Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome
6 בפברואר 2012
הקרינה רומן באתרו ההכלאה (דגים) שיטה כי במקביל בוחנת שינויים כרומוזום הן מספריים ומבניים, בעיקר טרנסלוקציות כרומוזומליות ספציפיות הקשורות לוקמיה ולימפומה, של כל 24 הכרומוזומים האנושיים במכשיר אחד הכלאה 1, מתואר.
בדיקת דג אוקטה כרום בוחנת בו זמנית את כל 24 הכרומוזומים האנושיים בהכלאה אחת בשקופית אחת. ראשית, הכינו כפולות מטאפאזה בשקופית הספציפית של שמונה ריבועים. לאחר מכן בצע סריקה אוטומטית של שקופית הדגימה כדי להקל על המיקום של כל שלבי המטא והערכה מחדש עתידית של כל תמונות התא.
המיקום הבא, שמונה הריבועים מחליקים מעל מכשיר הכרום אוקטה ומכליאים את הבדיקות. התוצאות המתקבלות יכולות להראות שלושה כרומוזומים שלמים צבועים שונים בכל ריבוע בהתבסס על סידור שילובי הכרומוזומים במכשיר ה- RO. הרעיון לשיטת RO FISH היה לי לראשונה כשהתחלתי ליישם דגים במחקרי אוכלוסייה אנושית בתחילת שנות ה-90.
ואז הצגתי את הרעיון שלי לציור בשלושה צבעים, שמונה שקופיות מרובעות כדי להגדיר את התא בכנס השנתי של A A CR ב-1994. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כיפוף כרומוזומים קלאסי ואב טיפוס ספקטרלי מודרני הוא שהיא יכולה לנתח בקלות את כל 24 הכרומוזומים האנושיים במספר גדול יותר של תאים. התחל בהכנה של תאי מטאפאזה קבועים בתרחיף כפיפטה בקרה של תאים על שקופית וודא צפיפות מתאימה.
כעת טובלים בשמונה כרום OC מרובע, מחליקים לאתנול טהור למשך שתי דקות. ברצף של ריבועים מתחלפים, פזרו חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים על שקופית התבנית כדי למנוע מהתפשטות התאים להפריע זה לזה. יבש את הדגימות באוויר לפני שתאתר זוגות סמוכים.
מרחו 20 מיקרוליטר של 0.2 מיקרוגרם למיליליטר של כתם DAPI על מרכז כל מחצית של השקופית, והניחו פתק כיסוי. כעת, בצע סריקה אוטומטית של שקופית הדגימה כדי למקם את תאי המטאפאזה. השתמש בתוכנת metaverse כדי להקל על המיקום של כל שלבי המטא והערכה מחדש עתידית של כל תמונות התא.
הצג את תוצאות הסריקה באופן ידני ומחק תוצרים שאינם מטפאזה. ראשית, הסר את כתם ה-DPI בשני מאגרים XSSC, ולאחר מכן יבש את הדגימות באמצעות סדרה של שטיפות אתנול. יבש את המגלשה באוויר ולאחר מכן הניח אותה על צלחת קפיצה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
כעת יש לאזן את בדיקת הכרומה, תא ההכלאה הרב-בדיקתי ואת מאגר ההכלאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כשהתווית כלפי מטה. הנח את מכשיר הכרום OC על פלטה חשמלית של 37 מעלות צלזיוס. הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת הכלאה חמה מראש לכל אחד משמונת האזורים.
הפוך בזהירות וכוון את התבנית. החליקו מעל התקן כרום המהרה (OC). ודא ששקופית התבנית מיושרת למכשיר Octa Chrome.
