסוף, ציוד מיוחד, אך לא מתקן קבוע BSL2 צורך לשחזר יחידה תפקודית מוטורית בצלחת התרבות. שיטה זו ולכן הוא בעל ערך שריר הן, כמו גם בקהילות מחקר neuromuscular ללימודי פיזיולוגיות מכניסטית של הפונקציה neuromuscular, בהקשר הרגיל ומחלות.

בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים מעוצבבים<em&gt; In vivo</em&gt;. יחידת המנוע תפקודית ניתן לשחזר<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי עצבוב של האדם תאים הבדיל השריר העיקרי העובר באמצעות חולדה explants חוט השדרה. מאמר זה מתאר כיצד שיתוף תרבויות explants בעמוד השדרה ותאי שריר מבוססים.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

תאי שריר ראשוניים אנושיים שגודלו ללא עצבים בשכבה אחת מתכווצים לעיתים רחוקות באופן ספונטני כיוון שבשל היעדר רכיב עצבי, תאי...

המטרה הכללית של הליך זה היא לשחזר יחידה מוטורית תפקודית in vitro. דבר זה מושג על ידי גידול תאי שריר ראשוניים של בן אדם בשילוב עם נתחי רקמה (explants) מבודדים של חוט השדרה מעוברים של חולדה. לאחר מכן, נתחי השתל של חוט השדרה מונחים לעצב את תאי השריר האנושיים בעוד ה-explan עדיין מחובר.מזינים את התרבית בזהירות במצע גידול עד שתאי השריר מבצעים דיפרנציאציה מלאה. לאחר מכן ניתן להעריך את הפנוטיפ המולקולרי ו/או התאי של תאי השריר המובחנים באמצעות מבחר של כלים מולקולריים. ההדגמה הוויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שראשית, קשה ללמוד כיצד לבודד את חוט השדרה.ומעל לכל, יש לנהוג בעדינות רבה בעת הוספת מצע התרבית לתאי השריר החדשניים. יש לבצע המתנסה של חולדה הרַיָּה עם עוברים שבין השלבים ED 12.5 ל-ED 13.5.היו מדויקים, שכן השלב קריטי לכל הפרוצדורה. בצעו דיסקציה של הרחם ואספו את כל שרשרת העוברים לתוך תמיסת HBSS עם 10%FBS תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי; בדלו כל עובר ובצעו לו דקפיטציה. בדלו את חוט השדרה כיחידה אחת והסירו את השרירים ורקמת החיבור שמסביב.כדי לעשות זאת, קבעו תחילה את העוברים באמצעות מיקרו-מספריים. גזרו קו בכל צד של חוט השדרה וקלפו בזהירות את העור. לאחר מכן, הניחו את העובר על צדו ובודדו בזהירות את חוט השדרה כאשר הגנגליון של השורש האחורי (DRG) עדיין מחובר אליו.עצבוב תפקודי לא יתרחש אם ה-DRGs לא יישארו מחוברים לחוט השדרה. חוט השדרה בהיר יותר מרקמת החיבור והשרירים הוורודים שסביבו. הסר בזהירות את הרקמות שסביבו מבלי להפריע ל-DRGs.לאחר הבידוד, השתמשו במחט של מיקרו-מזרק כדי לחתוך כל חוט שדרה באופן רוחבי לקוביות שבהן מחוברים לפחות שניים מganglia של השורש האחורי (DRGs). קוביות אלו יהיו בנפח של כמילימטר מעוקב והן מוכנות כעת לתרבית משותפת (co-culture) עם תרבית סטנדרטית של תאי שריר אנושיים. פרוטוקול זה דורש גידול של תאי שריר אנושיים מדגימות ביופסיה של רקמה.עיין בפרוטוקול הכתוב לקבלת פרטים על הליך זה. התחל בהסרת מצע ההיתוך מתרבית תאי השריר, תוך השארת שכבה דקה של מצע על השכבה החד-שכבתית (monolayer). לאחר מכן, הנח בזהירות את ה-x explan על תאי השריר.