לאחר מכן הורד בזהירות את השקופית על טיפות תמיסת ההכלאה והפעל לחץ אחיד עדין כדי לפזר את תמיסת ההכלאה לקצוות של כל אחד מהאזורים המוגבהים במכשיר הכרום OC. הרם בקצה החלבי של מגלשת הזכוכית והפוך כך שהמגלשה תהיה מתחת למכשיר כרום OC. מניחים על פלטה חמה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר מכן מעבירים אותו לפלטה חמה של 75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. כדי לפרק את הדגימות לשלב ההכלאה, העבירו לבדיקת כרומה, תא הכלאה מרובה בדיקות. החזר את המכסה וצף את החדר באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הסר את השקופית בזהירות מהמכשיר ושטוף ב-0.4 SC עודף ב-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. בצע את הכביסה השנייה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. המשך להוסיף 20 מיקרוליטר DPI למרכז כל מחצית של השקופית ומקם פתק כיסוי.
דגרו את הדגימות בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצפייה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקת דג הכרום של אוקטה מאפשרת בדיקה סימולטנית של כל 24 הכרומוזומים האנושיים באמצעות הכלאה אחת בשקופית אחת. כל ריבוע נושא שלוש בדיקות שונות לציור כרומוזומים שלמים המסומנות ישירות בפלואורו בצבעים שונים.
בדיקה של תא מטפאזה תקין בריבוע שתיים של מערכת Octa CHRO מראה כי כרומוזומים 8, 21 ו-12 צבועים באדום, ירוק וכחול. ניתן להמחיש אותם בנפרד באמצעות מסננים מתאימים או להמחיש אותם בו-זמנית באמצעות מסנן משולש DAPI Fitzy, Texas Red. לגישת כרומוזומים זו יש תועלת באיתור תאים חריגים עם כרומוזומליה ספציפית ללוקמיה, טרנסלוקציה ואנופלואידיה.
לדוגמה, T 8 21 הוא טרנסלוקציה כרומוזומלית שכיחה בלוקמיה מיאלואידית חריפה. טריזומיה 21 3 עותקים של כרומוזום 21 היא אנופלואידיה שכיחה בלוקמיה לאחר ההתפתחות. טכניקה זו סללה את הדרך למדענים בתחום הציטוגנטיקה המולקולרית והאפידמיולוגיה המולקולרית לחקור את הסידורים הכרומוזומליים הנפוצים ביותר שהתגלו בלוקמיה ובלימפומה, ולבחון פלואידיה סלקטיבית בין כל הכרומוזומים האנושיים בחולים קליניים או באוכלוסיות שנחשפו לכימיקלים רעילים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחון בו זמנית את כל 24 הכרומוזומים האנושיים בהכלאה אחת בשקופית אחת על ידי בדיקת דג כרום אוקטו. ואנחנו מגדירים את זה ככרומוזומים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר שיטת מיזוג in situ פלואורסצנטית (FISH) חדשה הידועה כ- Octa Chrome Fish assay. היא מאפשרת בדיקה בו-זמנית של כל 24 הכרומוזומים האנושיים בהמיזוג יחיד על שקופית אחת, תוך התמקדות בשינויים כרומוזומליים הקשורים ללוקמיה וללימפומה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיזוג in situ פלואורסצנטי (FISH)
- ניתוח כרומוזומלי
- אונקולוגיה
רקע
- FISH היא טכניקה המשמשת לזיהוי וללוקליזציה של נוכחות או היעדר רצפי DNA ספציפיים על כרומוזומים.
- טרנסלוקציות כרומוזומליות חשובות במחקר על לוקמיה ולימפומה.
- השיטה מאפשרת ניתוח מקיף של שינויים כרומוזומליים.
- שיטות קודמות דרשו המיזוגים מרובים, מה שהופך את הגישה הזו ליעילה יותר.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה שמפשטת את זיהוי חריגות כרומוזומליות.
- לשפר את היעילות של ניתוח כרומוזומלי במסגרות קליניות.
- לספק כלי להבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי של ממאירות המטולוגיות.
שיטות ששימשו
- הכנת מריחות מטאפאזה על שקופית מיוחדת בת שמונה ריבועים.
- סריקה אוטומטית של השקופית כדי לאתר מטאפאזות לניתוח.
- המיזוג של בדיקות באמצעות המכשיר Octa Chrome.
- ויזואליזציה של תוצאות המראות כרומוזומים שלמים צבועים שונים על פי סידורים.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מצליחה לדמות את כל 24 הכרומוזומים בהמיזוג יחיד.
- התוצאות יכולות להציג שלושה כרומוזומים צבועים שונים בכל ריבוע של השקופית.
- מאפשרת הערכה מחדש של תמונות תאים לניתוח מקיף.
- מדגים פוטנציאל ליישום בחקר אוכלוסיות אנושיות.
מסקנות
- הבדיקה Octa Chrome Fish מייצגת התקדמות משמעותית בשיטת FISH.
- שיטה זו יכולה לשפר את זיהוי חריגות כרומוזומליות בסרטן המטולוגי.
- היא מציעה גישה יעילה יותר לחוקרים ורופאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The OctoChrome-FISH assay enables simultaneous detection of numerical and structural chromosomal alterations across all 24 human chromosomes in a single hybridization, addressing a key bottleneck in cytogenetic analysis for hematological malignancies. By consolidating whole-genome screening into one slide-based workflow, it enhances throughput and reproducibility in leukemia and lymphoma research, supporting early target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. This capability improves predictive confidence in identifying translocation-driven oncogenes and aneuploidy patterns relevant to benzene-induced leukemogenesis and other toxicant exposures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing leukemia-specific translocations such as t(9;22), t(15;17), t(8;21), and t(14;18) in their native chromosomal context.
- Operational Value: Reduces need for multiple sequential FISH hybridizations, conserving samples and accelerating target confirmation in discovery biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing concurrent assessment of structural rearrangements and genome-wide aneuploidy, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromosomal systems for downstream screening by establishing baseline karyotypes and detecting background alteration rates in exposed populations.
- Operational Value: Standardizes cytogenetic readouts through consistent probe labeling and slide architecture, enhancing reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Scalability Value: Enables high-content analysis of metaphase spreads via automated scanning, facilitating reevaluation and longitudinal tracking of chromosomal stability in longitudinal toxicology studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing direct comparison of chromosomal alterations in cell models, patient samples, and population cohorts exposed to leukemogens like benzene.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed aneuploidies or translocations are random events or exposure-linked patterns, informing risk assessment in translational biomarker development.
- Continuity Value: Supports seamless transition from in vitro findings to in vivo relevance by maintaining chromosomal resolution across model systems and human specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling chromosomal analysis at early hypothesis testing stages and supporting lead identification through mechanistic de-risking of genomic instability.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of chromosomal mechanisms in leukemogenesis by allowing simultaneous screening for multiple known and novel alterations across the genome.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs (e.g., translocation frequency, aneuploidy rates) that allow comparison of compound or exposure effects across conditions.
- Analytics: Generates multiplexed fluorescence readouts compatible with automated imaging and software-assisted karyotyping, enabling objective comparison of chromosomal states.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human relevance by detecting identical chromosomal patterns in population studies, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable cytogenetic platform applicable across oncology, toxicology, and pharmacogenomics programs requiring chromosomal integrity assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through comprehensive chromosomal coverage.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility via standardized probe sets and slide format, minimizing inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by reducing reagent consumption and hands-on time compared to sequential FISH or SKY approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by providing early evidence of genomic stability or instability in lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cytogenetic preparation for accurate metaphase spread generation and signal interpretation.
- Dependent on access to the OctoChrome device and compatible hybridization chambers for multi-probe simultaneous delivery.
- Necessitates standardization of slide handling, denaturation, and washing protocols to ensure consistent probe penetration and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to non-human model systems may require revalidation of probe specificity and chromosomal painting efficiency.
- Practical limitations include reliance on metaphase-quality samples and potential signal overlap in highly rearranged genomes, requiring careful spectral unmixing.