ניתן להניח חמישה אקספלנטים של X במרווחים שווים על כל צלחת בקוטר 35 מילימטר. הוסיפו לאט את מצע ההיתוך על כל אקספלנט של x בטיפות. אין להוסיף את מצע ההיתוך במהירות רבה מדי או בנפח גדול מדי.אחרת, רגמי ה-x יצופו ולא יצליחו לעצב את תאי השריר. לאחר מכן, החזירו בזהירות רבה את הצלחות לדגירה. המשיכו להוסיף את המצע באיטיות.בטיפול זהיר, x אקספלנטים יפסיקו לצוף במצע ויידבקו לתאים תוך כשעה. לאחר ההידבקות, הגדילו את נפח מצע ההיתוך לשני מיליליטר למנה של 35 מילימטר. אם לאחר המתנה של לילה, ה-X אקספלנטים עדיין צפים במצע, הרי שייתכן ששכבת תאי השריר לא הייתה קונפלואנטית מספיק או שהמצע הוסף בצורה שגויה.שתיים, בקירוב. אלו ה-X explan לעולם לא יידבקו פעמיים בשבוע. החליפו את כל מצע ההיתוך בטיפות, באיטיות רבה, כדי למנוע התנתקות של תאים.ה-X explan שבירים למדי במהלך השבוע הראשון ויכולים להינתק בקלות. זוהי טכניקה טובה מאוד מכיוון שלאחר החידוש, רק באמצעות מדידה או איסוף של מצע התרבית, ניתן למדוד את ה-ome של תרביות השיתוף. ואם תבחרו בזהירות את הכלים המולקולריים, תוכלו להבדיל בין מה שמגיע מהשריר לבין מה שמגיע מהעצב.יומיים לאחר שהניוריטים של העצבון בקעו מכל דגימה (explan) ויצרו מגעים עם תאי השריר המיוצגים על ידי מבנים דמויי כפתור. כאשר ניוריטים אינם בקעים, העצוב יכשל, ככל הנראה בשל חוסר בהיצמדות של ה-DRG. כבר ארבעה עד שישה ימים לאחר העצוב, סיבים בודדים החלו להתכווץ.ההתכווצויות נמשכו חודשים רבים, והושגו פשוט על ידי החלפת מצע התרבית פעמיים בשבוע. לאחר כשבועיים, כצפוי, השתבשו עצמם שתולי חוט השדרה, אך העצבויות נשמרו. שכבה דקה של מרכיבי עצב נותרה על פני השטח של שכבת תאי השריר, ורשת עצבית זו הספיקה כדי לשמר את התפקוד של היחידה המוטורית.אחד היתרונות הגדולים של טכניקה זו הוא האפשרות לדגום דגימות ממטופלים למדידה או להשוואה של הפנוטיפ של תרביות השיתוף (co-cultures) בין קבוצת הביקורת לדגימת המטופל. בהמשך להליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות קלאסיות שגרתיות כמו real time PCR, Western blot ואימונוהיסטוכימיה, ובכך ניתן לחקור בפועל את הפנוטיפ השרירי או העצבי של תרביות השיתוף.

a-functional-motor-unit-culture-dish-co-culture-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

אנו מתארים שיטה ליצירת יחידות מוטוריות אנושיות במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית על ידי שיתוף פולחן נוירונים מוטוריים המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים עם מיוטיובים ראשוניים אנושיים וכתוצאה מכך היווצרות של צמתים עצביים שריריים פעילים מבחינה תפקודית.

ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

חקור שחזור יחידת מנוע פונקציונלית בתרבית משותפת של תאי שריר אנושיים עם נתחי חוט שדרה מעוברי חולדה. שיטה זו מאפשרת עיצוב שריר ומחקר תהליכי עצבוב בתאי שריר.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

גלה סרטונים נוספים